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1、琼脂糖凝胶电泳检测DNA,丁新伦 13067206406,【一】背景知识,凝胶电泳是分离和纯化DNA片段最常用的技术；分离、鉴定和提纯核酸首选的标准方法。根据制备凝胶的材料:琼脂糖电泳凝胶电泳 聚丙烯酰胺电泳,【二】实验目的,学习琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法检测碱裂解法提取质粒的结果检测双酶切法鉴定重组质粒的结果检测PCR法鉴定重组质粒的结果,【三】实验原理,（1）某物质在电场作用下的迁移速度叫做电泳的速率，电泳的速率与核酸分子大小和构型有关。DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。分子质量越小跑得越快，紧密构型快于松散型开环分子或线性分子，从而可以分离大小不同的
2、DNA或RNA分子。,（2）琼脂糖是一种线性多糖聚合物，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。,配制多大浓度的琼脂糖凝胶，要根据被检的DNA分子大小来确定。,（3）溴化乙锭为扁平状分子，在紫外光照射下发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物，其荧光强度与DNA的含量成正比。据此可判断DNA分子量大小和粗略估计样品DNA浓度。,琼脂糖是一种线性多糖聚合物。浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。,【四】仪器、材料与试剂,质粒样品、酶切样品和PCR样品。凝胶电泳系统和电泳图像分析系统(凝胶成像系统)等。琼脂糖、1XTBE电泳缓冲液、
3、溴化乙锭、6X载样缓冲液（6X loading buffer）和DNA分子量标准（Lambda DNA/EcoRI+HindIII Marker）等。,凝胶电泳系统,DYY-6C型 双稳定时电泳仪电源（北京六一）输出范围（显示分辨率）：6-600V(1V)4-400mA(1mA)240W,美国Bio-rad伯乐 小型水平电泳槽Mini-Sub Cell GT Cell,凝胶成像分析系统,Lambda DNA/EcoRI+HindIII Marker（Ferments）,一个已知分子质量的DNA样品做最对照，用来确定待测样品的相对分子质量。,常用电泳缓冲液,电泳指示剂溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，
4、一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成上样缓冲液。作用：增加样品比重，以确保DNA均匀沉入加样孔内。形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置。使样品呈色，使加样操作更方便。,上样缓冲液,溴化乙锭,溴化乙锭（3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶溴盐EthidiumBromide，EB），EB染色（EB可很好地掺入到双链DNA中），在紫外光下会发出橙红色的荧光，用于对DNA进行染色和观察。用于观察的紫外光有种波长，一般使用中波紫外光（）。短波紫外光（）观察效果较好，但对DNA的破环很大。长波紫外光（）：回收。,EB染料优点：染色操作简便，快速，室温下15-20min；不会使核酸断裂；灵敏度高，
5、10ng或更少的DNA即可检出；可以加到样品中或胶中。EB是诱变剂，使用时一定要戴手套。EB废液要经过处理才能丢弃。SYBR:新型低毒，高灵敏度染料，加入样品中，价格较昂贵。,【五】实验步骤,制备琼脂糖凝胶（1%）制备凝胶板加样电泳 染色结果观察,（1）制备凝胶和胶板：45ml(1TBE)+0.4g琼脂糖（三角瓶），煮胶，溶解，冷却至60(不烫手)，倒板(4-6mm)，室温下充分凝固，竖直拔下梳子。胶板设计（44人）：每18孔胶板（5人X3样品+1marker），8胶板每8孔胶板（2人X3样品+1marker），2胶板,（2）加样：5l质粒DNA+1l loading buffer，混匀 15lPCR产物+3l loading buffer，混匀10l酶切产物+2l loading buffer，混匀 6lDNAMark（每板胶加一孔）（3）电泳：电压3-5V/cm，约80-90V，注意电极方向（4）染色：EB染色约15min（5）观察：紫外透射分析仪下观察。,【六】实验结果,
