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1、2013.10,重庆医科大学药理教研室:万敬员Email:jywan Tel:13629714392,蛋白质数据库与蛋白质分析,INTRODUCTION,生命物质过程,核酸,蛋白质,The Central Dogma,生物信息学（Bioinformatics）,是由生物学和信息科学交叉融合形成的。包含生物信息的获取、处理、存储、发布、分析和解释等各个方面，它综合运用数学、生物学、计算机、信息科学等诸多学科的理论方法及国际互联网，阐明和解释大量数据所包含的生物学意义。,http:/bioinformatics.oxfordjournals.org/,数据库（DataBase）检索工具(Retri
2、eve Tool)分析软件(Analysis Software),Nucleic Acids Research杂志每年的第一期中详细介绍最新版本的各种数据库。到2013年共有1512个数据库。http:/nar.oxfordjournals.org,生物信息学的重要组成：,利用在线工具和离线工具分析功能和结构www.bio-,国际生物信息研究的主要机构,1.美国国家生物技术信息中心,National Center for Biotechnology Information，NCBIhttp:/www.ncbi.nlm.nih.gov/GenBank和Pubmed等公共数据库美国国家医学图书馆(
3、NLM)的一部分(该图书馆是美国国家卫生研究所NIH的一部分).(美洲)工具：Entrez BLAST,2.欧洲生物信息学研究所,European Bioinformatics Institute，EBIhttp:/www.ebi.ac.uk/European Molecular Biology Laboratory（EMBL）数据库等。1992年由欧盟资助建立在英国的一个非盈利性学术机构，也是生物信息学研究与服务的欧洲中心。（欧洲）工具：SRS FASTA,3.日本国立遗传学研究所,National Institute of Genetics，NIGhttp:/www.nig.ac.jg/D
4、NA Data Bank of Japan（DDBJ）,日本DNA数据库是日本遗传学各方面研究的中心研究机构及生命科学所有领域的研究基地。（亚洲）工具：DBGET SEARCH KEGG,NIG建立的日本DNA数据库（DDBJ）、欧洲EBI维护的EMBL核酸序列数据库，以及美国NCBI的GenBank数据库，并列为国际上最著名的三大核酸数据库。,三大核酸数据库,4.瑞士生物信息研究所（Swiss Institute of Bioinformatics，SIB）数据库：SWISS-PROT5.美国国家生物医学基金会（National Biomedical Research Foundation,
5、NBRF）数据库：PIR6.布鲁克黑文国家实验室(Brookhaven national laboratory)数据库：PDB7.桑格研究所（Wellcome Trust Sanger Institute）数据库：PFAM,BIOINFORMATICS OF PROTEIN,一、重要的蛋白质数据库,蛋白质序列数据库蛋白质三维结构数据库蛋白质组数据库（二维凝胶电泳数据库）信号传导及蛋白质-蛋白质相互作用相关数据库蛋白质和DNA相互作用数据库,Protein Sequence Databases(Historical Order),National Biomedical Research Foun
6、dation(NBRF)=Protein Identification Resource(PIR)Margaret DayhoffAtlas of Protein SequencesPhylogenies,evolution,amino acid substitution matrices(PAM)and discovering active sites in enzymesPIR SF Evolutionary Family,iProClass Functional site analysis and ontologies,iProLink to literature UniProt-Uni
7、versal Protein ResourceSwissProt(EXPASY site)Amos BairochManual curation and annotationHighly cross-referencedMany useful analytical tools(EXPASY Tools)2D-PAGE and Mass Spectrometry databasesProsite functional motif databaseUniProt-Universal Protein ResourceTREMBLTranslation of mRNAs(RefSeq),UniGene
8、,open reading frames(ORFs)and predicted genes from genomesAutomatic annotationsEMBL=EBI Protein databasesClustersInterpro linked to domain and motif databases(CATH,PANTHER,PRINTs,PROSITE,pFAM,PIRSF,PRODOM,SCOP,SMART,SUPERFAMILY)Intron-exon structure and links to ORFs,coding regionsUniProt-Universal
9、Protein ResourceNCBI Protein DatabaseProtein and nrPRO database SwissProt,PIR and translated genes/genomesProtein Clusters Database(prokaryotic)and COGS and KOGSLinked to coding regions and intron/exon structureLinked to coding SNPs and variations databases Linked to MMDSB structure databaseLinked t
10、o 3D domainsLinked to CDD Conserved Domain DatabaseUCSC Proteome Browser,SWISS-PROT（瑞士日内瓦大学）蛋白质序列数据库 http:/www.Expasy.org Expert of Protein Analysis System（Expasy）包括序列及功能信息、蛋白识别、蛋白质结构预测及其他功能NCBI 蛋白质数据库 包括所有蛋白质序列，及其翻译产物序列 http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmedPIR（Protein Information Resource）蛋白质序列信息资源库（美、
11、德）http:/pir.georgetown.edu,1.蛋白质一级结构（序列）数据库,2.蛋白质二级结构（预测）数据库,蛋白质回环数据库：www.bmm.icnet.uk/loop同源模型数据库：(Definition of Secondary Structure of Proteins,蛋白质二级结构构象参数数据库)：http:/www.cmbi.kun.nl/gv/dsspFSSP(Families of Structural Similar Proteins)蛋白质家族数据库：http:/www.embl-ebi.ac.uk/dall/fsspHSSP(Homology Derived
12、 Secondary Structure of Proteins,同源蛋白质数据库)：www.cmbi.kun.nl/gv/hssp,3.蛋白质三级结构数据库,PDB(Protein DataBank)数据库，美国Brookhaven国家实验室管理生物大分子三维空间结构原子坐标数据库 http:/www.rcsb.org/pdb/NCBI STRUCTURE MMDB（Molecular Modelling DataBase）数据库，包含了从PDB获取的实验确定的生物高聚物结构分子模型数据库 http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/structureSWISS-MODEL Rep
13、ository数据库，由瑞士生物信息研究所负责的蛋白质 三维结构数据库 http:/swissmodel.expasy.org/repository/,CATH 数据库：CATH(Class,Architecture,Topology and Homologous superfamily)是与SCOP类似的一个数据库。http:/www.cathdb.info/SCOP（Structural classification of proteins）数据库，英国医学研究会（MRC）剑桥分子生物学实验室开发的蛋白质结构分类数据库。包含描述蛋白质域的家族、超家族、折叠、等级等信息。http:/scop
14、.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop,蛋白质晶体学是一门十分活跃的边缘学科，1960年2012年之间已经有15名蛋白质晶体学家荣获诺贝尔奖。,X-射线衍射（X-ray diffraction）和核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)技术是当前人们认识蛋白高级结构的主要手段，但两种技术都有不足之处。前者要求必需得到高标准的蛋白晶体，后者对分子量大于3万的大蛋白不能测定。,英国女化学家多萝西霍奇金（Dorothy Hodgkin）在20世纪30年代初通过X射线发现胃蛋白酶拥有完美的晶体，这个里程碑式的发现开启了生物结晶学研究的时代。霍奇金1949年测定出
15、了青霉素的结构，1957年又测定出了维生素B12的结构，并因此获得1964年诺贝尔化学奖。,蛋白质三级结构：,1988年，在世界上首次解析了一种膜蛋白紫细菌光合反应中心的高分辨率三维结构，诺贝尔化学。2002年，钾离子通道和水通道的晶体结构，诺贝尔化学奖。2009年，核糖体的晶体结构，诺贝尔化学奖。2012年，Lefkowitz和Kobilka因研究GPCR的结构和功能而获得诺贝尔化学奖,21,X射线衍射技术在蛋白质分析中的应用,蛋白质结构测定：1959年佩鲁茨和肯德鲁用了23年的时间对血红蛋白和肌血蛋白进行了X射线衍射分析，解决了血红蛋白的三维空间结构获得了1962年诺贝尔化学奖。,血红蛋白
16、的空间结构,血红蛋白的X射线衍射图,二、蛋白质数据库检索工具,SRS,(Sequence Retrieval System)是欧洲分子生物学网EMBnet的主要检索工具，现已直接进入。http:/www.ebi.ac.uk,Entrez是美国NCBI的主要检索工具，现在可以直接从Pubmed上进入。http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed,三、蛋白质分析软件,序列相似性分析蛋白质理化性质分析特征序列分析翻译后修饰分析结构功能域分析亚细胞定位分析,1.整体相似性序列对比：理论基础是进化学说2.局部相似性序列对比：其生物学基础是蛋白质功能结构域的高度保守性。所以，通过比较
17、分析保守位点上的残基可以对蛋白质的结构和功能进行预测。3.序列两两对比：通常用打分矩阵的方法。即两条序 列分别作为矩阵的两维，矩阵点是两维上对应两个序列的相似性分数，分数越高则说明两个序列越相似。常用对比程序BLASTP：http:/blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi4.多序列对比：是把两条以上可能有系统进化关系的序列进行对比的方法。也可用作同源性分析。目前，使用最广泛的多序列对比程序是CLUSTALX：www.ebi.ac.uk/clustalx/,序列相似性分析,目前，应用较广泛的序列相似性搜索工具：FASTA、BLAST和BLITZ等。对于DNA和蛋白质序列
18、相似性检索，FASTA的敏感度较高，但BLAST检索速度较快。BLITZ的运算速度较慢，但其特异性较高。,数据库序列比对软件,BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）,蛋白质理化性质分析,分析内容包括分子质量、等电点、亲水性和疏水性分析软件可用本地下载软件如MacVector、OMIGA、DNAMA、BioEdit等，也可用在线软件常用在线网址：www.expasy.org,蛋白质理化性质分析,蛋白质理化性质分析,蛋白质理化性质分析,蛋白质特征序列分析,包括二级结构以及二级和三级之间的模序（Motif）、结构域（Domain）和折叠单元（Fold）等。跨
19、膜区、前导肽、信号肽及蛋白质定位。其它功能基团。,螺旋,片层,/折叠,+折叠,蛋白质特征序列分析,蛋白质特征序列分析,蛋白质翻译后修饰分析,蛋白质翻译后修饰分析,蛋白质亚细胞定位分析,三级蛋白结构显示软件PyMolRasMolVMDCn3D,PyMOL-created Journal Covers,Pymol 软件3D动画演示,蛋白检索1：（以COX-2为例）,蛋白检索2：（以COX-2为例）,蛋白检索3：（以COX-2为例）,蛋白检索4：（以COX-2为例）,蛋白序列比对1：（以COX-2为例）,蛋白序列比对2：（以COX-2为例）,蛋白序列比对3：（以COX-2为例）,蛋白序列比对4：（以
20、COX-2为例）,蛋白序列比对5：（以COX-2为例）,蛋白序列比对6：（以COX-2为例）,蛋白序列比对7：（以COX-2为例）,蛋白序列比对8：（以COX-2为例）,蛋白序列比对9：（以COX-2为例）,蛋白序列比对10：（以COX-2为例）,蛋白序列三级结构1：（以COX-2为例）,蛋白序列三级结构2：（以COX-2为例）,蛋白序列三级结构3：（以COX-2为例）,蛋白序列三级结构4：（以COX-2为例）,色氨酸笼 trp-cage：由20个氨基酸（NLYIQWLKDG GPSSGRPPPS）构成，是华盛顿大学的Jonathan Neidigh制造的人造蛋白。大部分小分子短链结构比较松散
21、，这种蛋白质却像大分子蛋白质一样，具有紧凑、明确的结构。Simmerling等人利用电脑模拟技术，根据一种蛋白质的基因编码，准确地预测了它是怎样折叠成三维结构的。预测结果，几乎完全符合华盛顿大学研究小组利用核磁共振技术测量出的这种“迷你”蛋白的形状。,蛋白质分子结构预测,蛋白质分子设计,蛋白质分子设计与基因工程技术、多肽合成技术和化学合成技术一起开创了新药设计和开发研究的新局面。这个领域的研究方向主要包括蛋白三维结构预测、蛋白质结构功能关系研究、蛋白相互作用、蛋白与DNA相互作用、蛋白质突变体的分子设计、全新蛋白质设计等。,抗体药物与抗体检测技术,蛋白质活性的改变（胰岛素改造）,Insulin
22、,班廷,麦克劳德,摘自诺贝尔奖并非梦日本石田寅夫著和加拿大糖尿病协会网站:www.diabetes.ca/,胰岛素 Insulin,一个极富传奇的科学发现,荣获1923年诺贝尔医学和生理学奖发现胰岛素,11.14定为国际糖尿病日,化学结构,Hocking1964诺贝尔化学奖,Sanger1958诺贝尔化学奖,分子量为56kD的蛋白质由两条肽链（A21,B30）51个氨基酸组成，通过两个二硫键相连,一级结构,三维结构,胰岛素 Insulin,胰岛素的测定：发明免疫方法测定胰岛素Yallow，1977诺贝尔医学奖人工合成：胰岛素改造：,合成复杂，活性低1965年中国首次人工合成结晶牛胰岛素杰出代表
23、：钮经义、邹承鲁、季爱雪和 汪猷（见CCTV2003年7月邹承鲁院士访谈录）,一个让中国人骄傲与遗憾的生命物质,赖脯素（Lispro insulin)：为Lilly公司优泌乐(Humulog)其是将胰岛素第28，29位上的脯氨酸和赖氨酸位置颠倒的胰岛素类似物,借以改变B链末端空间结构，减少胰岛素单体间的非极性接触和b片层相互作用，改善其自我聚合特性。Starts：working in 5 to 15 minutes.Lowers blood glucose most in 45 to 90 minutes.Finishes：working in 3 to 4 hours.天冬胰岛素(Aspar
24、t insulin)：为Novo Nordisk公司的诺和锐（Novorapid）其是将胰岛素第28位上的脯氨酸被天冬氨酸所替代的胰岛素类似物目的是引起天门冬氨酸的阴离子，通过电荷排斥阻止胰岛素单体或二聚体的聚合。这种改变减弱了溶液中胰岛素分子间的结合强度，减少分子聚合，使之迅速解离成单体。Starts：working in 10 to 20 minutes.Lowers：blood glucose most in 1 to 3 hours.Finishes：working in 3 to 5 hours.,甘精胰岛素(Insulin Glargine；Lantus)：在人胰岛素B链的羧基末端
25、加上两个带正电的精氨酸残基，从而使等电点从PH5.4提高为PH6.7，同时在A链21位以中性甘氨酸代替酸性的天冬氨酸，从而在酸性环境中保持稳定，显著延长其活性。该药的氨基酸序列与人胰岛素有3个不同,这一变化改变了其从皮下组织到血液的释放速度,因此每天只需给药1次,保证在24h内持续释药而无峰值变化。Starts working in 1 hour.Lowers blood glucose evenly for 24 hours.Finishes working in 24 hours and is taken once a day at bedtime.Lantus should not be
26、 mixed together in a syringe with any other form of insulin before use.,吸入型胰岛素:,Exubera,尽管Exubera比传统的注射胰岛素更加方便，但是因为销售不佳，2008年初Pfizer仍然决定停止Exubera的市场销售，这一决定致使28亿美元付之东流。当世界最大的制药公司承认其产品从来没有成为期望中的重磅炸弹后，礼来和诺和诺德今年也结束了吸入型胰岛素的研发计划。,蛋白质改造的安全性,Antibody,1901年，首次诺贝尔医学奖就授予了德国人贝林（Emil Von Behring），其发现了“抗毒素”。用动物血清
27、治疗白喉患者取得巨大成功。这也是免疫学上“被动免疫”和“血清疗法”的先河。当初的“抗毒素”便是今天免疫学上的“抗体”概念的雏形。1908年，诺贝尔医学奖授予德国科学家欧立希（Paul Ehrlich）提出：抗体侧链形成的理论，认为抗体和抗原可以如同如同“钥匙和锁的匹配”，并且发现了补体的效应功能。因此被称为“体液免疫之父”。1972年，诺贝尔奖授予美国科学家埃德尔曼（Gerald.M.Edelman）、英国科学家波特（Rodney.R,Porter），因其发现抗体的物质基础，是四肽组成的免疫球蛋白。1984年，诺贝尔医学奖授予德国科学家科勒（Georges.F.Kohler）和阿根廷科学家米尔
28、斯坦（Cesar Milstein），因其发现单克隆抗体技术。1987年，日本科学家利根川进（Susumu Tonegawa）由于“抗体多样性产生遗传机理的发现”而独享了该年度的诺贝尔生理学或医学奖。,抗体与诺贝尔奖,Khler,G.&Milstein,C.Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.Nature 256,495497(1975).,The Nobel Prize of Physiology and Medicine in 1984,Jerne,N,Khler,G
29、,Milstein,C,Antibody Structure,CDR,Complementarity Determining Region,Antibody Structure,Antibody Types,抗体的应用,抗体药物：主要有靶点封闭（如Avastin-VEGF,Licartin-CD147）、信号转导（如Herceptin-EGFR）、靶向载体（如Zevalin-Y90）、免疫应答（如Rituxan-ADCC,CDC）、中和作用（如Remicade-TNF）、免疫调节（如Basiliximab-CD25)等。科学研究：主要有目标蛋白和分子靶标的检测与分析、疾病分子机制探讨,Anti
30、body Drugs,发现免疫反应的物质基础抗毒素（抗原），成就了第一代抗体多克隆抗体（抗体血清）。再是明晰抗体化学结构，探讨其生物合成，发明了利用杂交瘤技术制备单克隆抗体。在此技术问世11年（1986年）后第二代抗体药物治疗性单抗药物（OKT3，muromonab）在美国上市。此后随着抗体基因重排规律的阐释，“重组抗体”作为第三代抗体逐渐问世。,目前抗体药物制备关键技术主要有杂交瘤技术、抗体表位/靶点确认技术、嵌合抗体技术、人源化抗体修饰技术、抗体库技术、B细胞永生化分选技术、B细胞分选克隆技术、全人抗体转基因小鼠技术等，抗体药物大规模生产主要采用动物细胞大规模批次流加培养及连续灌流培养工艺
31、,抗体单用、免疫毒素交联、化学交联、放射免疫、双特异抗体,抗体药物的应用形式,1.动物来源的抗血清用于肺炎、白喉、麻疹等传染病的早期治疗,显示了一定效果,但毒副作用大,特别是异源蛋白易产生过敏反应。2.鼠单抗用于人体治疗也存在许多问题，包括诱发人抗小鼠反应()、半衰期较短,可较快被清除而影响疗效、在人体中常不能有效激活补体和受体相关的效应系统。3.抗体人源化解决了上述问题，然而人源化抗体也涉及抗体亲和力下降、效价降低，以及抗体分子亲疏水性等问题。,抗体药物的局限性,对人源化抗体的研究，历经了人鼠嵌合抗体、人源化单克隆抗体及人源性单克隆抗体三个发展阶段。,Antibody Modify,人源化抗
32、体改造的策略：,主要针对CDR区进行移植改造：通过蛋白质数据库检索、计算机分子模拟等寻找出有最 大同源性的人可变区模板 综合考虑表面残基、与CDR有相互作用或对空间结构有重 要影响的残基，确定需要保留和改变的关键残基 再通过模拟基因合成，表达检测实际效果，进行必要 的修正，来获得高亲和力的治疗mAb,Antibody Modify,Antibody target,Some of the key players that helped advance ADC technology,Paul Ehrlich proposed the concept of magic bullets in the
33、early 1900s(top left).In 1975,Csar Milstein and George Khler described how mAbs with exquisite specificities could be produced(top right).George Pettit extracted highly potent cytotoxins from natural sources(bottom right),such as the Indian Ocean sea hare(Dolabela auricularia,bottom left),that event
34、ually led us to the discovery and development of the drug component of brentuximab vedotin.,ADCs药物的靶点：ADCs药物靶点选择的原则是，应为肿瘤细胞特异性表达，或过度表达的抗原。这样方能确保ADCs药物在机体内的靶向性。目前在研的ADC药物靶点几乎涵盖了所有已经确证的药物靶点，除了已有上市抗体药物靶点，如Her 2、EGFR，CD19、CD22、CD70等，诸多新型靶点如：SLC44A4(AGS-5)、Mesothelin 等也成为ADCs药物的作用靶点。ADCs药物使用的抗体：抗体在ADCs药物
35、的作用在于精确“制导”，高细胞毒性的化学药物连接抗体后，可精确锁定靶细胞。抗体的优化也可大幅降低ADCs药物的非特异性结合,延长ADCs药物在血液中的半衰期。ADCs药物的连接物：连接物实现抗体与化学药物的连接，在ADCs药物进入靶细胞前，它能确保偶联药物的完整性。而一旦ADCs药物进入作用靶点，连接物又要确保化学药物的有效释放。所以，ADCs药物连接物的解离与否，直接影响到其药代动力学。ADCs使用的化学药物：目前ADC使用的化学药物主要有三种，微管蛋白抑制剂（美登霉素）、烷化剂、和DNA小沟抑制剂（烯二炔类抗生素）。这些化学药物与传统的化疗药物相比，对癌细胞具备更强的杀伤效力。通常平均四到
36、六个分子的剂量就可实现对靶细胞杀伤。此外，ADCs药物偶联的小分子化学药物，进入人体后应不具有免疫原性。,ADCs药物的开发涉及：药物靶点的筛选，重组抗体的制备、“连接物”技术开发以及高细胞毒性化合物的优化等四个方面,用于转移性HER2阳性乳腺癌治疗新药（trastuzumab emtansine，T-DM1）：,妥珠单抗（HER2）加上强效抗微管药物DM1,ADCETRIS(brentuximab vedotin)是一种CD30-导向抗体药物结合物(ADC)由三个组分组成：1)嵌合IgG1 抗体cAC10，对人CD30专一，2)微管的破坏剂MMAE，和3)一个将MMAE共价附着在cAC10上
37、的蛋白酶可裂解的连接桥。,用于难治性淋巴瘤的新药（brentuximab bedotin，ADCETRIS）：,抗体药物交联潜在的分子靶点,NO.1修美乐(阿达木单抗）销售额：94.8亿美元,公司：雅培NO.2恩利(依那西普）销售额：83.7亿美元，公司：安进及辉瑞NO.3舒利迭(沙美特罗-氟替卡松）销售额：80亿美元，公司：葛兰素史克NO.4类克(英利昔单抗）销售额：76.7亿美元，公司：强生和默沙东NO.5美罗华(利妥昔单抗）销售额：69.4亿美元，公司：罗氏NO.6可定(瑞舒伐他汀钙）销售额：66.5亿美元，公司：阿斯利康NO.7来得时(甘精胰岛素）销售额：61.2亿美元，公司：赛诺菲N
38、O.8赫赛汀(曲妥珠单抗）销售额：60.8亿美元，公司：罗氏NO.9安维汀（贝伐珠单抗）销售额：59.8亿美元，公司：罗氏NO.10立普妥(阿托伐他汀钙）销售额：55.5亿美元，公司：辉瑞,2012全球销售前十位药物,全球已上市单抗（截至2012年中）,目前全球共有32个单抗品种上市（其中2个品种已退市），其适应症主要集中在肿瘤治疗、风湿性关节炎等免疫缺陷性疾病治疗、器官移植排斥治疗、感染性疾病治疗4个领域。,全球已上市单抗（截至2012年中）,科学研究过程中常用蛋白质检测技术：,1.免疫印迹法（WB）：（Western Blotting)2.免疫组织化学与免疫细胞化学（IHC&ICC）：（I
39、mmunohistochemistry and Immunocyctochemistry）3.酶联免疫法（ELISA）：4.流式细胞检测法（FACS）：Flow cytometry5.免疫共沉淀法（IP）：Immunoprecipitation6.染色体免疫共沉淀（ChIP）：Chromatin Immunoprecipitation,WB,定性及定量，最常用的蛋白检测方法，特异性及灵敏性高。一抗的选择包括样本的种属及其适用于WB实验方法的单克隆抗体或经亲和纯化的多克隆抗体；二抗的选择 包括与一抗种属匹配及其标记方法（HRP、ALP）,IHC&ICC,用于检测目标蛋白质定性和定位，形态学观察。抗体用量大，可用同种属不同荧光标记的抗体，形成丰富多彩的视觉冲击。用显微镜检测。,ELISA,主要用于检测分泌型蛋白质、蛋白定量精准，灵敏，所用抗体量少。用酶标仪检测。,FACS,能同时检测多种蛋白质表达，包括细胞表面、细胞内；也能检测活细胞蛋白表达；同时也能分选不同类型的细胞。,IP,用于检测蛋白质与蛋白质相互作用的实验方法,ChIP,用于检测蛋白质与核酸相互作用的实验方法,谢谢,
