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1、生物化学与分子生物学,第二章核酸的结构和功能,Structure and Function of Nucleic Acid,核 酸(nucleic acid),是以核苷酸为基本组成单位的生物大分子，携带和传递遗传信息。,1868年 Fridrich Miescher 从脓细胞中提取核素。1944年 Avery等人证实DNA是遗传物质。1953年 Watson和Crick发现DNA的双螺旋结构。1968年 Nirenberg发现遗传密码。1975年 Temin和Baltimore发现逆转录酶。1981年 Gilbert和Sanger建立DNA测序方法。1985年 Mullis发明PCR技术。19
2、90年 美国启动人类基因组计划(HGP)。1994年 中国人类基因组计划启动。2001年 美英等国完成人类基因组计划。,核酸研究的发展简史,核酸的分类及分布,存在于细胞核和线粒体,分布于细胞核、细胞质、线粒体,(deoxyribonucleic acid,DNA),(ribonucleic acid,RNA),脱氧核糖核酸,核糖核酸,第一节核酸的化学组成以及一级结构The Chemical Component and Primary Structure of Nucleic Acid,核酸组成,DNA的组成单位是脱氧核糖核苷酸（deoxyribonucleotide）RNA的组成单位是核糖核苷
3、酸（ribonucleotide）。,一、核苷酸是构成核酸的基本组成单位,碱基(base)是含氮的杂环化合物。,碱基,嘌呤,嘧啶,腺嘌呤,鸟嘌呤,尿嘧啶,胸腺嘧啶,胞嘧啶,存在于DNA和RNA中,仅存在于RNA中,仅存在于DNA中,碱基,嘌呤(purine，Pu),腺嘌呤(adenine,A),鸟嘌呤(guanine,G),嘧啶(pyrimidine，Py),胞嘧啶(cytosine,C),尿嘧啶(uracil,U),胸腺嘧啶(thymine,T),碱基的互变异构体,戊糖,脱氧核苷,嘌呤N-9 与脱氧核糖C-1通过-N-糖苷键相连形成脱氧核苷(deoxyribonucleoside)。,嘧啶N
4、-1与核糖C-1通过-N-糖苷键相连形成核苷(ribonucleoside)。,核苷,N,N,N,N,9,N,H,2,O,O,H,O,H,H,H,H,C,H,2,O,H,H,1,2,糖苷键,核苷或脱氧核苷与磷酸通过酯键结合构成核苷酸(ribonucleotide)或脱氧核苷酸(deoxyribonucleotide)。,核苷酸(ribonucleotide),多磷酸核苷酸,环化核苷酸：cAMP、cGMP，是细胞信号转导中的第二信使。,cAMP,核苷酸衍生物,生物氧化体系的重要成分，在传递质子或电子的过程中具有重要的作用。,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，nicotinamide adenine dinu
5、cleotide,NAD+），,构成RNA的碱基、核苷以及核苷酸,构成DNA的碱基、核苷、核苷酸,二、DNA是脱氧核苷酸通过3,5-磷酸二酯键连接形成的大分子,一个脱氧核苷酸3的羟基与另一个核苷酸5的-磷酸基团缩合形成磷酸二酯键(phosphodiester bond)。多个脱氧核苷酸通过磷酸二酯键构成了具有方向性的线性分子，称为多聚脱氧核苷酸(polydeoxynucleotide)，即DNA链。,C,G,A,交替的磷酸基团和戊糖构成了DNA的骨架(backbone)。,DNA链的方向是5 3,三、RNA也是具有3,5-磷酸二酯键的线性大分子,RNA也是多个核苷酸分子通过3,5-磷酸二酯键连
6、接形成的线性大分子，也具有53方向性;RNA的戊糖是核糖；RNA的嘧啶是胞嘧啶和尿嘧啶。构成RNA的四种基本核苷酸是AMP、GMP、CMP和UMP。,定义核酸中核苷酸的排列顺序。由于核苷酸间的差异主要是碱基不同，所以也称为碱基序列。,四、核酸的一级结构是核苷酸的排列顺序,核酸的一级结构,5 pApCpTpGpCpT-OH 3,5 A C T G C T 3,A C T G C T,单链DNA和RNA分子的大小常用核苷酸数目（nucleotide，nt）表示；双链核酸分子的大小常用碱基(base或kilobase)数目来表示。小的核酸片段(50bp)常被称为寡核苷酸(oligonucleotid
7、e)。自然界中的DNA和RNA的长度可以高达几十万个碱基。,第二节DNA的空间结构与功能Dimensional Structure and Function of DNA,DNA的空间结构又分为二级结构(secondary structure)和高级结构。,DNA的空间结构(spatial structure),构成DNA的所有原子在三维空间的相对位置关系。,一、DNA的二级结构是双螺旋结构,不同生物种属的DNA的碱基组成不同同一个体的不同器官或组织的DNA碱基组成相同 对于一特定组织的DNA，其碱基组分不随年龄、营养状态和环境而变化A=T，G=C,Chargaff 规则,（一）DNA双螺旋结
8、构的实验基础,获得了高质量的DNA分子的X射线衍射照片。,提出了DNA分子双螺旋结构(double helix)模型。,两条多聚核苷酸链在空间的走向呈反向平行(anti-parallel)。两条链中一条链的53方向是自上而下，而另一条链的53方向是自下而上。两条链围绕着同一个螺旋轴形成右手螺旋(right-handed)的结构。双螺旋结构的直径为2.37nm，螺距为3.54nm。,（二）DNA双螺旋结构模型要点,1.DNA由两条多聚脱氧核苷酸链组成,脱氧核糖和磷酸基团组成的亲水性骨架位于双螺旋结构的外侧，疏水的碱基位于内侧。双螺旋结构的表面形成了一个大沟(major groove)和一个小沟(
9、minor groove)。,2.核糖与磷酸位于外侧,DNA双螺旋结构的示意图,DNA双螺旋结构的俯视图,3.DNA双链之间形成了互补碱基对,碱基配对关系称为互补碱基对(complementary base pair)。DNA的两条链则互为互补链(complementary strand)。碱基对平面与螺旋轴垂直。,碱基互补配对:鸟嘌呤/胞嘧啶,碱基互补配对:腺嘌呤/胸腺嘧啶,大沟与小沟,相邻两个碱基对会有重叠，产生了疏水性的碱基堆积力(base stacking interaction)。碱基堆积力和互补碱基对的氢键共同维系着DNA结构的稳定。,4.碱基对的疏水作用力和氢键共同维持着DNA双
10、螺旋结构的稳定,碱基堆积作用力,（三）DNA双螺旋结构的多样性,（四）DNA的多链结构,在酸性的溶液中，胞嘧啶的N-3原子被质子化，可与鸟嘌呤的N-7原子形成氢键；同时，胞嘧啶的N-4的氢原子也可与鸟嘌呤的O-6形成氢键，这种氢键被称为Hoogsteen氢键。,Hoogsteen氢键,Hoogsteen氢键，不破坏Watson-Crick氢键，由此形成了CGC的三链结构(triplex)。,三链结构,鸟嘌呤之间通过8个Hoogsteen氢键形成特殊的四链结构(tetraplex)。,四链结构,真核生物DNA3-末端是富含GT的多次重复序列，因而自身形成了折叠的四链结构。,二、DNA的高级结构是
11、超螺旋结构,超螺旋结构(superhelix 或supercoil)DNA双螺旋链再盘绕即形成超螺旋结构。,正超螺旋(positive supercoil)盘绕方向与DNA双螺旋方同相同。,负超螺旋(negative supercoil)盘绕方向与DNA双螺旋方向相反。,（一）原核生物DNA的环状超螺旋结构,原核生物DNA多为环状的双螺旋分子，以负超螺旋的形式存在，平均每200碱基就有一个超螺旋形成。,（二）真核生物DNA以核小体为单位形成高度有序致密结构,真核生物DNA以非常有序的形式存在于细胞核内。在细胞周期的大部分时间里，DNA以松散的染色质(chromatin)形式存在，在细胞分裂期，
12、则形成高度致密的染色体(chromosome)。,DNA染色质呈现出的串珠样结构。染色质的基本单位是核小体(nucleosome)。,DNA染色质的电镜图像,DNA：约200bp 组蛋白：H1H2A，H2BH3H4,核小体的组成,核小体串珠样的结构,双链DNA的折叠和组装,DNA经过多次折叠，被压缩了800010000倍，组装在直径只有数微米的细胞核内。,真核生物的染色体,两个功能区：,端粒(telomeres):染色体末端膨大的粒状结构，由染色体末端DNA（端粒DNA）与DNA结合蛋白构成。与染色体结构的稳定性、完整性以及衰老和肿瘤的发生发展相关。着丝粒（centromere）:两个染色单体
13、的连接位点，富含A、T序列。细胞分裂时，着丝粒可分开使染色体均等有序地进入子代细胞。,DNA是生物遗传信息的载体，并为基因复制和转录提供了模板。它是生命遗传的物质基础，也是个体生命活动的信息基础。基因是携带遗传信息的DNA片段，它们的序列信息意义及其在DNA整个分子上的排布特点将在第十三章详述。DNA具有高度稳定性的特点，用来保持生物体系遗传的相对稳定性。同时，DNA又表现出高度复杂性的特点，它可以发生各种重组和突变，适应环境的变迁，为自然选择提供机会。,三、DNA是遗传信息的物质基础,第三节 RNA的结构与功能,Structure and Function of RNA,RNA与蛋白质共同负
14、责基因的表达和表达过程的调控。RNA通常以单链的形式存在，但有复杂的局部二级结构或三级结构。RNA比DNA小的多。RNA的种类、大小和结构远比DNA表现出多样性。,动物细胞内主要的RNA种类及功能,信使RNA(messenger RNA,mRNA)是细胞内合成蛋白质的模板。生物体内mRNA的丰度最小、种类最多、大小也各不相同、寿命最短。mRNA的初级产物为不均一核RNA(hnRNA)，含有内含子(intron)和外显子(exon)。hnRNA经过剪切后成为成熟的mRNA。,一、mRNA是蛋白质合成中的模板,内含子(intron),mRNA成熟过程,外显子(exon),成熟的mRNA由氨基酸编码
15、区和非编码区构成。5-末端的帽子(cap)结构和3-末端的多聚A尾(poly-A tail)结构。,成熟的真核生物mRNA,帽子结构:m7GpppNm,1.真核生物mRNA的5-端有特殊帽结构,mRNA的帽结构可以与帽结合蛋白(cap binding protein，CBP)结合。,真核生物的mRNA 的3-末端转录后加上一段长短不一的聚腺苷酸。,2.真核生物mRNA的3末端有多聚腺苷酸尾,mRNA的多聚A尾在细胞内与poly(A)结合蛋白（poly(A)-binding protein，PABP）结合存在。,mRNA核内向胞质的转位mRNA的稳定性维系翻译起始的调控,帽子结构和多聚A尾的功能
16、,3.mRNA碱基序列决定蛋白质的氨基酸序列,从mRNA分子5末端起的第一个AUG开始，每3个核苷酸为一组称为密码子(codon)。,位于起始密码子和终止密码子之间的核苷酸序列称为开放阅读框(open reading frame,ORF)，决定了多肽链的氨基酸序列。,在mRNA的开放读框的两侧，为非翻译序列（untranslated region，UTR），即5-UTR和3-UTR。,转运RNA(transfer RNA,tRNA)在蛋白质合成过程中作为各种氨基酸的载体,将氨基酸转呈给mRNA。由7495核苷酸组成；占细胞总RNA的15%；具有很好的稳定性。,二、tRNA是蛋白质合成中的氨基酸
17、载体,1.tRNA中含有多种稀有碱基,稀有碱基（rare base）是指除A、G、C、U外的一些碱基。,tRNA具有局部的茎环(stem-loop)结构或发卡(hairpin)结构。,2.tRNA含有茎环结构,tRNA的二级结构三叶草形,氨基酸臂，DHU环，反密码环，TC环，附加叉,tRNA的倒L三级结构,tRNA的3-末端为CCA结尾。3-末端的A与氨基酸以酯键相连生成氨基酰-tRNA。不同的tRNA结合不同的氨基酸。,3.tRNA的3-末端连接氨基酸,tRNA的反密码子环上有反密码子(anticodon)。tRNA上的反密码子通过碱基互补识别mRNA上的密码子。,4.tRNA的反密码子识别
18、mRNA的密码子,核糖体RNA(ribosomal RNA，rRNA)是细胞内含量最多的RNA(80)。rRNA与核糖体蛋白结合组成核糖体(ribosome)，为蛋白质的合成提供场所。,三、以rRNA为组分的核糖体是蛋白质合成的场所,核糖体的组成,大肠杆菌的核蛋白体,18S rRNA的二级结构,四、其他非编码RNA参与基因表达的调控,长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）,非编码RNA（Non-coding RNA,ncRNA）,不编码蛋白质但具有重要生物学功能的RNA分子。,短链（小）非编码RNA（small non-coding RNA,sncRNA）,n
19、cRNA 功能,参与转录调控、RNA的剪切和修饰、mRNA的稳定和翻译调控、蛋白质的稳定和转运、染色体的形成和结构稳定等细胞重要功能,lncRNA 功能,lncRNA在结构上类似于mRNA，但序列中不存在开放读框。许多已知的lncRNAs由RNA聚合酶转录并经可变剪切形成，通常被多聚腺苷酸化。lncRNA具有复杂的生物学功能，并与一些疾病的发病机制密切相关。有的lncRNA能使基因沉默，有的则激活基因的表达。,核内小RNA核仁小RNA胞质小RNA催化性小RNA小干涉 RNA 微 RNA,短链非编码RNA亦称为非编码小RNA（small non-messenger RNA）,核内小RNA（sma
20、ll nuclear RNA,snRNA）位于细胞核内。snRNA有5种，分别称为U1、U2、U4、U5、U6，它们与多种蛋白形成复合体，参与真核细胞hnRNA的内含子加工剪接（第十六章）。核仁小RNA（small nucleolar RNA,snoRNA）：定位于核仁，主要参与rRNA的加工和修饰，如rRNA中核糖C-2的甲基化修饰。胞质小RNA（small cytoplasmic RNA,scRNA）：存在于细胞质中，参与形成信号识别颗粒，引导含有信号肽的蛋白质进入内质网定位合成（第十七章）。,催化性小RNA亦被称为核酶（ribozyme）。是细胞内具有催化功能的一类小分子RNA，具有催化
21、特定RNA降解的活性，在RNA的剪接修饰中具有重要作用。小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）是生物宿主对于外源侵入基因表达的双链RNA进行切割所产生的具有特定长度（2123 bp）和特定序列的小片段RNA。这些siRNA可以单链形式与外源基因表达的mRNA相结合，并诱导相应mRNA降解。,微RNA（microRNAs,miRNAs）,是一类长度为22nt左右的内源性sncRNA。miRNAs主要是通过结合mRNA而选择性调控基因的表达。,原核生物基因表达的特异性,五、核酸在真核细胞和原核细胞中表现出不同的时空特性,真核生物基因表达的特异性,核酸的理化性质The
22、 Physical and Chemical Characters of Nucleic Acid,第四节,核酸在波长 260nm 处有强烈的吸收，是由碱基的共轭双键所决定的。这一特性常用作核酸的定性和定量分析。,一、核酸分子具有强烈的紫外吸收,碱基的紫外吸收光谱,DNA或RNA的定量A260=1.0 相当于 50g/ml 双链DNA(dsDNA)40g/ml 单链DNA(ssDNA or RNA)20g/ml 寡核苷酸确定样品中核酸的纯度 纯 DNA:A260/A280=1.8纯 RNA:A260/A280=2.0,紫外吸收的应用,二、DNA变性是双链解离为单链的过程,某些理化因素导致DNA
23、双链互补碱基对之间的氢键发生断裂，DNA双链解离为单链的过程。,定义,DNA变性的本质是双链间氢键的断裂。,部分解链,双链DNA,DNA的变性,DNA的变性,部分变性DNA的电镜图像,增色效应(hyperchromic effect)：DNA变性时其溶液OD260增高的现象。,DNA解链时的紫外吸收变化,DNA的解链曲线,连续加热DNA的过程中以温度相对于A260值作图，所得的曲线称为解链曲线。,解链过程中，紫外吸光度的变化达到最大变化值的一半时所对应的温度。,解链温度(melting temperature，Tm),G+C 含量越高，解链温度就越高。,解链曲线的变化,三、变性的核酸可以复性或
24、形成杂交双链,当变性条件缓慢地除去后，两条解离的互补链可重新配对，恢复原来的双螺旋结构，这一现象称为DNA复性(renaturation)。,减色效应：DNA复性时，其溶液OD260降低。,热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为退火(annealing)。,不同种类的DNA单链分子或RNA分子放在同一溶液中，只要两种单链分子之间存在着一定程度的碱基配对关系，在适宜的条件可以在不同的分子间形成杂化双链(heteroduplex)。这种杂化双链可以在不同的DNA与DNA之间形成，也可以在DNA和RNA分子间或者RNA与RNA分子间形成。这种现象称为核酸分子杂交。,核酸分子杂交(hybri
25、dization),核酸分子复性和杂交,研究DNA分子中某一种基因的位置。监定两种核酸分子间的序列相似性。检测靶基因在待检样品中存在与否。,核酸分子杂交的应用,第五节 核酸酶 Nuclease,依据底物不同分类DNA酶(deoxyribonuclease,DNase)：专一降解DNA。RNA酶(ribonuclease,RNase)：专一降解RNA。依据对底物作用方式不同核酸内切酶：在DNA或RNA分子内部切断磷酸二酯键。核酸外切酶：水解核酸分子链末端的磷酸二酯键。有53或35核酸外切酶。,核酸酶是指所有可以水解核酸的酶。,5,5,3,3,外切位点,外切位点,内切位点,内切位点,参与DNA的合成、修复以及RNA的剪接。清除多余的、结构和功能异常的核酸，以及侵入细胞的外源性核酸。降解食物中的核酸。体外重组DNA技术中的重要工具酶。,核酸酶的功能,
