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1、1,第二章生物大分子分离纯化技术,2,2.4.生物大分子的色谱分离纯化技术,3,2.4.1 高效毛细管电泳 高效毛细管电泳(High-performance Capillary Electrophoresis,HPCE)是荷电粒子在直流高压的作用下，在毛细管中迁移，从而进行高效、快速分离的一种电泳新技术。其分离是基于带电离子在电场中的不同的电泳淌度。它的基本原理与常规凝胶电泳或自由电泳并无本质的差别。所以，HPCE可以看成是一种仪器化程度比较高的电泳方式。,4,由于毛细管具有良好的散热性能，从而可以在毛细管两端加上高达30000 V 的高压、分离可以在很短时间内完成，分离效率非常高。这种方法所
2、需样品体积只有L-nL级。所以，HPEC法的特点为：高效、快速、微量、易于实现自动化，而且溶剂消耗少、环境污染小等等。,5,仪器 HPCE仪器的基本组成如图所示，它由毛细管，带电极的容器，高压直流电源，进样系统，检测器及数据采集和记录系统组成。比较先进的HPCE仪器还配有毛细管恒温设备，自动采样器，微制备组分收集器和基于计算机的自动化及数据评价系统。,6,7,1毛细管 HPCE在毛细管中进行，管内径一般在25100m之间，外径在100400m之间长度为0.11m。除了石英毛细管外，玻璃、聚四氟乙烯(PTPE)及聚氟乙烯-丙烯毛细管也有使用。,8,2进样系统 为了保证HPCE分离的高效性，进样系
3、统应尽量把nL-pL级的样品以最短的样品区带引入到毛细管中。一般可采用电动法或流体力学法。,9,3高压直流电源 高压电源需提供高达30 kV的直流电压。检测器位于毛细管的接地端，电流在3300 A之间。电源应能以恒电压或恒电流(ITP)或恒功率的方式工作，其稳定件应达到设置值的0.1%。另外，电源的正负极应可以切换，以适应带不同电荷的样品的分离。,10,4检测 HPEC这种方法的灵敏度及高效性都依赖于检测器的高灵敏度，实际已经采用的检测器类型有多种。,11,HPEC中的主要检测技术检测原理 最低检出浓度(mol/L)最低检出量 适用范围紫外可见吸收法 10-610-4 10-1510-13 通
4、用/特殊情况基于一般光源的荧光法 10-810-5 10-1810-13 特殊情况基于激光的荧光法 10-1210-9 10-2110-18 特殊情况热光吸收法 10-810-5 10-1710-14 通用/特殊情况折射率法 10-710-5 10-1610-14 通用电导法 10-810-6 10-1910-17 特殊情况安培法 10-810-6 10-1910-17 特殊情况质谱法 10-910-5 10-1710-15 通用放射测定法 10-910-7 10-1910-17 特殊情况,12,分离模式 HPCE的操作模式有多种，如毛细管区带电泳(Capillary Zone Electro
5、phoresis,CZE)；毛细管等速电泳(Capillary Isotachophoresis，CITP)，毛细管胶束电动色谱(Capillary Micellar Electrokinetic Chromatography，CEKC)；毛细管凝胶电泳(Capillary Gel Electrophoresis，CGE)和毛细管等电聚焦法(Capillary Isoelectric Focusing，CIEF)等。,13,CZE是基于溶质在自由溶液中淌度差异的电泳分离方法，是目前应用最广泛的一种，如氨基酸、多肽及无机离子的分析，手性对映体分离，蛋白质纯度鉴定及构型研究等。,14,CGE主要在
6、生物学上用于大分子的分离分析，如蛋白质和核酸。它是基于分子的尺寸，让样品在合适的起分子筛作用的聚合物网孔内进行电泳分离。CGE可用于DNA序列分析，蛋白质分析。,15,pBR332 DNA的MSPI酶解片段混合物的CGE分离(峰(bP)：1，26；2，34；3,67；4,76；5,90；6,110；7,123；8、9,147,10,11，160；12，180；13，190；14，201；15，2I7；16，238；17，242。缓冲液：TEB。进样：3s，30 mW。TEB组成：89 mmol/L Tris,89mmol/L 硼酸盐及2 mmol/L EDTA)。200V/cm，毛细管有效长度
7、：7cm，EB的浓度为1g/ml,16,标准蛋白质的分离,17,2.4.2 液相色谱法,液相色谱是目前对生物大分子的分离纯化能力最强、效率最高、使用最广泛的手段之一。液相色谱大都在室温下操作，所用流动相可以用与生理液相近的缓冲水溶液。所用固定相的表面经过化学修饰和覆盖，为生物大分子的分离分析提供了温和的条件，有利于保持生物大分子的构象和活性。,18,在生物大分子分离分析及纯化中最常用的色谱方法是空间排阻色谱法、离子交换色谱法、反相色谱法、疏水作用色谱法、亲和色谱法、羟基磷灰石(用于单链和双链DNA的纯化和鉴定)及液液分配色谱法。,19,核酸的色谱分离法,20,酶及蛋白质的各种分离纯化方法的比较
8、,21,1 排阻色谱 排阻色谱(Size Exclusion Chromatography,SEC)也被称之为凝胶过滤色谱是20世纪60年代发展起来的一种特别适合于生物大分子分离和纯化的技术。,22,基本原理 排阻色谱是依据分离样品物质分子大小而进行分离的一种方法，其固定相由一种惰性的凝胶颗粒构成，颗粒内部有许多网孔。颗粒和网孔的大小都可以人为地去控制和选择。在分离过程中，比网孔大的分子不能进入网孔的内部，它们只限于在凝胶颗粒之间的流动相空间里向下流动，其流程短流动速度快，而比网孔小的分子能扩散到网孔的内部，因而向下移动时所经历的流程长，下行速度慢。最终所产生的结果是：分子越大移动的越快，从而
9、达到大小不同分子间的分离。,23,24,凝胶色谱的物理特性 1凝胶颗粒的大小和形状 层析用凝胶的形状均为球形，内部具有高密度网孔，并能形成均一的柱床。2排阻极限(Exclusion Limit)排阻极限指不能扩散进入凝胶颗粒网孔内部的最小溶质分子的分子量大小。排阻极限的涵义是能有效分离一定形状分子的分子量最大极限。大于这一极限的所有分子，都在同一区带内被快速洗脱出。典型的葡聚糖凝胶Sephadex G-50(G50)排阻极限为3.0104,25,3分级分离范围(Fractionation Range)该物理性质表示某种凝胶允许溶质分子量在多大范围内能得到线性分离。如上所述的G50的分级分离范围
10、为1.51033.0104。4.得水率(Water Regain,Wr)每1g干凝胶吸收水的克数就叫得水率。对G50凝胶，其得水率为5.00.38，这个数值只表示吸进凝胶颗粒内部的水分，不包括凝胶周围的水分。,26,5床体积(Bed Volume)每1g干凝胶吸水膨化后的最后体积就叫床体积。6外水体积(Void Volume,V0)凝胶装柱以后，凝胶周围所有空间的总体积就叫外水体积。7洗脱体积(Elution Volume,Vc)指从柱床上将样品中某一物质洗脱下来所需洗脱液的总体积。,27,在凝胶层析中，最常用的四种凝胶是：葡聚糖凝胶(Dextran)、聚丙烯酰胺凝胶(Polyacrylami
11、ne)、琼脂糖凝胶(Agarose)以及后两者的复合凝胶。,28,凝胶排阻层析的应用 凝胶排阻层折的用途非常多，主要有以下两个方面：(1)脱盐 在生物大分子纯化过程中，常要除去无机盐、有机溶剂及其它小分子杂质，利用凝胶排阻分离是一种廉价、简便又快速的方法；(2)生物大分子纯化 凝胶层析应用最为广泛的一个方面是生物大分子的分离和纯化，因为凝胶具有根据分子量的大小而分级分离生物大分子的能力。,29,2 亲和层析(Affinity Chromatography)常规层析的不足 大多数层析法都是依据样品物质和固定相之间的非特异性相互作用，如根据样品物质的电荷性质、大小、极性、分配系数、吸附等作用的差别
12、进行分离的。由于选择性不够强，故分离效率不高。,30,近年来又发展了一种新的层析法“亲和层析法”，又称特异配基层析法”。一些生物大分子能和高分子化合物发生特异性的化学反应，这些反应是可逆的、特异的。根据这一性质所进行的分离就叫亲和层析。与生物大分子可逆而又特异性结合的分子就叫配基。,31,基本原理 亲和层析的原理可用一个亲和对来说明。如生物大分子抗体可以与其对应的抗原发生如上所述的亲和作用。若把抗原固定在类似于凝胶的固相载体上得到亲和固定相，在进行层析分离时，抗体与抗原间发生特异性的亲和作用，而其他的物质不能与固定相结合。因而被洗脱出。然后用一种特殊的洗脱剂把抗体从亲和柱上洗脱下来也可以固相抗
13、体来提纯、分离抗原。亲和层析已被广泛地用于酶类、运输蛋白、抗体、激素受体蛋白、药物结合蛋白、核酸、神经递质蛋白以及其它生物大分子物质的分离分析。,32,33,抗体亲和层析纯化示意图,34,亲和层析的成败取决于精细的实验条件的选择，其中最主要的是制备带有共价结合配基的固定相以及洗脱条件的优化。,35,亲和层析的固定相载体必须符合以下要求(1)在实验条件下具有化学及物理稳定性(2)非特异性吸附要尽可能小；(3)具有均匀的网状空隙结构；(4)具有和配基结合的活性基团。,36,亲和色谱的应用 基于羟基磷灰石固定相的亲和色谱可用于单链和双链DNA的纯化和鉴定。DNA与羟基磷灰石的相互作用基于DNA磷酸酯
14、骨架与羟基磷灰石中的钙离子间的相互作用。洗脱时用磷酸缓冲液，核酸分子的亲和性受其分子中磷酸基团的控制。单链DNA分子的结构可变无序，它与刚性有序的双链DNA分子相比，其亲和性要小。杂交的双链DNA及部分变性的DNA分子的亲和性适中。因此，单链DNA分子的结合弱，结合的双链DNA分子可以通过增加磷酸洗脱缓冲液的浓度使之解离。,37,3 离子交换色谱 离子交换色谱(Ion Exchange Chromatography,IEC)是生物大分子分级分离的最可靠的方法之一，它分离蛋白质、核酸等是依据生物大分子的电荷特性，因而依赖于系统的pH及分离物质的等电点(pI)。当缓冲溶液的pH高于生物分子的pI时
15、，应采用阴离子交换树脂，反之，应采用阳离子交换树脂。生物大分子非常小的电荷差异都可以用IEC法分离开。,38,4 反相疏水作用色谱法 反相色谱(Reverse-phase Chromatography,RPC)及疏水作用色谱(Hydrophobic Interaction Chromatography,HIC)法依据的是生物大分子表面疏水性。反相色谱是基于溶质、极性流动相和非极性固定相表面之间的疏水作用建立的一种色谱模式。而疏水作用色谱与反相色谱的原理相同，只是填料表面疏水性弱一些。,39,蛋白质及多肽的疏水基因一般包埋在分子的内部许多生物大分子尽管是亲水性的，但它们也有足够多的疏水基团暴露在
16、分子的表面，因而可以与载体表面的疏水基团发生相互作用。在上述两种技术中固定相都由具有疏水表面的色谱基质所组成，但与反相色谱相比，疏水作用色谱载体表而的疏水基团的密度要低得多，因而它的选择性高，洗脱强度相应低，有利于生物大分子的洗脱及生物活性的保持。高盐浓度可增强生物分子与载体的疏水相互作用.反相色谱法常作为一种制备色谱用于核酸相关的研究。,40,5.液液分配色谱 在液液分配色谱中，流动相和固定相均为液体，分离基于DNA分子在两种液相间的分配差异，但液体固定相是通过物理吸附或化学键合的方式固定在支持载体的表面上的。,41,常见的液液分配色谱中含有两种液体，如水合聚乙烯醇(PEG)和葡聚糖(DX)。PEG和DX之间由于缺乏相互作用而成为完全分离的两相，DX可以通过共价键键合固定在固相载体的表面而作为固定相。因此，DNA在两相间的分配系数主要依赖于溶质的表面积，即DNA分子的分子质量，但两相中所存在的离子的浓度及其性质会对DNA的分配产生极大的影响。当盐的浓度大于0.5 mol/L时，核酸在DX中的溶解度远远高于在PEG中的溶解度。这是由于阴离子和阳离子在两相间的不等价分配造成的。,
