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1、第二篇 目标产品的分离与纯化,第五章 细胞破碎、蛋白质复性和固液分离,细胞破碎,固液分离,初级分离(粗),纯化精制,下游技术基本过程,下游加工技术的重要性 1.产品分离纯化是最终获得商业产品的环节。2.投资费用高（抗生素、乙醇、柠檬酸占60%）。3.分离纯化技术落后会阻碍发酵工程技术的发展。,几种产品在发酵液中的浓度 产品 典型浓度（g/L）抗生素 25 氨基酸 100 酒精 100 有机酸 100 酶 20 蛋白质 10,下游加工技术的特点 1.发酵液的复杂性造成分离上的困难性。2.欲提取的产物通常浓度低且很不稳定。3.多为分批操作，各批发酵液不尽相同，要求下游加工有一定弹性。,产物提纯过程
2、的不同决定于：对象材料、目标产物特性及对其纯度的要求,第一节 概述,基因工程生物制品分离纯化:,工程菌经过大规模培养后，产生的有效成分含量很低，杂质含量却很高,分离纯化极其重要,基因工程药物从转化细胞、生产，对产品的纯度要求高于传统产品。,基因工程制品分离纯化的一般流程,初级分离：分离细胞和培养液，破碎细胞释放产物，溶解包含体（包涵体），复原蛋白质，浓缩产物，去除大部分杂质等过程。主要决定产物的得率。纯化精制：初级分离基础上，用各种高选择性手段，主要是各种层析技术，将目标产物和干扰杂质尽可能分开，使产物的纯度达到有关要求。主要决定产物的纯度。,产物提纯过程包括两个基本阶段：,第二节 细胞破碎,
3、目的：释放细胞内含物。分类：按照是否存在外加作用力分为机械法和非机械法。,问题：破碎率是否越高越好？,以大肠杆菌为宿主药物多为胞内产物,细胞破碎方法分类图,1、高压匀浆法,组成：高压泵和匀浆阀作用机理：高压泵将电机的旋转运动转变成匀浆阀柱杆的直线运动，从高压室（几十兆帕）压出细胞悬浮液，经过碰撞环的撞击后改变方向从出口管喷出，使细胞经历较高的流速下的剪切碰撞发生较大的变形，从而达到破碎细胞的目的。,高压匀浆阀结构示意图,进液口,出液口,阀座,碰撞环,阀杆,高压匀浆器,19.6-25.4MPa,适用于酵母和大多数细菌细胞的破碎,高压匀浆法动力学方程,破碎效率与匀浆阀结构、操作压力和破碎次数有关：
4、Ln(Rm/(Rm-R)=KNPaR：单位生物量释放出的产物量（mg/G)Rm：R的最大值；K：破碎速率常数；N：破碎次数；P：操作压力；a:与微生物性质有关的指数系数。,破碎率-操作压力-温度控制-能耗温度对活性物质的失活作用提高压力需增加能耗：3.5KW/100MPa移走热量需付出代价：23.8/100MPa,高压匀浆一般需多级操作，每次循环前往往进行级间冷却,匀浆过程中产生的热蛋白质和酶的失活,温控和能耗,堵塞（不适合团块状或丝状真菌），质地坚硬者如包含体易损伤匀浆阀，也不适用温度高易失活，能耗大。,存在的问题,2、高速珠磨法,原理：细胞和极细的研磨剂在搅拌桨作用下充分混合，珠子之间及珠
5、子与细胞之间互相剪切、碰撞，促使细胞壁破裂，释放内含物。,几种常见珠磨器,动力学方程,间歇操作:Ln(Rm/(Rm-R)=Ln(D)=Kt 其中，D=(1+K1/j)j连续操作：Ln(Rm/(Rm-R)=KV/f=K上式中，t是破碎时间；K、K1、K是破碎速度常数；V是破碎室内悬浮液的体积；f是进料速度；是平均停留时间；j是破碎时全混釜的数目，反映破碎室内悬浮液的流动状况。,采用夹套冷却的方式实现温控,效果较好;能耗与细胞破碎率成正比;,问题：高压匀浆比珠磨法破碎细胞的效果好？,温控和能耗,高压匀浆法与高速珠磨法的比较,X-Press挤压机，把浓缩的细胞悬液冷却至-25-30，形成冰晶，用50
6、0MPa以上的高压冲击，使冷冻细胞从高压阀孔中挤出，冰晶体磨损和包埋在冰中的细胞变形引起细胞破碎。其优点是细胞碎片粉碎程度低，生物活性保持较好。,3、超声破碎,机理：声频高于1520kHz的超声波在高强度声能输入时可以进行细胞破碎，破碎机理尚未清楚，可能与空化现象引起的冲击波和剪切力有关。破碎效率与声频、声能、处理时间、细胞浓度及菌种类型等因素有关。优点：操作简便，液量损失少存在问题：使敏感物质变性失活，噪声大，大容量时效率低，应用潜力有限。,空化现象：在强声波作用下，引起气泡形成，胀大和破碎的现象。,锡箔纸测试空化强度与空化密度,看得到的空化现象,超声波破碎仪,大功率超声波破碎仪,4、化学渗
7、透法,作用机理：某些有机溶剂，抗生素，表面活性剂，金属螯合剂，变性剂等化学药品都可以改变细胞壁或膜的通透性，从而使内容物有选择地渗透出来，这种处理方法叫渗透法。问题：EDTA、甲苯、Triton X-100、盐酸胍和脲的作用机理？,P70,EDTA：破坏细胞的外层膜甲苯：溶解细胞膜的磷脂层Triton X-100：溶解内膜的双磷脂层盐酸胍和脲：削弱溶质分子间的疏水作用，使疏水性化合物溶于水溶液,优点（相对机械破碎）：对产物释出有一定的选择性；细胞保持完整，碎片少，利于进一步提取；核酸释放量少，黏度低，便于进一步分离。缺陷：时间长，效率低；化学试剂有毒；通用性差,5、酶溶法,机理：利用生物酶将细
8、胞壁和细胞膜消化溶解。常用的溶酶：溶菌酶(lysozyme)、-1,3-葡聚糖酶(glucanase)、-1，6-葡聚糖酶、蛋白酶（protease)、甘露糖酶(mannanase)、肽链内切酶（endopeptidase)、壳多糖酶(chitinase)、细胞壁溶解酶（几种酶的复合物）等。,优点：一定的选择性；细胞外形完整，核酸释放少，有利于进一步分离过程 缺点：（只能用于实验室）产物抑制造成效率低下；溶酶价格高；通用性差，不易确定最佳条件；,6、微波加热法,机理：微波加热导致细胞内极性物质，尤其是水分子吸收微波能，产生大量热量，使胞内温度迅速上升，液态水汽化产生的压力将细胞膜和细胞壁冲裂，
9、形成微小孔洞，进一步加热可导致细胞内部和细胞壁水分减少，细胞收缩，表面出现裂纹。,优点：微波穿透性强，选择性高、加热效率高。缺陷：一般只适合对热稳定物质的分离；被处理的物料要具有良好的吸水性；不适于富含淀粉和树胶等的天然植物,机械破碎法与非机械破碎法的比较,克隆表达的产物,基因工程细胞,蛋白质,没有活性，一级结构正确，立体构型错误，无生物学活性！包涵体,第三节 蛋白质复性,难溶于水，只有在变性剂溶液中才能溶解。,病毒在增殖的过程中，常使寄主细胞内形成一种蛋白质性质的病变结构包涵体,SEM of E.coli containing inclusion bodies,SEM of isolated
10、 washed inclusion bodies,包含体形成原因：（比较复杂，目前尚不完全清楚。）缺少某些协助因子（分子伴侣？）或者由于周围物理环境（温度等）不适，使其难以连续进行次级键的形成，中间产物相互凝集而积累形成包含体。应该考虑的事：设法减少包含体的形成！,减少包涵体形成的策略1、降低重组菌的生长温度 降低培养温度是减少包涵体形成的最常用的方法，较低的生长温度降低了无活性聚集体形成的速率和疏水相互作用，从而可减少包涵体的形成。,培养E.coli时添加高浓度的多醇类、蔗糖或非代谢糖可以阻止分泌的蛋白质聚集反应，在最适浓度范围内添加这些添加剂不会影响细胞的生长、蛋白质的合成或运输，其它促重
11、组蛋白质可溶性表达的生长添加剂还有乙醇（诱导热休克蛋白的表达）、低分子量的巯基或二硫化合物（影响细胞周质的还原态，从而影响二硫键的形成）和NaCl。,3、供给丰富的培养基，创造最佳培养条件如供氧、pH等。,2、添加可促进重组蛋白质可溶性表达的生长添加剂,蛋白质的复性：包含体蛋白质溶解于变性剂溶液中，呈变性状态，所有的氢键、疏水键全部被破坏，疏水侧链完全暴露，但一级结构和共价键不被破坏，当除去变性剂后，一部分蛋白质可以自动折叠成具有活性的正确构型，这一折叠过程称为蛋白质复性。,如何使包涵体的构型复原成正确状态？,包含体的分离及溶解,分离包含体：对培养收集的细胞进行破碎(高压匀浆结合溶菌酶处理)，
12、然后离心(500020000g/r)，可使大部分包涵体沉淀，与可溶性蛋白分离。洗涤：除去包涵体沉淀的脂类和膜蛋白，一般加去污剂（Triton X-100或脱氧胆酸钠）和低浓度变性剂（2mol/L尿素或盐酸胍等）。以避免包涵体溶解和复性的过程中重组蛋白质的降解。,溶解：包涵体的溶解必须用很强的变性剂，通过离子间的相互作用破坏包涵体蛋白间的氢键而增溶蛋白。以异氰盐酸胍的增溶效果最强，尿素稍差；去污剂（如SDS）可以破坏蛋白内的疏水键，可以增溶几乎所有的蛋白，但由于无法彻底去除而不允许用在制药行业中；酸（如70%甲酸）可以破坏蛋白的次级键从而增溶蛋白，这种方法只适合少数蛋白质。,对于含有半胱氨酸的蛋
13、白，在增溶时应加入还原剂（如DTT、GSH、-ME）打开蛋白质中所有二硫键，对于没有二硫键的目标蛋白有时也应使用还原剂，因为含二硫键的杂蛋白会影响包涵体的溶解。同时还应加入金属螯合剂，如EDTA或EGTA，用来螯合Cu2+、Fe3+等金属离子以防止其与还原状态的巯基发生氧化反应。,蛋白质的折叠机理,目前有多种不同的假设，但很多学者认为有一个“熔球态”的中间状态，在“熔球态”中，蛋白质的二级结构已经基本形成，其空间结构也初具规模，再做一些局部调整就可形成正确的立体结构。,蛋白质的具体步骤可用下式描述：伸展态中间体后期中间体天然态体聚集体,核糖核酸酶的变性和复性示意图(A)天然核糖核酸酶(B)变性
14、失活(C)“错乱”核糖核酸酶,错误发生的机制复性过程中，部分折叠中间体的疏水簇外露，分子间的疏水相互作用会导致蛋白质聚集。伸展肽链折叠为天然活性结构的过程受到周围环境的影响，如温度、pH值、离子强度、复性时间等因素的影响。,不同条件下具体复性方式,1、透析、稀释和超滤复性法：最传统、应用最普遍，原理-使变性剂浓度降低到蛋白质能恢复折叠的浓度。缺点：复性活性回收率低，而且难与杂蛋白分离。稀释法大大增加溶液体积，不利于后续的分离纯化，且处理量太大，不利于工业放大；透析法耗时长，易形成无活性蛋白质聚集体；超滤法在膜上聚集变性，易造成膜污染。,2、高蛋白浓度下的复性方法：（一个成功的复性过程在于能够在
15、高蛋白浓度下仍能得到较高的复性率。）缓慢地连续或不连续地将变性蛋白加入到复性缓冲液中,使得蛋白质在加入过程中或加入阶段之间有足够的时间进行折叠复性。因为完全折叠的蛋白通常不会与正在折叠的蛋白一起聚集。,温度跳跃策略：变性蛋白在低温下复性折叠以减少聚集，直到易聚集的中间体大都转化为不易聚集的后期中间体后，温度快速升高来促进后期中间体快速折叠为蛋白的天然构象。,复性在中等的变性剂浓度下进行，变性剂浓度应高到足以有效防止聚集，同时又必须低到能够引发正确复性。,3、添加促进剂的复性方法：包涵体蛋白质折叠复性促进剂的促进作用可以分为：稳定正确折叠蛋白质的天然结构、改变错误折叠蛋白质的稳定性、增加折叠复性
16、中间体的溶解性、增加非折叠蛋白质的溶解性。,常用促进剂：a、共溶剂：如通过与中间体特异的形成非聚集复合物，阻止蛋白质分子间的相互碰撞机会，减少蛋白质的聚集；b、去污剂及表面活性剂：如Trition X-100、CHAPs、磷脂、磺基甜菜碱等对蛋白质复性有促进作用，但它们能与蛋白质结合，很难去除；c、氧化-还原剂：对于含有二硫键的蛋白，复性过程中应加入氧化还原体系，通过促进不正确形成的二硫键快速交换反应，提高了正确配对的二硫键的产率；d、小分子的添加剂：如盐酸胍或尿素、烷基脲、碳酸酰胺类等，都可阻止蛋白聚集。e、0.40.6M L-Arg：L-Arg能使得不正确折叠的蛋白质结构以及不正确连接的二
17、硫键变得不稳定，使折叠向正确方向进行，可大幅度地提高包涵体蛋白质的折叠效率。,9,f、添加分子伴侣和折叠酶g、人工伴侣h、单克隆抗体I、其它：多聚离子化合物、甘油等。,此外，有：,4、液相色谱（LC）复性法：疏水相互作用色谱（HIC）、离子交换色谱（IEC）、凝胶排阻色谱（SEC）、亲和色谱（AFC）已成功的对变性蛋白进行了复性。其中HIC的分离效果较理想；SEC最差；盐酸胍会在IEC柱上保留，与蛋白一起洗脱下来；AFC使用范围窄、所需时间长、价格昂贵，。,变性蛋白在HIC上的复性机理：当蛋白质、变性剂和杂蛋白进入HIC系统后，变性剂在柱上的作用力较弱，变性蛋白质的作用力较强，变性剂首先同变性
18、的蛋白质分离，随流动相一起流出色谱柱。随着流动相的不断变化，变性蛋白质不断地在固定相表面上进行吸附-解吸附-再吸附，并在此过程中逐渐被复性，形成与天然蛋白质构象相同的蛋白质，并流出色谱柱。,液相色谱复性的优点：（与传统的稀释法和透析法相比）在进样后可很快除去变性剂；色谱固定相对变性蛋白质的吸附可明显的减少、甚至完全消除变性蛋白质分子在脱离变性剂环境后的分子聚集，从而避免了沉淀的产生，提高蛋白质复性的质量和活性回收率；在蛋白质复性同时，可使目标蛋白质与杂蛋白分离达到纯化的目的，使复性和纯化同时进行；便于回收变性剂，降低废水处理成本。,5、反胶束复性法：表面活性剂的极 性头朝内，疏水 的尾部向外，
19、中 间形成极性的“核”,有机溶剂,极性“头”,极性的“核”,非极性“尾”,蛋白质在反胶束内水相中可以保持其构象和活性，这样可使蛋白质相互分离，减少了蛋白质折叠过程中的聚集作用。,第四节 固液分离,分离细胞、细胞碎片、包含体、沉淀物等的手段，不仅应用于初级阶段，而且也应用于精制阶段。,一、离心沉降,根据固体和液体之间的密度差,利用离心机提供的离心力实现固液分离。优点：技术易掌握；结果重复性好沉降的难易取决于固体物质和液体的密度差,同时还取决于固体和液体的其他性质以及离心机的离心能力.(可以颗粒沉降速度表示),斯托克斯公式(Stokes):Uc=d2(s-L)r2/18Uc颗粒沉降速度;d颗粒直径
20、(假定为球形)s固体密度L液体密度r离心半径;角速度;(r2:离心力)液体粘度,分离因数:a=(r2:离心力)/ga衡量离心力的大小主要指标,应该主要是增大角速度而不是直径。提高离心效果可通过增加转速和延长时间来取得。,(r2:离心力):固液分离最重要的影响因素,转筒常规工业用离心机（-张家港华大离心机公司）,SSC型离心机为三足式上部人工卸料沉降离心机，该系列离心机装鼓壁上无孔，属沉降型转鼓，操作维修方便。主要适用于固相颗粒细小，悬浮液粘性较大，过滤介质再生困难，且含量较少的悬浮液的固液分离。,管式工业用离心机（-张家港华大离心机公司）,悬浮液从进料管进入转鼓，固相颗粒在离心力场作用下受到离
21、心力的加速沉降至转鼓内壁，沉降的颗粒在螺旋输送器叶片的推动下，从（直筒段）沉降区通过（锥段）干燥区至固相出口排出；经澄清的液相从溢流孔溢出。从而实现固、液相自动、连续的分离。可应用于脱水、浓缩、分级澄清等不同场合。,刮刀卸料工业用离心机（-张家港华大离心机公司）,主电机带动套装的内外转鼓全速旋转，物料由进料管引入转鼓，在离心力作用下，液相物穿过滤布和内转鼓壁滤孔排出内转鼓，汇集到内外转鼓间的间隙内，穿过到虹吸室的通孔进入虹吸室，再由虹吸装置抽走排出机外。固相物截留在内转鼓形成环形滤饼层。进料达到预定容积后停止进料，进一步分离，此时可进行洗涤。洗涤、分离结束，刮刀自动旋转，将固相物刮下经输料螺旋
22、排出机外，然后自动洗网，开始下一个循环。,二、微孔膜过滤,根据流体各组分尺寸大小的不同，利用高分子聚合膜，过滤分离微米级的细胞、细胞碎片和生物大分子的过程。,何谓微孔膜过滤？,切割分子量?MWCO,微滤（0.110m)：分离固体颗粒超滤（0.0010.1m)：浓缩大分子物质反渗透（0.001m)：从小分子中脱除水分,微孔膜过滤的3种方式：,缺点：技术难以掌握，影响因素多；稳定性和重复性不好；膜堵塞问题难以解决！,微孔膜过滤特点,优点：容易做到封闭式操作，不受环境污染设备投资少，操作安全；加工量可大可小，十分方便；有利于分离密度差小而难以离心的固体，可直接用于下游的层析过程。,微滤技术要点：,选
23、择合适的膜：不与蛋白质、脂类等发生吸附；孔径合适。,微滤技术要点：,2.选择合适的操作条件：过滤方程（达西公式）：V=P/(Rc+Rm)V：过滤速度，P：压力差，：滤液粘度，Rc：滤饼阻力，Rm：过滤介质（膜）的阻力。,P恒定，Rc增加，V降低 保持V不变则需阻止滤饼生成或不增厚。若Rm和不变，则V恒定，因为P增加会加大Rc。,3.膜材料的新发展无机陶瓷膜,优点：（机械强度大、惰性更大）孔径均匀，过滤效果好；耐蒸气消毒、耐酸碱和有机溶剂；坚固耐用，使用寿命长；可以加压反向冲洗,缺点：造价高；过滤面积小；表现对蛋白质一定的吸附；,各种微孔膜柱及设备,各种微孔膜柱及设备,操作方式,切向流过滤：（悬
24、浮液沿与滤膜水平的方向流动，因此过滤过程中不断带走堆积在介质表面的固体物质，不会形成滤饼层而使膜堵塞。）一种维持恒压下高过滤速度的技术。,原理：当移走固体与固体沉积速率相同时，过滤速度就保持恒定，控制不同的切向流速度就可以得到不同的过滤速度。,Sartocon Slice整体型切向流过滤系统,德国Sartorius Vivaflow 50 回旋流/切向流超滤器,在膜表面加以搅拌造成流动,使膜相对于悬浮液运动（将膜附于圆筒上高速旋转）,切向流过滤的缺点,产生的剪切力使蛋白质产物失活，流速越快，失活越严重；悬浮液在流动过程中有压力损失，能耗消耗大；不能避免膜的污染和堵塞，当膜的阻力增大时，无法防止
25、过滤速度的下降；,、脉冲反洗切向流过滤,原理：在切向流过滤中间歇地在膜的背面加一反压，迫使部分滤液反透过膜以冲掉膜上的固体沉积和膜孔中的堵塞物，使过滤速度保持在比较高的水平。,、调整生化悬浮液的性质,调整pH值和离子强度；加入絮凝剂；加入过滤助剂（硅藻土系列）,三、双水相萃取,原理：利用被提取物在二相中的分配不同实现分离目的。由于蛋白质在有机相中容易失活，因此采用的二相均为亲水相，如PEG/葡聚糖、PEG无机盐等，称为双水相，两相密度不同，轻相富含一种高分子，重相可能富含另一高分子，细胞碎片和蛋白质在二相间的分配系数不同，从而实现分离的目的。清除细胞碎片比一般离心和过滤法优越。,PEG?(聚乙
26、二醇),双水相萃取的一般考虑,一般的原则：将碎片分配在下层(调节和无机盐浓度比例，可以控制细胞碎片在上下层间的分配)，其好处有：核酸等大部分杂质一般处于下相，可以一并除去；下相是无机盐富集相，作为废弃物成本低些；蛋白质保持于上相的层有利于其活性的保持；碎片在下相有利于离心机的连续分离；,双水相萃取的一般考虑,最困难的是如何使需要的蛋白质尽量集中在上相。,因此要考虑:浓度；分子量；盐和pH值,四、泡沫分离法,表面活性强的物质优先吸附于分散相（气相）与连续相（液相）的界面处，被气泡带出连续相而达到浓缩。,泡沫分离操作简单、耗能低，适于较低浓度下的分离。,原理：基于溶液中溶质（或颗粒）间表面活性的差
27、异进行分离。,影响泡沫分离的主要因素,表面活性剂的浓度气速pH值离子强度泡沫层高度,1）细胞收集或去除 用鼓泡法从发酵液或细胞悬浮液分离细菌和酵母的细胞有较多的研究，还有一些从培养液中收集孢子、藻类细胞或从废水中除去微生物细胞的报道。2）蛋白质和多肽、酶的提取分离 处于研究阶段，未见应用报道3）中药有效成分的分离提取 中药含有多种表面活性物质，如蛋白质高分子物质和皂苷类小分子物质。研究表明甘草中的甘草酸可用泡沫分离法加以浓缩。植物细胞培养液中的次生代谢产物可用泡沫分离法进行分离浓缩。,应用：在生物技术领域主要用于细胞收集或去除、蛋白质和酶的提取及天然产物的浓缩和分离。,避开固液分离的探索-扩张床吸附,流化床?,问题,举例说明机械法和非机械法破碎细胞的分类,基本原理及优缺点。试述包含体复性的主要方法及优缺点。,写出斯托克斯公式,分析其基本意义.从该公式分析离心的主要条件.从达西公式分析利用膜进行固液分离要注意的问题。试述双水相萃取的原理及需要考虑的问题。,
