《生物活性物质分离技术ppt课件.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《生物活性物质分离技术ppt课件.ppt（46页珍藏版）》请在三一办公上搜索。
1、生物活性物质分离技术（II）,丁国斌山西大学生物技术研究所电话：18135105659E-mail：,发现青蒿素 屠呦呦获国际医学大奖2011年度拉斯克奖,中国中医科学院授予屠呦呦杰出贡献奖(2011),证明了从传统药物获得确定化学成分药物的价值。,青蒿素（artemisine）是从中药黄花蒿中提取的有过氧基团的倍半萜内酯抗疟新药。青蒿素是中国发现的第一个被国际公认的天然药物，在其基础上合成了多种衍生物，如双氢青蒿素、蒿甲醚、青蒿琥酯等。青蒿素类药物毒性低、抗疟性强，被WTO批准为世界范围内治疗脑型疟疾和恶性疟疾的首选药物。,黄花蒿(Artemisia annua Linn),1971年首先从
2、黄花蒿中发现抗疟有效提取物,1972年又分离出新型结构的抗疟有效成分青蒿素,1979年获国家发明奖二等奖,2011年9月获得拉斯克临床医学奖,天然产物的活性成分是由复杂的化学物质组成的，一般认为具有药用价值的物质主要有生物碱、萜类、甾体、黄酮类、蒽醌类、苷类、香豆素类、有机酸、单糖、低聚糖、氨基酸、蛋白质、酶等。天然产物的提取、分离就是利用某种介质尽量使需要的成分和不需要的成分分开，即将具有生理活性的有效成分从天然有机化合物中分离的过程。,概述,生物碱（alkaloid）是一类含氮碱基的化合物，能与有机酸反应生成盐类，有类似碱的性质，是天然的含氮有机化合物（蛋白质、肽类、氨基酸及维生素B除外）
3、。生物碱除少数来自动物，如肾上腺素等，大都来自植物，以双子叶植物最多。生物碱存在于植物体的叶、树皮、花朵、茎、种子和果实中，分布不一。,生物碱(alkaloid),喜树碱Mn:348.34,10-羟基喜树碱（HCPT）Mn:364.35,萜类化合物是自然界存在的一类以异戊二烯为结构单元组成的化合物的统称，也称为类异戊二烯。该类化合物在自然界分布广泛、种类繁多，迄今人们已发现近3万种萜类化合物，其中有半数以上是在植物中发现的。,萜类(terpenoids),2-甲基-1,3-丁二烯，异戊二烯,甾体化合物具有一个四环的（A、B、C、D）母核，这个母核像“田”字，并且在C10和C13处各有一个角甲基
4、，在C17处有一侧链，这样在母核上的三个侧链像“巛”字，“甾”字十分形象的表示了这类化合物，是广泛存在于自然界中的一类天然化学成分。,甾体(steroid),甾体母核,黄酮类化合物系色原酮的衍生物。现代黄酮的定义为：凡两个苯环（A环、B环）通过三碳链相互联结而成的一类成分称为黄酮类化合物，绝大多数为黄色。,黄酮类化合物(flavonoids),色原酮,槲皮素,柚皮素,蒽醌类化合物的基本母核为蒽醌，母核上常有羟基、羟甲基、甲基、甲氧基和羧基等取代基。在天然产物中，蒽醌常存在于高等植物的蓼科、豆科、茜草科和低等植物地衣类和菌类的代谢产物中。蒽醌类具有止血、抗菌、泻下、利尿的作用。,蒽醌类化合物(A
5、nthraquinone),1,2-蒽醌,1,4-蒽醌,9,10-蒽醌,在进行植物成分提取分离前，应重视所用植物品种的鉴定、来源和采集季节，并查阅有关文献资料，了解前人对该植物或同属植物中化学成分的分离条件，加以分析，吸取可以借鉴的经验，这会给提取分离工作带来重要的启示。通过化学成分的预试验及探索性实验，再选择设计适当的提取、分离方法，不仅可以保证所需有效化学成分的提出，还可以尽量避免杂质的干扰。,天然产物的提取方法很多，按照形成的先后和应用的普遍程度可以分为经典提取及分离方法和现代提取及分离方法。经典提取及分离方法是指出现时间较早且迄今一直被普遍采用的传统方法，即一般提取分离方法。一般提取分
6、离方法包括溶剂提取法、水蒸气蒸馏法、吸附法、盐析法、透析法、沉淀法、结晶法等，不需要特殊的仪器设备，操作简便易行。这些传统的提取和分离方法应用广泛、工艺简单、成本低廉，所以至今仍为经典。,经典提取分离方法,1、溶剂提取法,溶剂法是最常用的提取方法，它采用“相似相溶”的原理，一般选用对所需成分溶解度大而对其他成分溶解度小的溶剂将所需成分从植物组织内溶解出来。该法是提取中药有效成分最常用的方法。天然产物的提取、分离就是利用某种介质尽量使需要的成分和不需要的成分分开，即将具有生理活性的有效成分从天然有机化合物中分离的过程。,溶剂的选择,根据天然产物有效成分的结构特点可以选择惰性溶剂和反应溶剂进行提取
7、。惰性溶剂是指水、乙醇等与化合物基本不起化学反应的溶剂，常用甲醇、丙酮、氯仿、乙酸乙酯等有机溶剂；反应溶剂通常是稀酸、稀碱的水溶液或醇溶液等，内酯类化合物通常利用此类溶剂与其它杂质分离。一般来说，天然产物有效成分在溶剂中的溶解度与溶剂的性质有直接关系，同样也与其分子结构有关。适宜溶剂的选择必须符合以下要求：与植物中的化学成分不起化学反应；对所需成分溶解度大而对杂质溶解度小或反之；经济易得，使用安全，可回收，不污染环境；沸点适中，便于回收重复利用。,常见溶剂的极性强弱可根据介电常数大小来判断，介电常数越大，溶剂极性越强。常见溶剂的极性强弱顺序如下：石油醚 二硫化碳 四氯化碳三氯乙烷 苯 二氯甲烷
8、氯仿 乙醚乙酸乙酯丙酮乙醇甲醇 乙腈水 吡啶 乙酸。强极性溶剂（水）优点：价廉易得，极性强，穿透力强，溶解范围广，如中药中常见的苷类、分子量较小的糖类、氨基酸、蛋白质、生物碱盐类及有机酸盐类等。缺点：进一步分离困难较大（提取液中含有无机盐、蛋白质、糖等较多水溶性杂质），提取液含杂质较多，不宜保存，浓缩困难（水提取液含有皂苷及黏液类成分时会产生泡沫）。,溶剂的极性,亲水性有机溶剂 主要是指甲醇、乙醇及丙酮等。其中乙醇最为常用，它可以溶解生物碱及其盐、苷类及苷元、萜类、木质素、挥发油、树脂、色素、有机酸等。优点：既可溶于水，又可以任意比与亲脂性有机溶剂相混溶；用量少，提取时间短，溶出的水溶性杂质少
9、；对亲脂成分溶解度较好；乙醇提取液毒性小、价格便宜，沸点适中，可重复使用，还具有杀菌作用，不易发霉变质；易浓缩保存。缺点：易燃，甲醇毒性大。,溶剂的极性,亲脂性有机溶剂 主要有石油醚、己烷、苯、乙醚、氯仿、正丁醇等。优点：选择性强，渗入植物组织能力较弱，不易溶出亲水性杂质。极性小，可用于提取亲脂性成分，如挥发油、油脂、叶绿素、树脂、植物甾醇、内酯、某些生物碱及某些苷元等。提取液含杂质少，易于浓缩。缺点：若植物材料还有较多水分，则难以溶出其有效成分，且其挥发性较大，大多易燃、有毒、价格昂贵。,溶剂的极性,天然产物有效成分的提取效果主要取决于提取试剂、提取方法和提取工艺的选择，原料、温度、时间等也
10、有不同程度的影响。（1）材料 大小、状态（2）提取温度 适宜的温度（3）提取时间 水加热煮沸0.5-2 h，乙醇加热提取1 h。（4）浓度差 搅拌、更换溶剂,影响提取效率的因素,2、水蒸气蒸馏法,水蒸气蒸馏法是将与水不互溶的被蒸馏分在比原沸点低的温度下沸腾，随水蒸气一同蒸馏出来，经冷凝后进行分离的一种方法。只有当被提取物中的挥发性成分不溶或难溶于水，于100 左右时有一定蒸汽压，在沸腾时与水能长期共存且不发生化学变化时，才能采用水蒸气蒸馏法。该法是目前挥发油提取中应用较为普遍的方法之一。,挥发油又称精油，英文为 essential oils，是存在于植物中的一类具有芳香气味、可随水蒸气蒸馏出来
11、而又与水不相混溶的挥发性油状成分的总称。挥发油为一混合物，其组份较为复杂。主要通过水蒸气蒸馏法和压榨法制取精油。挥发油成分中以萜类成分多见，另外，尚含有小分子脂肪族化合物和小分子芳香族化合物。,挥发油,3、分馏法,分馏是一种高级的蒸馏方法，根据天然产物中各有效化学成分的沸点不同，用分馏柱代替普通的蒸馏头，可将液体混合物从低沸点成分到高沸点成分依次进行常压或减压分馏，从而达到分离、精制纯化的目的。分馏法在天然产物提取分离中应用较为广泛。,4、吸附法,固体物质表面或液体表面对气体或液体中溶质的附着现象称为吸附。吸附法的目的，一是吸附色素、鞣质等杂质，二是用氧化铝、氧化镁、酸性白土和活性炭等吸附剂处
12、理样品，吸附所需物质。吸附剂是决定分离效果的首要因素。活性炭常用于食品工业的脱色、脱臭和净化等。硅胶易吸附极性物质，能吸附水分，难吸附非极性物质。分子筛是一种非极性吸附剂，常用于深度干燥。,5、盐析法,盐析法通常是指向水提取液中加入易溶性无机盐至一定浓度或达到饱和状态，降低植物中某些化学成分在水中的溶解度，并以沉淀形式析出或被有机溶剂提取，从而达到与水溶性杂质分离的方法。常用作盐析的无机盐有氯化钠、氯化铵、硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁等。,6、透析法,利用提取液中小分子或离子易通过半透膜、大分子物质不能通过半透膜的性质，进行分离、精制的方法，称为透析法。透析法常用于分离、纯化皂苷、多糖、蛋白质和多肽
13、等化合物，并且可以除去其中的无机盐、单糖、双糖等。反之，也可以将大分子的杂质留在半透膜内，而小分子物质透过半透膜进入膜外溶液，从而加以分离。,7、升华法,固体物质在受热时不经过熔融直接转化为蒸气，蒸气遇冷后又凝结成固体的现象叫做升华。植物中凡具有升华性质的化合物均可用此法进行纯化。中药中有一些成分具有升华的性质，能利用升华法直接从中药中提取出来。如樟木中的樟脑、茶叶中的咖啡因及植物材料中的苯甲酸等。此法操作简便，但因为直接用火加热易焦化，常伴有分解现象，提取不完全，产率低，很少用于大规模制备。,8、萃取法,萃取法是用来提取或纯化有机化合物的常用方法之一。利用物质在不同溶剂中的溶解度不同（在萃取
14、剂中的溶解度远大于在原溶剂中的溶解度），把固体或液体混合物提取分离的操作方法叫做萃取。萃取法可以分为液-液萃取、固-液萃取。萃取剂的选择对萃取效果影响很大，主要依据为“相似相溶”原理。若有效成分是亲脂性物质，可用石油醚、苯等有机溶剂萃取偏于亲水性的物质，在亲脂性溶剂中难溶，多用乙酸乙酯、丁醇、戊醇等弱亲脂性溶剂作为萃取剂。,9、沉淀法,在样品溶液中加入某些溶剂或沉淀剂，通过化学反应或改变溶液的pH值、温度等条件，使某些天然产物有效成分以沉淀形式被分离的方法叫做沉淀法。根据沉淀剂和沉淀条件的不同，沉淀法主要分为两类：溶剂沉淀和沉淀剂沉淀。沉淀反应是可逆的，能否使有效成分从溶液中析出，主要取决于被
15、分离物质的溶解度。沉淀剂需根据天然产物有效成分的结构特点来选择。铅盐沉淀法是经典的分离、提纯方法之一。常用醋酸铅、碱式醋酸铅等作为沉淀剂，利用中性醋酸铅和碱式醋酸铅在水及醇溶液中能与多种天然产物成分生成难溶的铅盐或络盐沉淀而与其他成分分离。,10、结晶法,通过溶解、除杂、静置等操作，析出结晶物质的过程称为结晶。大多数天然化学成分达到一定浓度时，选择合适的溶剂都能结晶。根据其溶解度的不同，利用反复结晶的方法，从不纯的晶体中制得纯度高、晶形好的结晶物的过程称为重结晶。纯化合物的结晶有一定的熔点和结晶学特征，有利于化合物性质的判断。利用结晶法提纯化合物的关键在于溶剂及温度等结晶条件的选择。,色谱法又
16、叫色层法，旧称层析法，是分离、提纯和鉴定有机化合物的重要方法之一。俄国植物学家茨维特 色谱法是利用不同物质在固定相和流动相中不同的分配系数进行分离的一种方法。根据分离时流动相所处的状态，可分为液相色谱和气相色谱。按其分离原理分类，有吸附色谱（利用吸附剂表面对不同组分吸附性能的差异达到分离目的）、分配色谱（利用不同组分在流动相和固定相之间的分配系数不同而分离）、排阻色谱（利用分子大小不同而阻滞作用不同进行分离）、离子交换色谱（利用不同组分对离子交换剂亲和力不同进行分离）等。,色谱分离方法,分配系数：指一定温度下，处于平衡状态时，组分在固定相中的浓度和在流动相中的浓度之比，以K表示。,1、硅胶色谱
17、,硅胶是最常用的吸附剂之一，适用范围广，既能用于极性化合物，也能用于非极性化合物。硅胶属于多孔性物质，可用通式SiO2xH2O表示。硅胶色谱法的原理是根据被分离物质在硅胶上的吸附力的不同而得到分离，一般情况下极性较大的物质容易被硅胶吸附，极性较弱的物质不易被硅胶吸附，整个色谱分离过程就是吸附、解吸、再吸附、再解吸的过程。流动相的选择：被分离物质和流动相之间的极性关系应符合“相似相溶原理”。,2、氧化铝色谱,氧化铝是氢氧化铝在高温下（约600）脱水制得。氧化铝色谱适用于亲脂性成分的分离，具有廉价、分离效果好、活性易控制等优点。适合分离生物中的碱性成分如生物碱，但不宜用于醛、酮、酯和内酯等类型化合
18、物的分离，因为有时碱性氧化铝可与上述成分发生次级反应，如异构化、氧化和消除反应等。目前除了生物碱等碱性物质，很少用氧化铝色谱，基本上被硅胶色谱取代。流动相的选择：同硅胶色谱，极性溶剂的洗脱能力较非极性溶剂大，所以逐步递增溶剂的极性，可使吸附在氧化铝柱上的不同化合物依极性大小依次洗脱，达到分离目的。,活性炭一般分为动物炭、植物炭和矿物炭三种，分别采用动物的骨头、木屑、煤屑高温炭化而成。活性炭色谱主要用来分离水溶性物质，对生物中的氨基酸、糖类及某些苷类等成分具有较好的分离效果。该法具有上样量大、分离效果好、来源容易、价格便宜等优点，适用于大量制备性分离。但由于活性炭生产原料、制备方法不同，因而迄今
19、尚无理想的测定其吸附力的方法。在一定条件下，活性炭对不同物质吸附力也不同，一般有如下规律：对芳香族化合物的吸附力大于脂肪族化合物；对大分子化合物的吸附力大于小分子化合物；对极性基团多的化合物的吸附力大于对极性基团少的化合物。,3、活性炭色谱,离子交换色谱是通过固定相表面带电荷的基团与样品离子和流动相离子进行可逆交换、离子-偶极作用或吸附而实现分离的一种方法，主要用于分离离子型化合物。离子交换剂是一种不溶性的高分子化合物，其分子中具有解离性离子交换基团，外观均为球状颗粒，不溶于水，但可在水中溶胀。离子交换树脂由母核部分和离子交换基团两部分组成。母核部分是苯乙烯通过二乙烯基苯交联而成的大分子网状结
20、构。离子交换基团有羧基、氨基、磺酸基等。离子交换树脂可分为两大类，即阳离子交换树脂与阴离子交换树脂。阳离子交换树脂中含有活泼的酸性基团，能交换阳离子；阴离子交换树脂中含有活泼的碱性基团，能交换阴离子。,4、离子交换色谱,离子交换色谱,阳离子交换树脂：强酸型-SO3H；弱酸型-COOH，-PO3H阴离子交换树脂：强碱型-N(CH3)3X；弱碱型-NR2，-NHR，-NH2。影响离子交换效果的主要有以下因素：（1）溶液的酸碱度 溶液酸碱度对于离子交换有很大影响。当交换溶液中氢离子的浓度显著增高时，因同离子效应，抑制了阳离子交换剂中酸性基团的解离，离子交换反应就很少进行。通常强酸型交换剂交换液的pH
21、值应大于2，弱酸型交换剂的交换液pH值应大于6。强碱型小于12，弱碱型应小于7。（2）交换离子的选择性 离子交换剂对交换化合物来说，主要取决于化合物解离离子的电荷、半径及酸碱性的强弱。解离常数大、酸碱性强者容易置换，但洗脱相对来说较难。解离电子价数越高，电荷越大，它的吸附性越强，越易在交换树脂上交换。（3）被交换物质在溶液中的浓度 交换浓度低的溶液对离子交换剂的选择性大，高浓度时解离度会趋向减少，有时候会影响吸附次序及选择性；浓度过高时，亦会引起树脂表面及内部交联网孔收缩，影响离子进入网孔。因此一般实验操作时所用溶液浓度应略高，有利于提取分离。,离子交换色谱,（4）温度 稀溶液温度的改变对交换
22、性能的影响不大，但在0.1 mol/L以上浓度时，温度升高对水合倾向大的离子容易交换吸附，同时离子的活性系数增大。对弱酸、弱碱交换剂来说，温度对其交换率有较大影响，一般温度增高，离子交换速率加快，在洗脱时亦可提高洗脱能力。但对不耐热的交换剂应注意提高温度的条件，避免引起交换剂的破坏。（5）溶剂 离子交换通常在水中进行，亦可采用含水的极性溶剂。但在极性小的溶剂中难以进行交换或不进行交换，而且选择性也减少或消失。此外，就交换树脂本身来说，交联度大，结构中的网眼较小，大分子离子就不容易进入；反之，交联度小，交联网孔直径大，则易于离子的扩散与交换。因此交联度的大小可以增加交换树脂对被交换物质的选择性。
23、,大孔吸附树脂是一种不含交换基团的具有大孔结构的高分子吸附剂，也是一种亲脂性物质。大孔吸附树脂多为白色球状颗粒，粒度多为20-60目，按极性可分为极性、中极性和非极性，是20世纪70年代发展起来的一种新型吸附剂，具有较好的吸附性能。目前常用的有苯乙烯型和丙烯腈型，它们的理化性质稳定、对有机物的选择性好、不受强离子低分子化合物及无机盐类的影响。大孔吸附树脂在干燥状态下其内部具有较高的孔隙率，且孔径较大，在100-1000nm之间，故称为大孔吸附树脂。,5、大孔吸附树脂色谱,大孔树脂吸附原理,大孔吸附树脂为吸附和分子筛原理相结合的分离材料，它的吸附性是由于范德华力或生成氢键的结果；筛选原理是由其本
24、身多孔性结构所决定的。由于吸附和筛选原理，有机物根据吸附力的不同及分子量的大小在大孔吸附树脂上经一定的溶剂洗脱而分开，这使得有机化合物尤其是水溶性化合物的提纯得以大大简化。大孔吸附树脂可以有效地吸附具有不同化学性质的各种类型化合物，具有各种不同的表面性质。大孔吸附树脂具有选择性好、机械强度高、再生处理方便、吸附速率快等优点，因此适用于从水溶液中分离低极性或非极性化合物，组分间极性差别越大，分离效果越好。,大孔树脂分类,大孔吸附树脂按其极性大小和所选用的单体分子结构不同，可分为非极性、中极性和极性三大类。（1）非极性大孔吸附树脂 是由偶极矩很小的单体聚合制得的，不带任何功能基团，孔表面的疏水性较
25、强，可通过与小分子内的疏水部分作用吸附溶液中的有机物，适于在极性溶剂中吸附非极性物质。常见的有苯乙烯、二乙烯苯聚合物等。（2）中等极性大孔吸附树脂 是含酯基的吸附树脂，以多功能团的甲基丙烯酸酯作为交联剂。其表面兼有疏水和亲水两种功能，既可在极性溶剂中吸附非极性物质，又可在非极性溶剂中吸附极性物质。如聚丙烯酸酯型聚合物。（3）极性大孔吸附树脂 是指含酰胺基、氰基、酚羟基等极性功能基的吸附树脂，它们通过静电相互作用吸附极性物质。如丙烯酰胺。,凝胶色谱又称为凝胶排阻色谱、分子筛色谱、凝胶过滤等。它是以多孔性凝胶填料为固定相，按分子大小顺序分离样品中各个组分的液相方法。,6、凝胶色谱,凝胶的种类及性质
26、,凝胶的种类很多，常用的有葡聚糖凝胶（Sephadex G）和羟丙基葡聚糖凝胶（Sephadex LH-20）。葡聚糖凝胶由葡聚糖及交联剂交联聚合而成，凝胶颗粒网孔大小取决于所用交联剂的数量及反应条件。加入的交联剂越多（交联度越大），网孔结构越紧密，孔径越小，吸水膨胀的程度也越小；反之，交联度越小，网孔结构越疏松，空隙越大，吸水膨胀的程度也越大。凝胶的商品型号即按交联度大小分类，并以吸水量多少表示。如Sephadex G-25，G为凝胶（Gel），后附数字等于吸水量乘以10，故G-25的吸水量为2.5 mL/g。Sephadex G型仅适合在水中应用，属亲水性凝胶。羟丙基葡聚糖凝胶是Sepha
27、dex G-25经羟丙基化处理后得到的产物，此时，葡聚糖凝胶分子中的葡萄糖部分与羟丙基结合成下列醚键形式：-OH-OCH2CH2CH2OH。与Sephadex G比较，Sephadex LH-20分子中-OH 基总数虽无改变，但碳原子数所占比例却相对增加了，所以它不仅可在水中应用，也可在难溶于水的亲脂性有机溶剂中使用。,聚酰胺吸附属于氢键吸附。聚酰胺是通过酰胺键聚合而成的一类高分子化合物，不溶于水、甲醇、乙醇、乙醚、氯仿及丙酮等常用有机溶剂，对碱较稳定，对酸尤其是无机酸稳定性较差，可溶于浓盐酸、冰醋酸及甲酸。聚酰胺分子中含有丰富的酰胺键，可与酚类、黄酮类、酸类、醌类、硝基化合物等形式的氢键结合
28、而被吸附，与不能形成氢键的化合物分离，用途十分广泛，极性物质和非极性物质均可适用。,7、聚酰胺色谱,聚酰胺色谱,聚酰胺的吸附强弱取决于各种化合物与之形成氢键缔合的能力。在含水溶剂中吸附规律大致如下：化合物中形成氢键的基团越多，则吸附力越强；形成氢键的位置与吸附力有很大关系，对位、间位酚羟基使吸附力增大，邻位使吸附力减小；芳香核、共轭双键多的吸附力也大；易形成分子内氢键的化合物，会使化合物的吸附力减小。从聚酰胺柱上洗脱被吸附的化合物是通过一种溶剂分子取代酚类化合物来完成的，也就是说以一种新的氢键替代原有氢键的脱吸附而完成的。聚酰胺与酚类等化合物形成氢键缔合的能力在水中最强，在含水醇中随着浓度的增
29、高而相应减弱，在高浓度或其他有机溶剂中则几乎不缔合。在色谱分离时，通常用水装柱，样品也尽可能做成水溶液装柱以利于充分吸附，洗脱时在水中递增甲醇或乙醇的含量，逐步增强洗脱能力。,聚酰胺的“双重色谱”性能,随着聚酰胺色谱的不断发展，有许多现象难以用“氢键吸附”解释。例如，某些很难与聚酰胺形成氢键的物质-萜类、甾体、生物碱等也可以用聚酰胺色谱分离。又如黄酮体苷元与苷的分离，当用稀醇作洗脱剂时，黄酮体苷比其苷元先洗脱下来；而用非极性溶剂洗脱其结果恰恰相反，即黄酮体苷元比苷先脱下来，后者不能用“氢键吸附”来解释。这表明聚酰胺具有“双重色谱”的性能，因聚酰胺分子中既有非极性的脂肪键，又有极性的酰胺键。当用
30、含水极性溶剂为流动相时，聚酰胺作为非极性固定相，其色谱行为类似反相分配色谱，所以黄酮体苷比苷元容易洗脱。当用非极性氯仿-甲醇为流动相时，聚酰胺则作为极性固定相，其色谱行为类似正相分配色谱，所以苷元比其苷容易洗脱。,苷元，又称甙元。糖苷类化合物中，与糖缩合的非糖部分。苷元可以是醇如甲醇、乙醇、甾醇，这样的苷称为氧苷；可以是硫醇如乙硫醇，这样的苷称为硫苷；可以是羧酸如脂肪酸，这样的苷称为糖酯；可以是胺类，这样的苷称为氮苷；也可以是苷元的碳原子直接与糖连接，称为碳苷。,反相色谱是在非极性固定相上，用极性较大的液体作为流动相，进行物质分离、分析的一种方法。反相色谱的广泛应用是由于流动相的特殊溶剂效应和
31、大范围的溶剂强度变化。反向色谱的固定相最主要的是烃基键合材料，已使用的烷基链长有C2、C4、C8、C16、C18、C22等。此外还有苯基和多环芳烃。其中应用最多的十八烷基键合硅胶（octadecylsilane），通常称为ODS。反相色谱的流动相用极性溶剂及其混合物，溶剂极性越低，其洗脱能力越强。水是反相色谱最弱的溶剂，也是使用最广泛的流动相。乙腈、甲醇、乙醇、丁醇、四氢呋喃等有机溶剂是常用的反相色谱流动相。,8、反相色谱,纸色谱属分配色谱，是以滤纸作为支持剂，用一定的溶剂系统展开而达到分离分析目的的方法。纸色谱法的一般操作为：将待试样品溶于适当溶剂，点样于滤纸一端，挑选适当的溶剂系统作为流动
32、相置于一个密闭的缸内，然后将滤纸吊放在缸内，使滤纸被流动相的蒸汽所饱和，流动相从点样的一端通过毛细现象向另一端展开，在此过程中各组分逐渐得到分离。展开完毕后，取出滤纸，干燥，以适当显色剂显色即可。Rf值是指物质移动的距离除以溶剂移动的距离。,9、纸色谱,纸色谱滤纸的选择,在纸色谱中，分离是在滤纸上进行的，因此滤纸的选择很重要，是影响分离效果的重要因素之一。常用的国产滤纸有新华纸厂生产的各种色谱用滤纸，国外产的多用华德门（Whatman）滤纸。需要注意的是，不同厂家、不同型号的滤纸，由于生产方式与条件不尽相同，吸收水分量不完全相同，有时pH值也可能不同，因此按同一条件分离，同一组分的移动情况即R
33、f值也会不完全相等，有时还可能有较大差别。所以，在用纸色谱进行定性鉴别时，应尽量将样品与已知标准品在同一张滤纸上进行展开，然后比较其Rf值，这样可避免由于纸的来源不同而引起的差异。色谱分离用的滤纸应保存在洁净的环境中，避免与各种化学物质及烟雾等接触，否则有可能在滤纸上吸附这些物质，使滤纸变性。纸色谱的优点是便于保存，对亲水性成分（如酚类、氨基酸）分离较好，缺点是费时。,薄层色谱是一种快速、简单及高效的分离分析方法。薄层色谱的操作方法是将适宜的吸附剂均匀地涂布于平面如玻璃板上，形成薄层，把待分析的样品点加到薄层上，然后用合适的溶剂展开而达到分离、鉴定的目的。其原理与柱色谱基本类似。薄层色谱用的吸附剂与其选择原则和柱色谱相同。常用的吸附剂有硅胶G、硅胶GF、氧化铝、硅藻土等。其中硅胶和氧化铝由于吸附性能好，适用于各类成分的分离，应用最广。展开剂主要使用低沸点的有机溶剂，一般分析纯和化学纯即可。选择的原则主要根据样品的极性及溶解度。,10、薄层色谱,薄层色谱不仅已成为分离鉴定中草药有效成分的常用方法之一，而且在分析化学、药物分析、染料、农药、贵金属等的分离鉴定、定量等各个领域均得到广泛的应用。,
