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1、,第十一单元 生物技术实践,专题五血红蛋白的提取与分离,1、关于血红蛋白血红蛋白是 动物红细胞的主要组成成分，负责血液中_的运输。血液由_和_组成，其中_细胞最多。在红细胞的组成中，除水分以外，约90%是血红蛋白。血红蛋白由四条肽链组成，包括两条-肽链和两条-肽链。其中每条肽链环绕一个_基团，此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳。血红蛋白因含有_而呈现红色。,人和其他脊椎,O2和CO2,血浆,各种血细胞,红,亚铁血红素,血红素,2、关于蛋白质的分离 不同的蛋白质，其分子的_、所带电荷的_、_、吸附性质和对其他分子的_等特性存在差异，可利用这些差异来分离不同种类的蛋白质。,形状和大小,性质和多少
2、,溶解度,亲和力,2、关于蛋白质的分离凝胶色谱法 凝胶色谱法也称做分配色谱法，是根据 分离蛋白质的有效方法。所用的凝胶实际上是一些微小的_球体，这些小球体大多数是由多糖类化合物构成的，如葡聚糖或琼脂糖。在小球体内部有许多贯穿的通道，当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较_的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较_，移动速度较_；而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较_，移动速度较_。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。,相对分子质量的大小,多孔,小,长,慢,短,快,1.凝胶色谱法,(1)结合右图，根据凝胶色谱法的分离原理，填表分析不同大小
3、的分子洗脱后的次序。,较大,较小,垂直向下运动,较长,较快,2、关于蛋白质的分离电泳 电泳是指_。许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上_ _。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷_的电极移动。电泳利用了待分离样品中各种分子_以及_，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。_电泳和_电泳是两种常用的电泳方法。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它_以及_等因素。,带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程,正电或负电,相反,带电性质的差异,分子本身的大小和形状的不同,琼脂糖凝胶,聚丙烯酰胺凝胶,所带净电荷的多少,分子的大
4、小,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,思考1、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳可使蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率只取决于它的分子大小，其原理是？分析：SDS的作用：SDS能使蛋白质发生完全变性，解聚成_；SDS能与各种蛋白质（肽链）形成_，SDS所带负电荷的量_蛋白质（多肽）分子所带的电荷，因而可掩盖不同种蛋白质间的_，使电泳迁移率完全取决于_。思考2、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳还可以测定蛋白质的分子量，其原理是？分析：使用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定样品蛋白的分子量时，可选用一组_的标准蛋白同时进行电泳，根据标准蛋白的电泳区带位置，经过换算，可以测定样品蛋白质的分子量。,单条肽链,复合物,大大超过,电荷差别
5、,分子的大小,已知分子量,2、关于蛋白质的分离,血红蛋白的提取和分离,实验操作程序样品处理：的洗涤 的释放分离血红蛋白溶液粗分离：用_法除去样品中相对分子质量较小的杂质纯化：用 对血红蛋白进行分离和纯化纯度鉴定：_法来测定蛋白质的相对分子质量，即对血红蛋白进行纯度鉴定,透析,用SDS聚丙烯酰胺凝胶电脉,凝胶色谱法,红细胞,血红蛋白,阅读教材，思考问题：1、刚采集的血样要做怎样的处理？为什么？加入抗凝剂(柠檬酸钠)，防止血液凝固。2、怎样洗涤？采样分离吸浆倒红加液搅拌重洗三次 低速短时间离心 生理盐水3、洗涤的目的是什么？去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化。4、洗涤干净的标志是什么？直至上
6、清液不再呈现黄色，表明红细胞已洗涤干净。,1、红细胞的洗涤,2、血红蛋白的释放,阅读思考：释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了哪些物质，有什么用？,目的分析：蒸馏水的作用是_。加入甲苯的作用是_。充分搅拌的目的是_。,使红细胞大量吸水胀裂,溶解红细胞的细胞膜,加速红细胞的破裂,有机溶剂（无色透明的甲苯层）脂类物质（白色脂溶性物质沉淀层）血红蛋白溶液（红色透明液体）红细胞破碎物沉淀（暗红色沉淀物）,3、分离血红蛋白溶液,2000r/min 高速离心10min,用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。,(4)透 析：,过程：取1ml的血红蛋白溶液装入透析
7、袋中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/l的磷酸缓冲液中（pH为7.0），透析12小时。透析目的：除去样品中分子量较小的杂质。,2.凝胶色谱操作:,（1）凝胶色谱柱的制作：,（2）凝胶色谱柱的装填,凝胶的选择：凝胶的前处理：,交联葡聚糖凝胶（G-75）,计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。,凝胶色谱柱的装填方法：,固定：将色谱柱装置固定在支架上。装填：将凝胶悬浮液一次性缓慢倒入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。不能产生气泡。,洗涤平衡：,装填完成后，立即连接缓冲液洗脱瓶，用磷酸缓冲液充分洗涤平衡凝胶12h，使凝胶装填紧密。,（2）凝
8、胶色谱柱的装填,注意：1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。2、装填凝胶柱时不得有气泡存在。,如果装填不够紧密、均匀，就会在色谱柱内形成无效的空隙，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过，搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，影响分离的效果。气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。,装配好的凝胶柱,（3）样品加入与洗脱,调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。,注意：正确的加样操作是：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、
9、使吸管管口沿管壁环绕移动。,（3）样品加入与洗脱,调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。,样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口洗脱：小心加入pH=7.0 的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml收集一试管，连续收集。（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）,（3）
10、样品加入与洗脱,（三）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（选做）,鉴定血红蛋白纯度。,目的：,正在电泳,电泳结果,命题点一蛋白质的提取与分离的原理和过程分析1.将经处理破裂后的红细胞混合液以2 000 r/min的速度离心10 min后，离心管中的溶液分为四层，从上到下的顺序依次是A.血红蛋白、甲苯层、脂溶性物质层、沉淀层B.甲苯层、沉淀层、血红蛋白、脂溶性物质层C.脂溶性物质层、血红蛋白、甲苯层、沉淀层D.甲苯层、脂溶性物质层、血红蛋白、沉淀层,命题探究,命题探究,解析混合液经离心后，按密度大小排列，在离心管中从上到下的顺序依次是：第1层为无色透明的甲苯层；第2层为白色薄层固体，是脂溶性物质沉淀层；第
11、3层为红色透明液体，这是血红蛋白的水溶液；第4层为暗红色沉淀物，主要是红细胞破碎物沉淀。,解析红细胞洗涤步骤中应加入生理盐水而不是蒸馏水；血红蛋白释放中加入蒸馏水；透析时缓冲液pH应为7.0而不是4.0。,5.下列关于蛋白质提取和分离实验中样品处理步骤的描述，正确的是A.红细胞的洗涤：加入蒸馏水，缓慢搅拌，低速短时间离心B.血红蛋白的释放：加入生理盐水和甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌C.分离血红蛋白：将搅拌好的混合液离心，过滤后，用分液漏斗分离D.透析：将血红蛋白溶液装入透析袋，然后置于pH为4.0的磷酸缓冲液中透 析12 h,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,(1)将实验流程补充完整
12、：A为_，B为_。凝胶色谱法是根据_而达到蛋白质分离的有效方法。,9.血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，负责血液中O2或CO2的运输。请根据血红蛋白的提取和分离流程图回答问题。,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,血红蛋白的释放,样品的加入和洗脱,相对分子质量的大小,解析凝胶色谱法是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法，在蛋白质分离与提取过程中包括样品的处理、粗分离、纯化和纯度鉴定四步，每一步均应用了不同的操作技术，需要注意。,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,(2)洗涤红细胞的目的是去除_，洗涤次数过少，无法除去_；离心速度过高和时间过长会使_一同沉淀，达不
13、到分离的效果。洗涤干净的标志是_。释放血红蛋白的过程中起作用的是_。(3)在洗脱过程中加入物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液(pH为7.0)的目的是_。如果红色区带_，说明色谱柱制作成功。,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,杂蛋白(血浆蛋白),血浆蛋白,白细胞和淋巴细胞,离心后的上清液中没有黄色,蒸馏水和甲苯,准确模拟生物体内的生理环境，保持体外的pH和体内一致,均匀一致地移动,(1)a、b均为蛋白质分子，其中先从层析柱中洗脱出来的是_，原因是_。,2.凝胶色谱技术是六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离技术，由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很好的分
14、离效果，目前已经被生物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学以及医学等有关领域广泛应用，不但应用于科学实验研究，而且已经大规模地用于工业生产。据图回答问题：,a,分子质量大，无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快,a相对,解析用凝胶色谱法分离各种物质时，大分子物质先洗脱出来，然后是小分子物质。大分子物质由于直径较大，不易进入凝胶颗粒的微孔，而只能分布于颗粒之间，所以向下移动的速度较快。小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔中，在向下移动的过程中，从一个凝胶内扩散到颗粒间隙后再进入另一个凝胶颗粒，如此不断地进入和扩散，小分子物质的下移速度落
15、后于大分子物质，从而落后于大分子物质洗脱速度。在色谱柱中填凝胶的时候要尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。一是在装填凝胶柱时，不得有气泡存在，因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。二是凝胶色谱操作过程中，不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。一旦发生上述两种情况，凝胶色谱柱需要重新装填。,(2)自己制作凝胶色谱柱时，在色谱柱底部d位置相当于多孔板的结构可由_替代。(3)装填凝胶色谱柱时，色谱柱内不能有气泡存在，原因是_。(4)若选用Sephadex G100，则“G”表示_，100表示_。,尼龙网和尼龙纱,气泡会搅乱洗脱,离范围,液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果,凝胶的交联程度，膨胀程度及分,凝胶得水值,
