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1、第四章 药典中常见定量分析方法概述,药物的定量分析,准确测定药品有效成分或指标性成分的含量，是评价药品质量、判断药物优劣的重要手段。分类：化学分析法 仪器分析法,重量分析,滴定分析,色谱法,分光光度法,电化学分析,第一节 化学分析法,一、重量分析法基本原理：以质量为测定值的定量分析方法应用：挥发法 萃取法 沉淀法,第一节 化学分析法,二、酸碱滴定法基本原理：以酸、碱中和反应为基础的滴定分析法应用：直接滴定法 剩余滴定法,第一节 化学分析法,三、氧化还原滴定法基本原理：以氧化还原反应为基础的滴定分析法应用：碘量法 溴量法 铈量法 亚硝酸钠法 高锰酸钾法 重铬酸钾法,碘量法,基本原理：以碘的氧化性
2、或I-的还原性进行的氧化还原滴定分析法应用：直接碘量法 间接碘量法测定范围：强氧化性和强还原性物质,剩余碘量法,置换碘量法,溴量法,基本原理：以溴的氧化作用和溴代作用为基础的滴定分析法溴：溴酸钾溴化钾应用：主要用来测定能和溴发生溴代反应或能被溴氧化的药物的含量,铈量法,基本原理：以硫酸铈为滴定液的氧化还原滴定法指示剂：邻二氮菲应用：氧化性弱于高锰酸钾，中国药典用来测定硝苯地平、葡萄糖酸亚铁及其制剂、硫酸亚铁片的含量,亚硝酸钠滴定法,基本原理：利用亚硝酸钠在盐酸存在下可与具有芳香第一胺的化合物发生重氮化反应，定量生成重氮盐，根据滴定时消耗亚硝酸钠的量来计算药物含量的方法。应用：用来测定含有芳香第
3、一胺或水解后能生成芳香第一胺的化合物指示终点：永停法,第一节 化学分析法,四、非水溶液滴定法基本原理：在非水溶剂中进行滴定的滴定分析方法。应用：碱量法 酸量法,第一节 化学分析法,五、沉淀法基本原理：以沉淀为基础的滴定分析法应用：用于无机卤化物以及能与Ag或SCN-形成沉淀的离子的测定。银量法,第一节 化学分析法,六、配位滴定法基本原理：以配位反应为基础的滴定分析法配位剂：乙二胺四乙酸（EDTA）应用：主要用于金属离子的测定,第二节 紫外可见分光光度法,分光光度法 通过测定物质在特定波长处或一定波长范围内的吸光度或发光强度，对该物质进行定性定量分析。,第二节 紫外可见分光光度法,一、基本原理
4、单色光辐射穿过被测物质溶液时，在一定的浓度范围内被该物质吸收的量与该物质的浓度和液层的厚度成正比，即朗伯比尔定律,第二节 紫外可见分光光度法,Alg1/T=ECL吸收系数E1%：当溶液浓度为1（g/ml），液层厚度为1cm时的吸光度A：吸光度T：透光度C：100ml溶液中所含被测物质的重量（g）L：液层厚度（cm）,1cm,第二节 紫外可见分光光度法,二、应用及注意事项 有机化合物分子结构中含有共轭体系、芳香环等发色基团，均可在紫外（200400nm）或可见光区（400760nm）产生吸收，或在一定条件下加入显色剂或经处理显色后产生吸收,第二节 紫外可见分光光度法,二、应用及注意事项除另有规定
5、的，应以配制供试品溶液的同批溶剂为空白对照，采用1cm的石英吸收池供试品溶液的读数以在0.30.7之间的误差较小当pH有影响时，应将供试品和对照品的pH调成一致,第二节 紫外可见分光光度法,二、应用及注意事项对照品比较法吸收系数法计算分光光度法比色法,第二节 紫外可见分光光度法,仪器的校正和检定波长：汞灯，氘灯吸收度的准确度：可用重铬酸钾的硫酸溶液检定杂散光的检查：配成碘化钠或亚硝酸钠溶液，检查透光率,第二节 紫外可见分光光度法,对溶剂的要求在220240nm范围内，吸收度不得超过0.40在241250nm范围内，吸收度不得超过0.20在251300nm范围内，吸收度不得超过0.10在300n
6、m以上时不得吸收度超过0.05,第三节 高效液相色谱,基本原理,采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱分析方法。供试品经进样阀注入，由流动相带动通过色谱柱，各成分在柱内被分离后，依次通过检测器，其成分情况转变为其色谱信号情况，并由记录仪、积分仪或计算机记录、显示而作为检验成分的依据。,对仪器的一般要求,色谱柱 常用的填充柱为化学键合硅胶，反相系统使用非极性填充剂，最为常用的是十八烷基键合硅胶；正相系统使用极性填充剂，常用的是硅胶检测器 常用的为紫外检测器流动相 反相：流动相中有机溶剂不低于5%,高效液相色谱的基本定性参数,1、保留时间（tR）2、死时间（t0）3、
7、保留体积（VR）4、死体积（V0）,5、柱效参数：a.区域宽度：在一定条件下，区域宽度越 大（峰越胖），柱效越低。i)标准偏差：拐点处的峰宽之半。ii)半峰宽：色谱峰峰高一半处的峰宽。iii)峰宽：通过色谱峰两侧的拐点作切线 在基线上所截的距离。,b.理论塔板数和理论塔板高度：i)可由色谱峰的保留时间和区域宽度计算 ii)理论塔板高度,组分的保留时间越长，、W h/2、W越小，则理论塔板数越大，柱效越高。,n=(t R/)2=5.54(t R/W h/2)2,H=2/L,系统适用性试验,按药典各品种项下要求对仪器进行适用性试验，即用规定的对照品对仪器进行试验和调整，应达到规定的要求或规定分析状
8、态下色谱柱的最小理论板数、分离度重复性和拖尾因子。,（1）色谱柱的理论板数（n）：在选定的条件下，注入供试品溶液或药典各品种项下规定的内标物质溶液，记录色谱图，量出供试品主要成分或内标物质峰的保留时间tR和半峰宽，按n=5.54(tR/wA/2)2计算色谱柱的理论板数。如果测得理论板数低于药典各品种项下规定的最小理论板数，应改变色谱柱的某些条件（如柱长、载体性能、色谱柱充填的优劣等），使理论板数达到要求。,（2）分离度：定量分析时，为便于准确测量，要求定量峰与其他峰或内标峰之间有较好的分离度，分离度R的计算公式为：R=2（tR2-tR1）/(w1+w2)式中 tR2为相邻两峰中后一峰的保留时间
9、 tR1为相邻两峰中前一峰的保留时间 w1及w2为相邻两峰的峰宽分离度要求：大于1.5,（3）重复性 取个品种项下的对照溶液，连续进样5次，峰面积测量值的相对标准偏差不大于2.0%也可按各品种校正因子测定项下，配制相当于80%,100%和120%的对照溶液，加入规定量的内标溶液，配成三种不同浓度的溶液，分别注样至少2次，计算平均校正因子。其相对标准偏差应不大于2.0%。,（4）拖尾因子：为保证测量精度，特别当采用峰高法测量时，应检查待测峰的拖尾因子（T）是否符合药典各品种项下的规定或不同浓度进样的校正因子误差是否符合要求。拖尾因子计算公式为：T=w0.05h/2d1 式中 w0.05h为0.0
10、5峰高处的峰宽 d1为峰极大至峰前沿之间的距离除另有规定外，T应在0.95-1.05间,定量分析,HPLC定量分析的参数是色谱峰高和峰面积，定量依据是样品中组分的量与峰高或峰面积成正比。常用的定量方法有外标法、内标法和内加法。,1、定量分析参数的选择：峰高，峰面积,2、外标法：用与待测组分同质的标准品作对照品，以对照品的量对比求算试样含量的方法。又可分为外标工作曲线法、外标一点法、外标二点法。在HPLC中，因进样量大，且用六通阀定量进样，误差相对较小，所以外标法是HPLC常用的定量分析方法。a.工作曲线法：用对照品配制系列浓度的对照品溶液，准确进样，测量峰面积或峰高，对浓度C绘制标准曲线，利用
11、此曲线或它的回归方程式计算样品溶液的含量。,b.外标一点法：用一种浓度的对照品溶液对比求算样品含量的方法，只有在工作曲线通过原点，即截距为零时，才可用外标一点法进行定量分析。2、内标法：选择适宜的物质作为内标物，以待测组分和内标物的峰高比或峰面积比求算试样含量的方法。内标法的关键时选择合适的内标物。,内标物的要求：1内标物应是样品中不含有的物质 2纯度要高 3与待测组分有相似的理化性质，因而保留 时间与待测组分接近 4与样品中各组分能完全分离且不与样品反 应 内标法可分为工作曲线法、内标一点法、内标二点法及校正因子法等。,使用内标的作用：可以抵消仪器稳定性差，进样量不够准确等原因带来的定量分析
12、误差。如果在样品预处理前加入内标物，则可抵消方法全过程引起的误差。,Ai/As=a+bCi,将与对照品溶液中相同量的内标物加至样品溶液中，分别测量样品中I组分与内标物峰面积（或峰高），以两者峰面积或峰高之比代入回归方程式计算出样品中i组分的含量。,a.工作曲线法：与外标法相似，只是在各种浓度的对照品溶液中加入相同量的内标物。分别测量I组分与内标物S的峰面积A（或峰高h)，以峰面积比Ai/As与Ci绘制工作曲线，或求出回归方程式。,b.内标对比法：只配制一个浓度的对照品溶液，然后在样品与对照品溶液中加入相同量的内标物，分别进样。按下式计算样品浓度。,与外标法相似，只有线性关系好且截距a为零时才可
13、用内标一点法定量。,(Ci)样,（Ai/As）样,（Ai/As）对,x Ci对照,c.内标校正因子法：在HPLC分析中，等量的不同物质在相同实验条件下，在同一检测器上的响应值经常不同，为了校正这种响应的差别，引入了校正因子的概念。f 定义为：被测组分单位峰面积（或峰高）所相当物质的量与参比物质（内标物）单位峰面积（或峰高）所相当物质的量的比值。,1）校正因子（f）=,A s/m s,A r/m r,2）含量（m x)=f X,Ax,A s/m s,d.内加法：将待测组分i的纯品加至待测样品溶液中，测定增加纯品后的溶液比原样品溶液中i组分的峰面积增量，求算i组分的含量。此法不需要内标物，又能克服
14、由于进样量不准确所带来的定量分析误差。,mi=Ai/Ai*mi,mi是纯物质i的加入量，Ai是相应增加的峰面积,梯 度 洗 脱 HPLC的色谱洗脱技术有等强度和梯度洗脱两种。等强度洗脱：在同一分析周期内流动相组成保持恒定，适合于组分数目较少，性质差别不大的样品。,梯度洗脱：在一个分析周期内程序控制流动相的组成，如溶剂的极性、离子强度和pH值等。分析组分数目多、性质相差较大的复杂样品时须采用梯度洗脱技术，使所有的组分都在适宜的条件下获得分离。优点：能缩短分析时间，提高分离度、改善峰 形，提高检测灵敏度。缺点：常引起基线漂移和降低重现性。,第四节 气相色谱法,采用气体为流动相（载气）流经装有填充剂
15、的色谱柱进行分离测定的色谱方法。物质或其衍生物汽化后，被载气带入色谱柱进行分离，各组分先后进入检测器，用记录仪、积分仪或数据处理系统记录色谱信号。,对仪器的一般要求,载气 氦气、氮气和氢气进样 直接进样和顶空进样色谱柱 填充柱和毛细管柱检测器 常用FID,第五节 分析方法的验证,1、准确度（accuracy）指分析方法所得的测定结果与真实值或参考值接近的程度。一般以回收率表示。原料药可用已知纯度的对照品或供试品进行测定，也可以将验证方法的测定结果与另一已建立的准确可靠方法的测定结果进行对比来确定。制剂可用含已知量被测物的各组分混合物进行测定。至少用9个测定结果进行评价。,2、精密度（preci
16、sion）指在规定的测试条件下，同一均匀样品进行多次测定，所得的结果彼此符合的程度。精密度通常以偏差、标准偏差或相对标准差（RSD）来表示。一个分析方法的精密度好，说明方法稳定，测定的结果重复性好，但方法的精密度好，准确度不一定高。重复性：在相同条件下，由同一个分析人员测定所得结果的精密度。中间精密度：在同一个实验室，不同时间由不同分析人员用不同设备测定结果之间的精密度。重现性：在不同实验室由不同分析人员测定结果之间的精密度。,3、专属性（specificity）：指在其它成分（如杂质、辅料等）可能存在的情况下，分析方法能准确地测出被测组分的能力。4、检测限（limit of detectio
17、n,LOD）指分析方法在规定的实验条件下所能检出被测组分的最低量。非仪器分析目视法信噪比法,5、定量限（limit of quantitation,LOQ）指分析方法可定量测定样品中测定组分的最低量。定量限与检测限的区别在于，它所规定的最低浓度，应满足一定的精密度和准确度的要求。一般以信噪比10：1确定为定量限。6、线性（linearity）指分析方法在一定范围内获得的检测结果和样品中测定组分的浓度成正比关系的程度。,7、范围（range）能达到一定精密度、准确度和线性，测试方法适用的高低限浓度或量的区间。8、耐用性（ruggedness）指测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度。,同学们，下课啦！,
