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1、,第二节 电压钳制技术,Voltage clamp technique,利用微电极技术，虽然记录到细胞内的电变化过程，但不能阐明这种变化的原因。要阐明跨膜电变化机制，必须应用电压钳制技术。这一技术首先是由Cole及其同事设计，在经Hodgkin等人加以改进，用于神经电生理研究，弄清了神经纤维在兴奋时离子流的情况。,一、细胞膜的生物物理特性(Biophysical properties of cell membrane),细胞膜上以脂质双分子层为支架，镶嵌着不同特性的蛋白质。细胞膜的电紧张及其扩布规律，膜的极化状态及其形成过程中等都是细胞膜电缆性质(cable properties)的反映。(轴
2、浆电阻与膜电阻、膜电容的组合，使电流对膜电位的影响起着依距离而衰减以及在时间上的延缓作用神经的“电缆”性质)。细胞膜的电缆特性从它的等效电路及其时间常数和空间常数得到证实。,(一)细胞膜的等效电路,从电学特点上分析，细胞膜可等效地模拟为电阻电容器。它具备细胞浆电阻（纵向电阻，Ro），膜电阻（横向电阻，Rm），膜电容（Cm）和膜电位（Em）四方面的电学特性，根据这四方面特性即可构成其等效电路（Equivalent Circuit）。,outside,inside,膜电位等效电路的简化图,Cm 膜电容Rm 膜电阻Em 离子平衡电位Ro 细胞外液的纵向电阻（/cm）Ri 轴浆的纵向电阻（/cm）,R
3、o,Cm,Rm,Em,+,-,离子通道等效电路,细胞膜的等效电路是一个并联的阻容电路，膜活动时既有电压的改变，同时又有电流的改变。电位的改变可引起电容器的充、放电，也可用于电阻器上的电流流动。通过电容器的电流为Ic，通过电阻的电流为Ir。,1 纵向电阻（Ro、Ri）,由胞浆的性质所决定，具有较高的电阻率，它与直径呈反比关系（直径大、电阻小，直径小，电阻大）。由于它的存在，使生物电的传导主要沿细胞膜所包围的容积导体进行。它是单位长度的电阻，单位是/cm，细胞外间质的容积很大，其单位长度电阻（Ro）较Ri小。,2.横向电阻（redial resistance）,即细胞膜本身具有的膜电阻。细胞膜由双
4、层脂质构成，厚度很薄，但具有很高的电阻，即绝缘性。膜电阻表示离子通过膜的有限能力。膜电阻反映了离子是否容易通透膜的情况。膜电阻（Rm）的大小反映了膜结构电学方面的差异。,2.横向电阻（redial resistance）,膜电位、膜电流和膜电阻的关系遵循欧姆定律：Em=Im.Rm I=V/R 膜电阻越大，对电流的导通能力越小。膜电阻反映了离子是否容易通透膜的情况。膜电阻（Rm）的倒数膜电导（G，g）。I=g V（膜电位恒定的情况下，膜电导越大，膜电流也越大。不同的离子有不同的电导。电导的单位是Siemens(S).,3.膜电容（capacity）,表示膜的绝缘及储存电荷的性质。任何一种装置使两
5、个导体中间插入一个绝缘体并安排在一起，称为电容器。细胞外液及细胞内液均为含电解质的溶液，可看作为两个导体；细胞膜是含脂质的膜，可视作为绝缘体。细胞外液-细胞膜-细胞内液三者组成了电容。,3.膜电容（capacity）,电容大小与细胞体积和细胞膜表面积有关。膜电容和膜面积呈正比，与膜的厚度呈反比。电容的单位是法拉第（F）。膜电容的测量可用于细胞膜表面积的测定，对推算某种离子通道在单位膜面积上的密度有一定帮助。,4 膜电位（membrane potential）,当膜上离子通道开放而引起带电离子跨膜流动时，就相当于在电容器上充电或放电而产生电位差，即跨膜电位。膜电位的高低决定于跨膜电化学梯度；膜电
6、位的高低与膜两侧的电荷成正比。在膜两側离子浓度不变的情况下，膜电位则取决于膜电导的改变（离子通透性的改变）。反过来，膜电导的大小又受到膜电位的控制（离子通透性的电压依赖性）。,5 膜电流（membrane current）,任何电流都是电容电流（Ic）和电阻电流（Ir）两种形式通过细胞膜，前者导致膜电荷的改变，后者实际上是由离子携带流经细胞膜的。I m=Ic+Ir,5 膜电流（membrane current）,电位的变化引起膜电容的充电或放电，而电流的变化则表现在膜电阻上的电流流动。Ic只在膜电位发生变化的一瞬间出现，若将膜电位固定在一定水平，记录到的仅为Ii（Ir），这是电压钳制技术的电学
7、基础之一。,(二)细胞膜的时间常数（time constant）,时间常数是指膜电压随时间而改变的过程，用一常数表示之。它反映膜电位在细胞膜上随时间而改变的（缓慢）程度。也就是膜电位通过膜电阻和膜电容充电到63%或放电到37%所需的时间。=Rm Cm=膜的时间常数(ms）;Rm=膜电阻（k）Cm=膜电容（F）的大小与膜的电学性质有关，与膜的形状无关。,(三)细胞膜的空间常数（space constant）,空间常数，是度量电压的空间衰减，即标志电压依距离而衰减的程度的一个常数。即:膜电位通过膜电阻和纵向电阻所组成的分流电路随距离的增大而按指数曲线规律衰减的速度.或表示膜电位按指数曲线规律衰减到
8、37%所需要的距离。细胞直径越大，空间常数越大。,(一)、定义 利用负反馈原理将膜电位在空间和时间上固定于某一恒定的测定值，以研究动作电位产生过程中的离子通透性与膜电位之间的依从关系的技术。,二、电压钳制技术的方法原理,电压钳制术是利用负反馈电路，在一定时间内将跨膜电位（Transmembrane Potential，Vm），保持在某个选定的电位水平，此电位称为保持电位（Holding potential，Vh），或者使保持电位突然变到某个特定的幅值的方波电位，称为钳制电位（Clamping potential）或指令电位（Command potential，Vc）。,(二)电压钳方法,电容器
9、电流 Ic=d（CmV）/dt,电阻器上电流 IR,流过膜的电流总量 I,dv/dt=0,所有的电流将都是流过膜电阻的，这种电流将能反映离子的流动。,电压钳技术的基本原理 电压源（SG）使膜电位固定在特定的水平，并以放大器（AV）记录，该放大器与一个反馈放大器（AFB）连接，这一反馈电流通过膜，正好抵消因加电压而引起的离子电流，通过电流监视器测量电流。,（三）电压钳技术的优缺点：,很容易将膜电容电流与离子电流分开；可将膜电流分成不同的成分一INa、IK、Ica 等（在灌流液中加入或去除某种离子）能精确反映由离子通道的开放和关闭，引起的膜电导的改变，能把离子通透性变化的时间关系加以描述。能分析离
10、子通透性变化与膜电位的关系，在研究电压调节通道的行为方面有很大价值。,1 优点,必须在细胞内插入两个电极，对细胞损伤很大；对体积小的细胞，实验难以实现；对形态复杂的细胞，很维保持细胞膜各处电位一致；只研究一个细胞上众多通道的综合活动规律，无法反映单个通道活动的特点。,2 缺点:,蛙坐骨神经元单个Ranvier结的电压钳记录,（四）几种电压钳方法 双微电极法 单蔗糖间隙（Singe Sucrose Gap）法 双蔗糖间隙（Double Sucrose Gap）法,双微电极法 单蔗糖间隙（Singe Sucrose Gap）法 双蔗糖间隙（Double Sucrose Gap）法,图1-2 心肌双
11、微电极 电压钳法示意图Em：膜电位；Ec：控制电位；Vo：钳制电位；I：输出电流,双微电极法 单蔗糖间隙（Singe Sucrose Gap）法 双蔗糖间隙（Double Sucrose Gap）法,图1-3 单蔗糖间隙法原理图 图1-4 双蔗糖间隙法原理图 Em：膜电位；Ec：控制电位；Em：膜电位；Ec：控制电位；Vc：钳制电位；I：输出电流 Vc：钳制电位；I：输出电流,第三节 膜片钳制技术,膜片钳制技术（patch clamp technique)是对一块单独的细胞膜片（或整个细胞）的电位进行钳制的一项电生理技术。通过对膜电位的钳制可以观察通过离子通道的电流，膜片钳放大器正是通过维持电
12、压的恒定而测出这种电流。运用膜片钳技术记到的最小电流可达到pA级(10-12 A)。,一 基本原理,膜片钳的本质属于电压钳范畴，其基本工作原理是：采用经典的负反馈放大技术作电压固定，但改用细胞外微吸管作电极，将微电极管尖端与细胞膜表面接触，经负压抽吸，形成具极高阻抗的紧密封接，其电阻值高达10-100千欧（即G=109）。只有在这种封接存在时，通过膜电极引导记录的电流才是通过该膜的离子通道电流。,膜片钳技术原理示意图 Rs是膜片阻抗相串联的局部串联电阻（输入阻抗），Rseal是封接阻抗。Rs通常为15M，如果Rseal高达10G（1010）以上时，IP/I=Rseal/(Rs+Rseal)-1
13、。此Ip可为在IV转换器（点线）内的高阻抗负反馈电阻(Rf)的电压降而被检测出。,膜片钳与电压钳的区别 膜电位钳制的方法不同；电位固定的细胞面积不同；研究的离子通道数目不同；,(1)测量部分：(2)串联电阻补偿部分：(3)电容补偿部分：(4)指令信号控制部分：(5)电源部分：,膜片钳放大器主要组成:,电极电流监视器、灵敏度开关、滤波器开关、方式选择开关。,用于校正全细胞记录时，由于电极和细胞内之间的通路电阻所造成的膜电位误差。,用来补偿电压突然改变 时引起的电容电流。,将一定的电压加入到刺激信号中，形成一指令信号的保持电压。进行电压钳制时，它决定膜电位值，作电流钳制时，则决定电流值。,提供放大
14、器各部分的电源。,拉并暴露于空气中,四种经典记录模式(Cell-attached or On cell mode),细胞贴附式膜片（cell-attached patch）,优点：不破坏细胞的完整性，不需要胞内灌流，不影响细胞质且调制系统完整。可研究通过细胞对单通道的调制，也可在正常离子环境中研究递质和电压激活的单通道活动。,缺点：不能改变细胞内成分，也不能精确测定膜电位。同时由于许多细胞膜上存在有牵张激活的离子通道，细胞膜与电极间轻微的张力变化往往会增加记录的背景噪声。,于细胞牢固贴附于微管电极的尖由端而得名。它可用于记录各种细胞的单通道电流，而且是在细胞完整无损的状态下研究通道的活动。,贴
15、附式记录（Cell-attached recording）,内面向外式膜片(inside-out patch),细胞贴附式膜片形后，提起电极时，与电极尖端相接的细胞膜被撕脱下来开成小泡，将电极尖端在空气中暴露几秒钟后小泡很快破裂，形成胞浆侧向外的内面向外式膜片。,特点：较易改变细胞内的离子或物质浓度，也能把酶等直接加入膜的内侧面，适宜研究胞内物质对通道活动的影响。但实验中改变膜外侧物质困难，且需侵入低钙液中，以免小泡形成。,应用：可研究胞内信使物质cAMP、cGMP、Ca2+，三磷酸肌醇（IP3）等对受体型通道的调节，以及胞内激素对通道的调节。这种方式可使通道与细胞的调节机制脱耦联，使第二信使
16、直接作用于膜内，引起通道开闭。,内面向外记录（Inside-out recording）,外面向外式膜片(outside out patch),细胞贴附式膜片形成后，向微管电极内给予较强的负压将膜片吸破，再将电极从细胞膜上拔起，但不暴露于空气中，被撕脱下来的膜便形成外面向外式膜片。,优点：缺点：应用：,可以任意改变胞外物质的浓度，有利于研究递质对膜离子通道外侧面的作用。,实验中难以改变胞内成分，电极管必须充以低钙溶液以防小泡形成。,可研究腺苷酸环化酶、蛋白激酶C等活性变化，以及细胞膜上信使物质二酰甘油、花生四稀酸、GABA、Ach等对受体型的离子通道研究。,外面向外记录（Outside-out
17、 recording）,全细胞记录构型(whole cell recording)记录的电流属于宏观电流（macroscopical current），是整个细胞离子通道活动形成的总和电流。若采用膜片钳放大器内的电流钳模式，还可以记录细胞的静息电位和动作电位。特点：电极管内与细胞之间弥散交换与平衡快，因而容易控制细胞内液的成分；记录的是许多通道的综合电流，需改变内部介质以分离电流；适合于对小细胞的电压钳位，对直径大于30m的细胞很难实现钳制；该方法使电生理研究的重点从无脊椎动物大细胞中解脱出来，而向人类和哺乳类细胞发展。,全细胞记录（Whole-cell recording）,膜片钳制技术记录
18、方式,穿孔膜片记录技术（perforated patch recording technique）,Hom和Marty于1988年首次建立了一种对传统全细胞记录法改进的方法，该方法是基于某些抗生素如制霉菌素（Nystatin），两性霉素B（Amphotericin B）等具有在生物膜上形成通透性孔道的特性，将这类抗生素充灌在电极液中，在形成高阻封接后，可使电极液与细胞内液在电学上相通，因而称作穿孔膜片记录技术。,穿孔膜片及穿孔囊泡记录模式（Perforated patch and perforated vesicle mode）,制霉菌素形成的孔道,电极,受体,离子通道,提起电极,胞浆,穿孔囊
19、泡(外面向外式),穿孔膜片(缓慢全细胞式),技术点的优缺点,优点：与全细胞记录相比，该技术相比有如下优点,由抗生素形成的孔道对于等于或大于葡萄糖的分子均不能通过。因此，在全细胞记录时可避免对胞内重要物质的渗析影响，通道电流衰减现象显著减慢，那些对细胞内通讯及通道调控具有重要作用的第二信使物质仍可正常运行。,因抗生素形成的孔道对多价离子不通透，故胞内的这些离子的浓度就不受电极液的影响。因此可在全细胞电流记录的同时用Ca2+染料测定胞内游离的Ca2+水平,对细胞的损伤作用明显小于微电极细胞内记录及膜片钳全细胞记录，记录时间可持续3小时。高阻封接不易被破坏，而全细胞记录的负压脉动式抽吸和电压脉冲易致
20、高阻封接破坏。电极串联电阻较低，膜电容更易补偿。,缺点：,无法使电极液中的大分子与胞内物质交换。因此研究大分子物质对胞内机制的作用就不能进行。由于电极液与胞内液之间存在Donnan平衡，因此电极液内必须有与细胞内相同浓度的不通透阴离子和Cl-，否则将导致Cl-流出或流入细胞，使阴离子和水重新平衡，最终导致细胞体液变化。穿孔所需时间较全细胞法长。,浓度钳（concentration clamp）,用改变灌流液的方法来改变细胞内液或外液中某种化学成分和浓度。人工地控制膜内或膜外的溶液成分，并在瞬间阶梯式地改变某种化学物质的浓度，这种技术就是浓度钳，也称为化学钳（chemical clamip）,或
21、称浓度跳变(concentration jump)。,人工脂膜的膜电流记录,把构成细胞膜的脂质分子散布于水表面时，很容易形成亲水端向下脂质单分子层，将单分子层背靠背地折叠起来，就形成类似细胞膜结构的人工脂质双层。纯的脂质双层几乎是绝缘的，但是将含有通道蛋白的脂质小泡融入人工脂膜或将水溶性通道蛋白直接插入人工脂质双层，便可利用膜片钳技术记录到单通道电流。,三 膜片钳记录的基本步骤,（一）、液体配制 主要根据研究通道的不同，所用细胞的不同，配制相应的液体，基本原则是保持2个平衡，渗透压平衡和酸碱平衡。另外，所有液体在使用前必须过滤，以保持液体洁净。,（二）、标本制备 膜片钳实验一般是在单个细胞上进
22、行。实验用单细胞主要来自培养细胞或急性酶分离的细胞，也可来自脑片细胞中的原位细胞。常用的酶是胶原酶和蛋白酶，单独或联合使用，有些组织还要加用其它酶，如弹性纤维酶等。,豚鼠心室肌细胞急性酶分离方法 肠系膜动脉平滑肌细胞分离,（三）、微管电极的制备,一般采用常规二步法完成，电极尖端直径在12m之间，抛光与涂布液体硅酮树酯后，充灌电极液。,1、微管电极拉制 2、电极热抛光 3、缘树脂涂抹 4、电极液充灌,（四）、高阻抗封接形成,1在恒温条件下，将细胞贴壁良好的载玻片移入有浴液的浴槽中。浴槽不能太深，以尽量减少电极进入浴液的深度，从而减少浮游电容；2倒置相差显微镜下选择立体感强、活性好的细胞进行实验；
23、3使用新拉制的微管电极，用细塑料管以反充灌方式灌电极液入电极尖端，若含有气泡，可手持微电极使其尖端朝下，用手指敲弹几下管壁即可排除，然后再将微电极安装在探头上。,4 当微管电极在微推进器帮助下进入浴液时，用注射器向电极施加一正压（12cmH2O），以防液气表面颗粒堵塞微管电极尖端；调节放大器上pipette offset旋钮，将电极电压补偿到零。同时由膜片钳放大器向微管电极发放电压为5mV、波宽40ms的方波脉冲信号，用于观察封接过程；,5微推进器将微管电极送入到即将接触细胞时，撤去正压，并继续向选定的细胞表面推进，当电极尖端轻触到细胞表面时其应答电流变小，这时只要给微管电极尖端管腔内施加一负
24、压（1020cm H2O），若在计算机屏幕上看到应变电流突然下降至零，电流噪声随之减少，则提示微管电极尖端与细胞形成近似电绝缘，其阻抗约10100G，说明高阻抗封接（giga seal）形成，这时的膜片为细胞贴附式膜片。在此基础上，根据不同的实验要求，再制成不同类型的膜片构型。,保证高阻封接要点：电极电阻适当；电极尖端清洁；负压抽吸系统密闭；电极与细胞相贴适度；细胞膜清洁，活性好。,膜片钳记录系统示意图,（五）、数据采集与分析,实验中通道电流信号经膜片钳放大器放大后再经12位A/D、D/A转换器输入计算机用于电流信号采集，系统连接如下图所示：,分析的内容,1、宏观电流的分析,宏观电流（macr
25、oscopical current）是指膜上许多通道同时开放形成的离子电流，是由许多单通道电流总和形成的。应用电压钳技术在单细胞或多细胞标本上记录的电流和膜片钳全细胞模式记录的电流都属宏观电流。,（1）、通道的药理学特性,通道的药理学特性是通道分类的重要依据，许多通道具有特异性阻滞剂和激动剂（或开放剂）。TTX钠通道特异性阻滞剂，TEA钾通道特异性阻滞剂，CromakilinATP敏感钾通道特异性开放剂 利用它们可以区分膜电流的成分，有助于确认通道的种类。,（2）、通道的门控特性,通道的门控性主要是指电压门控通道的激活与失活对电压和时间的依赖性。典型的电压门控通道的活动包括激活过程和失活过程。
26、,钠通道门控的H-H模型,（3）、通道的电流电压关系,通道的电流电压关系（current-voltage relationship,简称I-V曲线）是反映离子通道动力学性质的重要参数,可分析通道的激活过程、反转电位、整流特性和离子选择性等。要获得I-V曲线，需要给予连续变化的阶跃式脉冲电压。,、通道整流特性的分析 通道I-V关系曲线与横坐标的交点是该通道电流的反转电位Vrev或称零电流电位。通道的整流特性则是指通道电流对膜电位的依赖性，通常可用I-V关系予以判断。,通道的电流电压关系曲线,整流（Rectification）电流和电压的关系不满足欧姆定律的直线关系。原因是离子通道的开放导致膜电阻
27、迅速降低。整流现象是许多离子通道的特点。,离子通道不开放时膜的被动反应,离子通道开放时膜的主动反应,外向整流随膜电位的去极化，I-V曲线明显向Y轴（电流轴）靠近。如IK电流。内向整流随膜电位的去极化，I-V曲线明显向X轴（电压轴）靠近。如烟碱电流。,IK电流的外向整流,烟碱电流的内向整流,去极化方向,去极化方向,、通道离子选择性的分析 如果通道的离子选择性很高，只能或主要通过一种离子，则Vrev应等于或接近该离子的平衡电位。如果通道通过多种离子，则可利用改变膜两侧某种离子浓度差以后的Vrev变化来判断膜电流中是否的该离子成分。例如If通道的I-V曲线随Na。的增高而右移，Vrev相应变正，说明
28、If通道对钠离子有通透性。,2、单通道电流的分析,（1）、通道门控动力学的分析,典型的单通道电流（single channel current）呈一种振幅相同而持续时间不等的脉冲样变化。它有两个电导水平，即0和1，分别对应关闭和开放状态。,A：豚鼠心室肌内向整流钾通道的单通道电流；B：同一膜片上通道开放（上）和关闭（下）时间频数分布直方图。,（2）、单通道电导的测定,在几个不同的钳制电位下记录膜片上单通道电流，右图为得到单通道的I-V曲线，曲线斜率即单通道电导。,蛙骨骼肌细胞贴附式膜片的记录 A：不同钳制电位下记录的N2型乙酰胆碱受体阳离子通道电流，左侧数字为膜电位（mV）。B：单通道电流的I
29、V关系，膜电导32pS。,I-V曲线（Current-voltage curve）电流-电压关系曲线。可反映通道的如下动力学参数：激活过程 阈电位 反转电位 整流特性,（六）、主要仪器设备 超净工作台（YJ-1450，苏州净化设备公司，China）二氧化碳孵箱（1815Tc，SHEL-LAB，U.S.A）数字式超级恒渐浴槽（HSS-1 CHENDU INSTRUMENT China）微管电极拉制器（PP-83 NARISHIGE Japan）微管电极抛光仪（ME-83 NAEISHIFE Japan）电子刺激器（SEN-2030,NIHON KOHDEN,Japan）,膜片钳放大器（AXOPA
30、TCH 200B AxonInstruments U.S.A）倒置相差显微镜（AXIOVERT 135 ZEISS Germany）计算机（P 800）A/D、D/A转换器（DIGIDATA-1200 AxonInstruments U.S.A）pClamp软件（7.0）AxonInstruments U.S.A)喷墨打印机(HP DESKJET 500 U.S.A),(七)、注意事项,（1）电极尖端抛光：未抛光的玻璃微电极尖端较粗糙，容易损伤细胞膜，玻璃微电极尖端抛光后的口径大小要适宜。抛光后玻璃微电极阻抗应在4-7M之间，随着细胞直径增大或减小，电极阻抗相应减小或增大。(2)装玻璃微电极时，手不要接触银丝电极，银丝电极接通膜片钳放大器，能检测0.06pA电流，若手上带电荷（静电）将可能击穿微电极放大器而造成很大损失。,（3）动手操作要慢：由于该操作大多在镜下进行，放大倍数约400左右，因此操作幅度过大易造成扎伤、扎死细胞，甚至将电极尖端折断。（4）挑选状态好的细胞作为记录对象：细胞状态不好，不易封接成功或维持较长的时间而浪费时间和实验材料，一般首选圆而亮且色泽好的细胞。,（5）实验台和所有实验仪器要良好接地。（6）实验操作台尽可能振动可用减振台或网球置于实验操作台台板下以及将操作台和屏蔽分开，以减缓外界的振动。,
