离心分离原理与应用ppt课件.ppt

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1、离心分离原理与应用,一、离心技术应用与分类二、离心理论与离心实验中涉及到的几 个重要参数三、离心机使用中应注意的问题四、差速离心与密度梯度离心五、超速分析离心简介六、生物样品的预处理七、实验操作实例：线粒体提取，叶绿体提取。一、离心技术应用与分类 1.沉淀分离 2.生物材料制备离心 3.离心分析,1.沉淀分离,1）.用于澄清溶液；离心沉淀清除杂质；生物样品中通过添加沉淀剂、特定溶剂离心除去特定物质或从沉淀中获得目标物。从培养液中，浓缩提出培养目标物；处理大量样品；大批量工业用途的离心分离。2）.普通实验室用离心机、冷冻离心机、血液离心机、工业专用离心机。2.生物材料制备离心1）.用于生物大分子

2、、有机大分子、亚细胞结构、动植物病毒、细菌等的分离、提取与纯化；得到有生物活性的材料。2）.使用设备的有：高速冷冻离心机、超速离心机。,3.离心分析,1）.利用大分子及微小颗粒在离心力场中的生物化学、物理、力学特性，通过光学、电子、照相、扫描记录它们在离心力场中的行为特征，得到表征它们理化特性的参数，沉降系数S值、扩散系数D、分子量M、浮力密度；生物粒子结构研究、组分分析等。2）.设备：分析离心机、有分析系统的离心机。,二、离心理论与离心实验中涉及到的几个重要参数,1.离心分离理论2.离心实验与离心设计中的几个重要参数3.离心实验中转速与离心时间的计算与选择1.离心分离理论1）.物质在离心力场

3、的作用原理2）.颗粒的离心沉降理论（1）.物质在离心力场的作用原理离心技术是根据物质颗粒在离心力场中的行为发展起来的。不同质量、大小、形状的物质颗粒在离心力场中受力的作用,产生运动的速度取决于该颗粒处于所在离心力场（G）中所受离心力作用的大小。可由离心力场转头的角速度（以弧度/秒表示）和颗粒距离,旋转轴心的辐射距离（R，以厘米表示）来决定 即由下述方程表示。转头旋转一周等于2弧度，转头的角速度（r/min）可表示为：离心力场为（2）相对离心力加速度（RCF）离心力场一般用相对离心力场以重力加速度常数g(980cm/s2)的倍数来表示，即RCF的单位为g。,相对离心力即为 上式n代表（r/min

4、）可简化为：RCF=1.11910-5(rpm)2R（r/minrpm）RCF：RCF值一般即为我们离心时所选择使用的离心力的大小，如选用离心力的十万g离心。即表示为100000g 这里g代表离心力场单位，不可分开。g为重力加速度；（g）表示重力加速度的倍数。2）颗粒离心沉降理论（1）粘性介质溶液中的沉降作用 颗粒沉降行为及其运动速度不但取决于在所提供的离心力场中受到的离心力作用大小，也取决于颗粒密度、半径、形状，以及悬浮介质的粘度、密度等因素的作用。,R：用cm来表示,根据斯托克斯（S.G.Stokes）定律，粘滞液体中的小球在离心力场中受离心力作用产生运动，通过液体介质时受到反向磨擦力，粘

5、滞阻力（即阻力Ff）的反向作用。这个粘滞阻力为：,式中：流体的粘滞系数 r颗粒球体半径 a不对称系数（如颗粒非球体时短与长径比）c移动速度 由阿基米德原理，介质液体中的颗粒受到浮力Fb的作用等于颗粒排开液体 介质液体的密度,颗粒所受离心力Fc则为：小球体的密度小球重为、浮力为当颗粒小球在Fc、Fb、Ff的共同作用下，在介质液体中运动达到平衡以匀速运动时，所受力系也达到平衡，其表达方程为：即 当小球为圆球体时,（2）沉降速度设小球直径为d，在离心力场中有式在重力场单位下，以Stokes定理表示的颗粒的速度。,从式中可见，球形颗粒的沉降速度不但决定于所处离心力场，也决定于颗粒的大小、密度与介质密度

6、以及悬浮介质的粘度。（3）沉降系数如果用S值定义为单位离心力场沉降速度即有,2.离心实验与离心实验设计中的几个参数,1）沉降系数S S值是表征生物颗粒理化特性的参数。它在一定程度上反映了生物颗粒 的大小与结构；未命名的有稳定组成结构的生物颗粒常以S值来表示。悬浮于离心力场中介质液体里的颗粒粒子，在离心力与反向的浮力，磨擦粘滞阻力的作用下，达到恒定的匀速运动状态。若忽略粒子受到来自四周无规力及对粒子行为影响微小的其它作用力如重力等的影响，粒子则受三个作用力，即离心力Fc=2rm；粒子置换了一部分溶液而产生的浮力Fb=m02r；磨擦力Ff=f v。粒子在近三种力的作用下进行匀速运动。则即 式中：粒

7、子运动速度 f 磨擦系数 m粒子质量 m0粒子置换液体的质量,以粒子的质量乘以偏微分比容和密度来代替被置换的溶液质量m0。即 代入上式偏微分比容:是生物大分子的一个理化参数,与大分子本身的结构有密切关系。其定义为1克大分子溶质溶大量溶剂中发生的溶剂变化。(生物大分子的偏微分比容值基本上在0.6-0.75范围）。,沉降系数S定义：单位离心力场之速度即 S是反映离心力场行为特性的重要标志。沉降系数S单位量纲为秒。由于我们研究的颗粒很小（m-nm级），S值一般也很小，以10-13为一个基本单位S。为记念奠基人Svedberg的贡献，S称为Svedberg常数。即1s=10-13秒。S是具有时间因次的

8、量。S值的大小反映了物质颗粒的大小与结构，物理上的意义是单位离心力场的沉降速度。因次是cm/秒/达因/克。,2)分析计算基础,（1）超速分析离心测定的S值计算 沉降系数S值是分析离心要取得的重要的生物大分子颗粒理化特性参数。由前所得,(a),又可写为,积分,超速分析离心过程中通过专门的光学设备如UV光吸收光路系统，Schliere光路及光干涉光路系统对不同时间下颗粒粒子在离心力场介质中移动的位置进行电光扫描记录或照像记录。对得到的检测记录图经过分析计算就可以得到该粒子的沉降系数S值了。（2）S值校正 为了有一个统一的标准便于比较，将任意介质中的S值要统一校正到标准条件下20以水中的S值。设一观

9、察条件下的某介质下的沉降系数为Sobs。可表达为,T：实验温度 Sobs表观S值=实验温度下溶剂对水的相对粘度：实验温度T时水的相对粘度：20，水为溶剂下的S值,（3）扩散系数D、分子量M与Svedberg公式作用于一克分子溶质上的总离心力F（1）（M：溶质分子量，溶质分子微分比容，介质密度）,溶质分子沉降中受介质的磨擦阻力为,分子受离心力与反向磨擦力平衡时,（2）为沉降速度,（3）,（M：溶质分子量，：溶质分子微分比容：,当达到稳态作用于溶质分子的净力为零，溶质分子以恒速沉降在单位离心力场中溶质分子的沉降速度为：（4）（4）代入（3）得（5）假定溶质分子在溶液中沉降受溶剂分子阻力与扩散阻力相

10、同，则（6）（D：扩散系数 T：绝对温度 R：气体常数）（6）代入（5）即 Svedberg 公式(b),3.离心实验与离心设计中转速与离心时间的计算,1）沉淀离心中转速与时间的计算（1）离心力场一般用相对离心力场（RCF）以重力常数g(980cm/秒2)的倍数来表示。因此（1）：指平均半径（cm）已知所需RCF的g值，则速度（2）,也可简化为：（3）r/min=rpm(2)粘滞介质中的沉降速度与时间计算 一个微小球形颗粒的沉降速度不仅取决于所提供的离心力场，也还取决于颗粒的密度、半径、颗粒的形状，以及悬浮介质的粘度。因此，在一个特殊介质中使一种球形颗粒从液体的弯月面沉降到离心管底所需要的时间

11、（这与沉降速度成反比）可由下式得到。（4）t：沉降时间：悬浮介质的粘度(泊)：介质的密度(g/cm3)0:溶剂密度 Rmin：旋转中心到液柱弯月面距离 Rmax：旋转中心到管底的距离（cm）,(3)影响离心沉降的因素 如果需分离的粒子为近似球体，不知其S值，已知其平均值径（d:cm），及其密度（），溶剂密度0（克/厘米），与溶剂粘度（泊）。（=0.01泊，20水）t：分钟 一般沉降时间与离心温度、溶液浓度、粘度、粒子的形态等正相关，相对20水，离心温度每改变0.40C离心时间需要改变1%，样品粘度比20水的粘度大1%，沉降时间就增加1%。沉降时间与颗粒密度成负相关，其密度增加1%，沉降时间减少

12、1%。(4)颗粒形状对离心沉降的影响 粒子形状：球形与椭园体沉降时间可按下式，沉降时间对直径比的倍数关系估算。,2）.差速离心中的转速与时间（1）差速离心中常使用角转头，颗粒由斜的管子内侧向外侧沉降，在外侧沿管壁流动，受力作用，界面的移动可表达为。,b:最大转头半径a:最小离心半径X:颗粒移动界面的位置,界面,Rmax,图3-3,任一离心机的加减速曲线不同，与转头、电机、实验操作的重复准确性有关，实际有效时间,如分离物的S值为已知（查表或实验测）要把其中所有大小为某s值的物质全部沉降下来。（5）取对数 因为（秒）(6)则：或（7）例如：在a=4.4cm，b=8.9cm（转头参数），rpm190

13、00，求：某 物质全部分离的时间t。分钟,（2）生物样品rpm、t的校正生物样品在不同液体介质下，不同温度下需要进行实际实验条件的离心速度和、时间的校正到标准条件。a.对于实验温度条件的S值修正公式：（8）修正到20下水的粘度则时间 一般相对20水，水温度改变0.4，离心时间改变1%。管内温度由20改为0时离心时间要增大50%。粘度有很大变化时离心时间也应校正。粘度改变1%，t也相应改变1%。浓度如增加1%，对球形粒子离心时间要增加5%，非球体或线状分子浓度增加1%，离心时间t要增加510%。,b.例如：某，水为溶液，浓度为1%，300ml、4下离心，选用850ml转头，a=4.4cm,b=8

14、.9cm，选择2小时。因为t在温度为4时估算时间t应增加，故时间应该校正为168分钟。用水为溶剂就不用做粘度校正。浓度为1%，如果粒子是球状分子离心时间应增加5%，Ts=176分钟。样品如果是不对称体应增加Ts=185分钟。可见选择的速度高可以减少离心时间。,（3）最大允许转速的选择制备转头管内充溶液比重大于1.2g/cm3 则最大允许转速降为 D：为使用溶液的比重 rpm：转头最大许用转速 分析转头：充注溶液比重大于1.7g/cm2则大允许转速降为 使用不锈钢管子下，最大转速小于最大允许转速的75%。,3）由K系数与Pi系数计算离心时间K系数（Kfactor）是表征离心机转头离心沉降效率的特

15、征参数。它与转头的几何结构、转头的旋转速度有关，K系数值越小转头的离心分离效率越高。正确掌握、合理使用K系数对离心实验的设计，对离心设备、离心转头的合理选择以及确定离心速度、离心时间都含有很大帮助。（1）K系数 离心实验中，沉降特性一般是用沉降系数S值来表示。用微分定义沉降系数 对上式积分 如S值已知沉降所需要的时间T（即t2t1），为简化沉降时间的计算,(2)非球形颗粒的实际K系数,假设计算中是采用球形颗粒的计算值,对非球形样品颗粒化成长,短径之比为a的椭球体来估计沉降时间Ts可表达为:T=Ts.K K与a的关系按经验公式 a 1.1 3:1 5:1 10:1 20:1 K 1 1.1 1.

16、25 1.5 2,离心沉降时间（小时）,（3）Pi系数：一般超速离心转头资料中给出K系数，高速离心机转头资料中往往给出Pi系数（Performance index）。Pi值定义为：（2）Pi值与K值的关系可表达为（3）离心沉降时间（分）d:颗粒直径Pi系数与K系数都分别用于离心沉降时间的近似计算。（高速离心往往给出Pi值）,3.离心机使用中应注意的几个问题,1.平衡与动平衡2.转头使用与防护3.临界速度与共振4.离心管使用注意的几个事项5.梯度介质使用中应注意的几个问题,1）离心中的动平衡 高速旋转的物如果存在不对称力的作用，高速旋转的物体其自身物质质量、质点分部不均匀，都会产生不平衡问题。高

17、速运转的机械要进行动平衡，以克服旋转物体因质量不对称产生主惯性中轴线与机械轴线发生相对移动，质心不能通过轴心；材料组织疏密不均匀，产生的质点分布不对称、物体质心与几何形形心不一致造成物体在高速旋转下产生动不平衡。引起产生了附加力与力矩的作用。高速运行的离心机转头，相对离心场力RCF高达几十万上百万。在这样强大的离心力场 下很小不平衡质量就将产生很大的离心惯性力，这将会引起产生振动、会降低机械效率，增加动负荷、使仪器零件过早磨损，影响仪器使用的效果、使用精度、使用寿命，严重时会导致仪器损坏。,国内使用的超速、高速离心机发生过许多起转轴弯曲，断裂事故。许多都是与平衡、动平衡的影响有关。发生事故的原

18、因很多，但就装入转头的样品需要平衡来说，除了运转前要按规定对装好样品的离心管进行称重平衡（即平衡）外，还需要注意样品对动平衡影响。2）动态不平衡的产生：如果一对经过天平称重平衡的对管。一支管中装入小分子溶剂如水做配平，另一支管中的装入需要分离的，离心后会生沉降的样品，高速离心力场下溶剂管中没有密度分布的改变和沉淀产生，质心不变。发生沉降产生沉淀的管内物质分部改变质心随之改变（向后移）。这改变就会导致质心不对称，力矩不平衡，产生动不平衡。质心也会因样品不一致、比重不同则体积不同而不同。另外，密度梯度离心中一对称重平衡对管铺制的梯度形式不一致也会产生重心位置高度不一致，受力就不平衡，力矩不对称，这

19、将会对转轴产生有害的影响。,3）克服动不平衡的方法（1）高速度离心时，对于沉淀量大的样品，要先低速除去大的颗粒，充装管时注意控制一对对应管中沉淀量应大致相当。（2）不要用密度不同的样品或与水组成一对对管。（3）尽量使一对对应管中不仅重量一致，而且体积也相同。（4）离心管帽要事先平衡，不同材质，不同机型的管帽重量不同，不要混用。（5）阶梯密度梯度液铺置时，一对对应的对应层铺置同密度液体，体积也要相同。线性密度梯度铺置时，应注意线性度一致，数量相同，重量一致，使用的梯度仪所制备的梯度精度要可靠。,2、转头的安全使用注意事项与保护,1）转头使用时，一定要盖上防护盖并拧紧。不盖防护罩会增大风动阻力，造

20、成负荷过大，运转不稳定产生振动。2）转头一定要确实稳定地装到轴顶端，来回旋转几次确定转头已落实按到位置。不的架空，否则会损坏转头及转轴。3）装入转头的离心管样品液，充注量按转头类型与规定的要求充装，不要超过规定。以防止样品液体流出，污染转头破坏平衡；引起振动。,4）钛转头材料强度高、耐腐蚀、耐高温，可以耐PH3.511的条件下，酸碱性及金属盐对它的腐蚀作用。可作为首选。钛转头抗腐蚀能力也大大强于合金铝转头；但它的价格比较贵。5）为了防止腐蚀及隐患的发生，转头使用中应该注意离心管的样品充注量及密封的严密性，经常检查封圈是否完好。如果发生老化、破损应时更换，避免发生漏液，防止有腐蚀作用的溶剂与转头

21、直接触。6）转头使用完后要及时冲洗、擦拭并喷涂保护剂，涂抹保护油脂。转头使用完后要及时从转轴上取下。,7）机械损伤也是造成转头损伤引起腐蚀的一种原因如碰擦损伤保护层。因此，搬运转头应小心轻放,转头存放的环境应该保持干燥，置于专用架子上，放入柜中或放入装有吸湿硅胶的干燥器内。以免不良环境对转头造成腐蚀，降低转头的使用寿命。8）不得试图打开正在运行的离心机转头腔的保护盖，不得用手触摸旋转运行中的转头。,3.临界转速与共振,旋转的物体其质心如果相对于旋转轴发生了偏离就会产生横向振动。如果该物体产生的振动频率与驱动系统固有频率重合就会产生强烈振动即共振。例如步行的队伍可能引起产生的振动与大桥的共振的频

22、率产生共振会引起大桥坍塌。质量不平衡产生的振动与离心机本身机架振动频率重合形成共振的振动，对离心效果及对离心机本身都会产生不良影响。这种振动有一阶、二阶、三阶振动，其中一阶振动影响最大，二阶、三阶振动影响递减。共振产生时的速度就称为临界转速。各类离心机都注意采取了防止共振、减小振动的措施，如挠性轴、移动轴承、机架滑动、阻尼材料、结构设计改进等，尤其，现在新型的高速、超速离心机都有34种防护措施。,对使用来说越来越安全可靠。对我们来说在使用中应该避开使用仪器产生共振的临界转速，如果遇到振动强烈应该查找产生不平衡与动不平衡的原因，采取措施。可以通过提高或降低运转速度避开共振点，避免在共振点使用，即

23、在临界速度下运行。使用前要预先预热仪器，预先预冷转头、减少压缩机频频启动引起的振动。使用时，如果发生的振动强烈或有异常声响，应该立即停机检查，看转头是否安装好，是否有漏液发生；离心管充装是否正确，是否有不平衡。转速的设定是否超过规定。,4.离心管使用注意的几个事项,1）选择尺寸大小合适的离心管（与离心转头配合的离心管），不宜选用玻璃试管。不要随便配用。2）对于遇到有腐蚀性溶液的样品、及对塑料离心管有腐蚀作用的有机溶剂时应选用不锈钢管。3）PC管：透明、强度高可于用高速、超速离心；但抗化学腐蚀性较低；尤其对有机溶剂、乙醇等，耐腐蚀性差，应避免在高浓度下使用。4）PA管：半透明、化学抗性较低比PC

24、管好，但也要应避免在强有机溶剂条件下及腐蚀性溶液高浓度的条件下使用。5）.离心管使用中，应盖好离心管帽，样品充注的量不要超过限度，以免溅出、泄漏相互污染，平衡被破坏引起振动。6）有抽真空条件离心腔室，装入转头时，不仅要注意密封好离心管帽，也要注意密封好转头盖；注意橡胶密封圈的老化及用真空脂均匀涂抹。7）使用前先了解不同离心管材料的化学抗性。,5.梯度介质使用中的几个问题,1）平衡等密度梯度离心中,使用的梯度介质,形成梯度密度分布范围与选择的离心转头离心速度,离心密度等离心条件有密切关系.如果梯度的密度范围超过了,该介质的最大浓度,就会产生结晶,这对离心机的安全有很大危险.例如CsCl的最高密度

25、为1.92g/cm3(250C),如果超出产生结晶,结晶浓度 4g/cm3,会对塑料离心管造成损坏,腐蚀转头;也可能直接造成转头损坏.2）梯度材料的密度范围；梯度介质的理化性质如蔗糖高渗透压、高粘度等都是考虑因素。,四、差速离心与密度梯度离心,1.差速离心2.密度梯度离心,1.差速离心,1）分级离心：离心管中装有的溶液样品中如含有大小不同的颗粒，离心时，颗粒移向离心管底部并在管底沉淀。离心中各种颗粒具有不同的沉降速率，如选择的离心力大小与离心时间到刚好足以使其中所有最大的一种颗粒全部沉淀。这样将得到没有最大颗料的上清液；这个上清液在更高的速度下离心，以分离第二大的颗粒，如此继续分离第三大的颗粒

26、等分级离心。但缺点是得到的沉淀将时不均一的。如果样品液中所含组分的沉降系数相差10倍以上时就可以利用沉降速度的不同进行分离。（1）如含有一样品含有100S、10S及1S的三种颗粒的样品，进行选择离心。,（2）洗沉淀的差速离心 是一种通过重复几次离心，将逐次溶解后的沉淀反复重复离心来改进差速离心的效果，获的比例显著提高的大颗粒。如果一样品中的三种颗粒大小较大差别为,选择的离心力与时间刚好达到使最大颗粒刚好都沉淀同时有一半中等颗粒和1/10最小颗粒也沉入沉淀。可以将沉淀溶解重新重复离心，此时沉淀中等颗粒含量为25%，最小颗粒为1%。该方法重复几次洗涤就可获得均一的纯度较高的一种颗粒样品。对于大小颗

27、粒同时存在，相差较大时，经过几次洗涤离心，就可以把它们有效地分离。但一般在实际中差速离心不用做精细分离,洗沉淀,洗沉淀的离心的次数只作三次.,（3）差速离心适用的范围 差速离心适用于分离颗粒大小差别较大的样品及密度相差较大的样品。通过选择高速、低速几次组合循环，一般可分离两个S值差别小到10%-20%的组分。分离提纯 如从细胞均浆中分离病毒时，先选用低速清除细胞碎片，结合选用不同溶剂溶解萃取有机物，选用沉淀剂沉淀蛋白质等除杂质。再高速沉淀下病毒，然后重新溶解反复使用高，低速离心。一高、一低为一周期，若干周期为差速离心。差速离心常使用角转头。,(4)对于活性生物材料选的离心速度,即离心力场RCF

28、不能太大,否则过高的离心力.会使样品材料造成不可逆的伤害。(5)差速离心一般适用于S值相差10倍以上的两种颗粒的分离提取.,2.密度梯度离心,1）速率区带离心（ReteZonalentrifugation）以物质(颗粒)的S值差异为基础,在密度梯度中,依其沉淀速度不同形成分离的区带,进行分离的技术叫速率区带离心。该方法使用梯度介质的最大密度要小于需要在该梯度中沉降中的最小样品颗粒的密度。梯度介质按下重上轻铺在离心管中，这里密度梯度的主要作用是为了防止形成的区带由于对流而引起搅混。样品铺在梯度介质项部，在离心力作用下，颗粒通过梯度介质沉降形成一系列不连续区带（如图）这里梯度介质的作用主要是稳定沉

29、降的区带,减缓粒子的沉降。,速率区带离心所使用的梯度，斜率（d/dr）较小，即梯度变化比较缓慢。离心过程中由于不同组份颗粒在梯度液中沉降速率的差别形成了数个含单一组份颗粒的沉降区带。离心过程中在最重的颗粒（或沉降最快样品）达到管底形成沉淀前就停止离心。样品在离心后与梯度液一起收集。每个单一组份的沉降速率取决于它们的S值大小、形状、尺寸、密度及离心力的大小，梯度液的密度和粘性系数。离心一段时间后，各种颗粒将按它们的相对速度移动而各自分开形成一系列区带。这种方法中，可分离沉降系及S值差别为20%左右颗粒。,速率区带离心中延长离心时间,样品颗粒就会通过梯度沉降到管底.为了避免样品颗粒沉降到管底,可在

30、管底加一层密度大于样品颗粒的高密度的衬层底缓冲层溶液。一般该方法使用水平转头。该方法一般使用时间2-4小时，时间比差速离心略长。梯度的路径长度必须能使颗粒充分呈现分离。速率区带离心分离样品的承载量如明显小于差速分离.但该方法的分辨率和提取纯度比差速离心好。,2）等密度梯度离心法 Isopycnic Gradient centrifugation（1）等密度梯度分预形成梯度与自成形梯度；自形成梯度是将符合能在离心力场中形成梯度满足样品分离需要的物质与样品混在一起；通过离心，介质形成密度梯度,样品颗粒分布在各自同等密度的位置上。预形成梯度是预先将梯度液按浓度大小铺置于离心管内,它又分线性梯度与阶梯

31、梯度,线性梯度有梯度仪制备,阶梯梯度由手工铺置而成.,（2）等密度梯度介质的最大密度大于样品粒子最大密度，样品密度介于梯度密度最大与最小之间，样品将不能达到离心管底部。由于密度梯度范围包括了要求分离颗粒的密度。当离心中所要求分离的微粒沉降到达与其等密度位置时，就在这里浓集成样品区带。此处梯度液密度与样品在此处梯度液中的浮力密度相同。即此处浮力项为零（1-v）=0。此处颗粒受力几乎为零。等密度梯度离心分离效果取决于样品颗粒的密度差，密度差别越大的样品分离效果越好。分离效果与颗粒的尺寸大小、形状无关。样品颗粒大小与形状在这里只与到达等密度区所要求的速度，离心时间和区带的宽度有关。,等密度梯度离心使

32、用的梯度一般使用阶梯梯度通过扩散形成，或通过梯度仪以线性形式铺置于离心管中，将要分离的样品悬浮置放于密度梯度液上。此处介质密度要稍高于梯度液的密度，样品的量不能过大，否则会有沉降混搅，倒置发生。使用的梯度悬浮介质的性质可能会影响。一些亚细胞颗粒具膜，如溶质可以渗透进入到颗粒中则从而会改变其密度；例如溶酶体，在蔗糖梯度中平衡密度会从1.2降到1.10。线粒体，和过氧物酶体等样品的分离再就会遇到这类问题。,（3）等密度梯度离心一般使用水平转头。样品颗粒的密度须小于密度梯度最低处密度。样品颗粒的密度必须全部包含在梯度密度范围以内。离心运行的时间也要须充分地长。能够使颗粒到达其等密度位置。颗粒在其等密

33、度区带处受力为零。（4）.“过垫”一般是指离心管内只铺少数二一四层密度介质，所要分离的样品密度小于最底一层梯度介质的密度而大于其它层梯度介层密度。小于设计样品密度的物质被上层梯度介质阻挡而悬浮其中；大于最大密度的杂质通过“垫子”沉降于管底。所要分离的样品颗粒悬浮于底层“垫子”之上形成区带。该方法使用中虽然分离范围有限，但对只需分离单种颗粒却很方便，尤其在亚细胞组织及一些病毒分离中使用较多。缺点是分离纯度稍差一些。但所需离心时间一段相应要短一些。铺制的梯度要求两层梯度液界面要尽可能清楚不要混淆；梯度液临使用前铺制。,（5）等密度离心法的分辨率和颗粒回收的纯度都比较高.缺点是需要的时间比较长;平衡

34、等密度自行成梯度的时间长;使得样品颗粒长时间与高浓度介质接触,其形成与活性难免会受到损失.（6）预形成等密度离心使用的介质多大为蔗糖、甘油、Ludor一般等价格便宜,来源方便，实验室使用较多，实验中得到普遍应用。（7）自成型等密度梯度的介质多为CsCl、CsSO4等重金属，梯度在离心过程中形成。,3）平衡等密度梯度离心（Equilibrium Density centrifugation)(1）该方法主要特点是利用样品粒子浮力密度的不同进行分离。梯度介质材料在离心中沉降的速度远大于浓度的扩散速度，可以自形成连续的密度梯度。选择梯度介质的密度范围要包括所有待分离粒子的密度。梯度介质往往也要选用铯

35、盐，铷盐等重碱金属类，这些在经一段超速离心过程分后经离心力场的作用可以自行成浓度分部梯度的梯度介质。离心时样品混合在梯度介质液中，随离心过程梯度介质形成密度分布的变化或上浮度或下沉，一般需要离心时间较长。例如DNA在CsCl梯度介质中形成等密度平衡区带需要30-40hr。提高转速只会使梯度物质重新分布及区带位置会有所变化。沉降速率法是一种动力学方法关键在于选择适合于分离物质的离心力及离心时间而沉降平衡等密度方法是一种静力学方法，关键在于选择合适的密度梯度溶液的材料。,平衡密度梯度离心区带分布稳定，分离效果好，但使用的梯度介质一般较量贵，离心自成梯度消耗的时间长，成本较高。用时过长的运行也会有逆

36、效应.样品一般可以均匀混合于梯度介质中也可加在梯度介质液项部。自形成梯度的平衡等密度梯度离心中为了促进梯度生成减少离心时间，实验中对该种方法的梯度介质也采用预成阶梯式线性梯度的方法铺制。平衡等密度离心有较大的样品容积量，不需预制梯度、手续简单，被分离组份都处在各自较窄的纯样品区带内，可得到较高的分辨率。平衡等密度梯度介质一般价格较贵,介质多为CsCl、CsSO4等重金属，梯度在离心过程中形成。不宜回收处理,同时一般用的时间较长。,密度梯度曲线中一点最终斜率d/dr。,4)自形成梯度密度梯度设计：梯度由线斜率：,5）密度梯度离心的特点：综上所述:（1）分辨力高，一般可分离S值差别小到10-20%

37、,密度差小到0.01mg/ml0.02g/ml的两个组分。可由颗粒大小（沉降速度），和密度（浮力密度）这两个因素来达到分离的目的。（2）抗对流性，抗扰动性能好，能较好地抗温度变化及加减速引起的扰动。（3）样品悬浮于梯度介质中不形成沉淀，适宜于组织脆弱样品的分离，对保持样品生物活性有益。（4）样品处理量较大，而且可同时处理几个样品。（5）分辨率与制备的梯度，离心时间，加减速，等有关。如使用水平用转头25000r/min，长离心管线性梯度式等动力梯度可以把S值相差40%以上的颗粒分开。使用陡峭梯度（例如10%-50%蔗糖梯度）35000r/min下可以把10%S值差别的组分分开。然而转速过高，会降

38、低区带容量，过载也会使分辨率降低。(6)区带转头.连续流转头可用于大批量样品的处理.,6）分离后区带的回收：（1）针头定向吸取法：用直角弯针头插到样品分离区带的下部用注射器吸取。（2）连续吸取法：用与蠕动泵相连接的吸管插入到离心管底部、通过蠕动泵抽吸作用将梯度液自下而上连续吸取，通过UV流动监测检测、扫描记录仪、记录下样品峰的位置、高度、宽度；计滴器控制部分收集仪步伐收集；也可由梯度仪控制下由上向下吸取。（3）切割法：在离心管上对区带位置与宽度尺寸做好记号后冷冻结冰后；用切割器切片取下区带层。切割法使用条件是对可以用眼睛观察判断区带位置与宽度的而言；优点是取的区带整齐干净污染少，缺点是需要专用

39、设备、离心管一次性使用。（4）穿刺法：直接穿刺法是用针头直接插入到区带下部吸取。底部穿刺法是在离心管底部穿一小孔，在控制流速不产生扰动下分部分收取。（5)顶推收集：离心管顶口盖上顶盖、压紧密封后从管顶插入一导管到管底部。通过蠕动泵经导管注入高密度介质，迫使梯度液逐步升高从盖上另一出口逐次流出，同样经过紫外流动监测、扫描记录、部分收集。（顶推液一般使用高浓度蔗糖溶液。）,1.分析离心 使用分析超速离心机进行沉降分析，利用高速运转产生的强大离心力场、使用光学检测装置及电子控制装置检测溶液中容质或粒子的移动速度；或相对较低转速下高分子溶质在较小离心力场内沉降（产生浓度梯度）和扩散（减少浓度梯度）；这

40、两种相反的作用经过一段时间达到平衡，检测溶质在离心池中的分布。超离心分析离心技术中称前者为沉降速度法，后者为沉降平衡法。沉降速度实验中，离心机转速可达6-10万rpm，或更高，从而使均匀分布在离心池中的溶质分子，颗粒粒子，以一定速度沿离心力方向向池底沉降，溶质分子沉降的结果可形成一个只含溶剂分子的区域和另一个称为“坪区”的溶液浓度均匀的区域。在上清和坪区之间有一个过渡带。此带中沉降物质的浓度随距旋转中心的距离而改变、此过渡带称为“界面”。沉降速度法就是用光学方法观测面的移动、即测量坪区溶质分子的移动。如图：,五、超速分析离心简介与离心机机构,如果样品溶液中有两种沉降分子或（粒子），他们的沉降系

41、数不同就会形成两个界面就可观察到两个沉降峰（schlieren）。如果一个待测样品系统含有多个沉降组分，每个组分都可得到一个界面，从这此界面移动的速度就可分别计算各组分的沉降系数。,2.沉降系数S值的测定,沉降系数S值的测定 根据公式（a）由界面位置的对数与时间的线性关系的斜率计算沉降系数。1)实验操作 用样品液充注一只扇形杯（10mm），用缓冲液注另一扇形杯作为对照。,选择速度：该速度下溶质1.5-2hr内能够全部沉降，一般先试作估计。选择实验时间：调节使样品在实验期间能够扫描6-10次。扫描可在同一张图上或分开进行。2）sclieren扫描图测定：（1）图的数据处理 取参考缝中点R1、R2

42、,界面PP峰的最高点为P1，M1、M2为气液面。（2）测OR、R1R2 放大倍数确定：m（3）计算移动界面的距离r1mOR1R1P1（cm）r2mOR1R1P2(cm)（对每一次扫描找一OP）,（4）对r1rn取对数求log r，作log rT的图。其相关性通常是一直线。所求得直线的斜率：（t为扫描间隔：分）求：Y=a+bx r：相关系数95(线性度要求）,求S值代入公式（3）Sobs b 最后化为200C水为介质粘度的标准状态下：S20 Sobs T：实验温度，solv：溶剂，Sobs：表观S值。实验温度下溶剂对水的相对度。实验温度T时，水的相对粘度。,3.沉降扩散法测分子量（schlier

43、en法):1）强大离心力场中,大分子溶质沉降.大分子溶质受两个力的作用;离心力和移动时的阻力.当这两力平衡时,大分子恒速沉降运动速度dr/dt满足下式:M:是分子量:溶质的偏微分比容:溶液密度 f:摩擦阻力系数 f 随分子的形状大小、溶剂粘度、大分子与溶剂分子间相互作用而异.,如大分子在溶液里沉降所受溶剂分子的阻力和大分子在溶液里扩散时所受的阻力相同则:f=其中 D:扩散系数 R:气体常数T:绝对温度 单位离心力场下的沉降系数是S=所以 M=（b）我们可以在相同条件下测定沉降系数和扩散系数以及溶质偏微分比容和溶液的密度.从测定的S值与扩散系数D代入(b)计算分子量.,4.用sclieren光路

44、测扩散系数D,1）方法一(1)使用合成界面杯一般用下充注杯小圆孔内加0.1-0.15mml高密度样品，离心池内装0.3ml缓冲液。(2)扫描时间间隔应梯度增加，第一次隔10分钟，第二次隔20分钟，如第三次就隔30分钟后扫描。(3)取基线时应取在峰曲线底部的招点处（此处光为光入界面处，取的基线位置不适宜就会影响D值偏离)。,扩散系数图,7.离心机结构,1）分析离心机结构分析离心机主要由固定于机架上的转子室、转头、驱动系统、温度检测与控制系统、真空系统、转子转速的监控与控制系统、电子电路控制和操作系统，防过速与不平衡保护系统、润滑油循环系统、光学检测与扫描记录系统组成。,2）超速制备离心机结构,超

45、速制备离心机主要由固定于机架上的转子腔室、转头、驱动系统、温度检测与控制系统、真空系统、转子转速的监控与控制系统、电子电路控制和操作系统，防过速与不平衡保护系统、润滑油循环系统。,3）高速离心机结构,高速制备离心机主要由固定于机架上的转子腔室、转头、驱动系统、温度检测与控制系统、转子转速的监控与控制系统、电子电路控制和操作系统，不平衡保护系统。,4）离心机转头与使用（1）分析离心转头与分析杯 分析转头主要用铝合金或钛合金制造，有双孔、四孔、六孔之分，分别放入相应数量的分析离心杯。分析杯由杯芯、杯壳、石英窗、窗座、密封圈、压圈构成。杯壳一般使用合金铝，杯芯用特氟纶，通过压圈上的螺纹来压紧组合。杯

46、芯扇形槽内充装样品。,分析杯,（）制备离心转头,a.角度转头放置离心管的孔与旋转轴线成一定夹角，转头整体性好，旋转中引起的涡流小、发热低，k值小分离效率高。一般做为样品的分离提纯和浓缩使用。超速离心的离心管配有密封管帽可防止漏液。离心管有塑料管与不锈钢管。,角转头,b.水平转头 转头上装有三个、四个或六个吊篮、离心管置吊篮内，转头旋转时吊篮随即向外摆至与转轴成垂直。水平转头中的样品液不容易产生对流扰乱，相对角度转头样品离心中更稳定，适用于密度梯度离心。,水平转头,垂直转头,C.区带转头 分一次性区带转头、连续性流动转头及再定向区带转头。区带转头没有离心管可方便坼开清洗，中部由扇形板分开以减少涡

47、流现象。该类转头一般容量较大。适用于批量样品制备。,d.垂直转头 这类转头特点是离心管竖直放置、平行于转轴。用转中样品分离区带平行于旋转轴，停机后垂直于旋转轴、重新定向。e.淘洗转头 主要用于单细胞、细胞核、（如血液细胞）的分离。f.土壤转头 用于土壤含水量检测。,六、生物样品的预处理,1、生物材料的选择动物、植物、微生物主要考虑生长状态或生长期不同的组织或器官，样品取材的难易、丰富程度、处理困难度，要尽量减少对提取目标物的污染、干扰及对以后分离纯化及检测的影响。如选植物根部、块茎可减少叶绿体、叶绿素的干扰和污染。,2.细胞材料的破碎,机械法：组织捣碎机、玻璃匀浆器、研钵研磨。物理法：反复冻融

48、法（15-20，主要用于动物细胞）；冷热交替法（90-冰冻，主要用于细菌病毒）。超声波处理法：多用于微生物。化学与生化法：自溶法（在一定的条件下加防腐剂，自身酶系破坏细胞，因时间长不易控制，一般用的少），溶菌酶（破坏细胞壁）、纤维素酶（用在植物细胞上），表面活性剂（SDS和Triton-100等）,3.提取的保护体系,缓冲液用以保护适当的pH范围；配合适当的离子强度；EDTA螯合来保护有害金属元素的伤害。细胞膜、亚细胞的渗透保护（0.3mol/L甘露醇，0.25-0.35mol/L蔗糖对线粒体及叶绿体的渗透平衡保护）；Vc、pvp、巯基乙醇等的抗氧化保护，对氧化过氢化物、酚类物质的保护。低温环

49、境条件下生物活性与酶类活性的抑止作用；加入BSA抵抗脂类毒害等等。为保护提取的目标物选择最佳的保护环境、选用维护其生物活性的适当保护剂。应尽量减少污染物的干扰。,4.植物病毒的样品处理,在把植物组织细胞中带有病毒的汁液抽取出来时，就应先从含有许多种粒子的混合体中把病毒粒子与这些粒子或碎片区分开，并要能有效地抑制和除去抽提液中所含的多种酶。因为有一些酶能降解或损坏病毒。植物病毒的抽提液中，由于蛋白衣壳表面氨基酸的离子作用，所以不同pH值下其稳定程度不同。大多数病毒粒子在pH7左右最为稳定，可溶性也最强。若再加上适当的附加物质并配置适当的缓冲液，则更有利于病毒粒子从被吸附物上解脱下来而且还能抑制病毒粒子的钝化及凝集。抽取过程中细胞内释放出许多酶类，如氧化酶等，它们都,可能使病毒失活，所以常常在缓冲液中加-巯基乙醇、抗坏血酸、PVP、硫化钠、Triton-100、吐温等试剂，稳定病毒、防止凝集与沉淀，保护病毒活力。不同类型的病毒保护目的不同，作用不同。抽提液的澄清：主要是利用多种有机溶剂的乳化作用，将大部分植物蛋白质沉淀下来，因此常常在抽提液中加一定量的有机溶剂。常用的有氯仿、丁醇、四氯化碳等。经过搅拌乳化再低速离心，把有机相与水相分开病毒存在于水相，而大多数寄主物质或溶于有机相或停留在水相与有机界面的交界面处。除去有机相与杂质液层就可以得到经过澄清含病毒的水相。,