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1、第十七章 荧光光谱分析仪和原子光谱分析仪,教 学 要 求,掌握荧光分析的基本原理和荧光光谱仪的组成。掌握原子吸收分光光度计和原子发射光谱仪的基本原理和结构。熟悉不同类型仪器的特点和性能指标。了解荧光光谱分析法和原子光谱分析法在临床检验中的应用。,荧光光谱分析仪的原理与结构,荧光光谱分析仪的特点和应用,原子光谱分析仪的原理与结构,原子光谱分析仪的特点和应用,主 要 内 容,第一节 荧光光谱分析仪,荧光：某些物质吸收光能量后，可发射波长与激发光波长相同或不同的光，当激发光源停止照射试样时，再发射过程立即停止，这种再发射的光称为荧光（fluorescence）。荧光包括分子荧光和原子荧光。荧光分析法
2、：通过测定物质分子产生的荧光强度进行物质的定性与定量分析的方法。荧光光谱仪：采用荧光分析法来测量的仪器。,一、概 述,荧光产生机制 物质的分子吸收了照射光的能量后，处于基态最低能级的分子被激发到电子激发态的各个振动能级。被激发的分子与周围的分子碰撞，并把部分能量以热能的形式传给周围的分子，自己降落到单线第二电子激发态的最低振动能级。然后，由此最低振动能级向基态的各个振动能级跃迁，同时以发光的形式释放出其能量。这种光即为荧光。,一、概 述,1.振动弛豫,2.内转换,3.猝灭,4.系间跨越,s单重态,T多重态,1,2激发波长;,荧光,3磷光,分子去活化过程及荧光产生示意图,一、概 述,荧光分析的特
3、点优点：灵敏度高（可达1012g数量级）；选择性强，有利于分析复杂的多组分混合物；用样量少、特异性好、操作简便。缺点：对温度、pH值等因素变化比较敏感；应用范围较窄，只能用来测量发荧光的物质，或与某些试剂作用后发荧光的物质。,一、概 述,（一）激发光谱和荧光光谱 任何发射荧光的物质都具有两个特征光谱，即激发光谱（excitation spectrum）和荧光光谱(fluorescence spectrum)。激发光谱和荧光光谱是荧光分析中定性和定量的基础。,二、荧光分析的基本原理,激发光谱：连续改变激发光波长，固定荧光发射波长，测定不同波长的激发光照射下，物质溶液发射的荧光强度的变化。以激发光
4、波长为横坐标，荧光强度为纵坐标作图，即可得到荧光物质 的激发光谱。从激发光谱图上可找到 发生荧光强度最强的 激发波长ex。,二、荧光分析的基本原理,荧光光谱：用ex作激发光源，并固定强度，测定不同波长的荧光强度。以荧光波长为横坐标，荧光强度为纵坐标作图，便得荧光光谱。荧光强度最强的波长为em。荧光物质的ex和em 是鉴定物质的依据，也 是定量测定中所选用的 最灵敏的波长。,二、荧光分析的基本原理,（二）物质的分子结构和荧光的关系强荧光物质的分子结构特征：具有大的共轭-双键结构，共轭体系越大，越容易产生荧光；具有刚性平面结构；具有最低的单线电子激发态，S1为-型；若取代基团为给电子取代基，荧光强
5、度增加。,二、荧光分析的基本原理,三、荧光光谱仪的原理与分类,荧光光谱仪的工作原理 在激发光的频率、强度以及液层厚度不变的情况下，荧光物质所发射的荧光强度与溶液的浓度成正比。因此，可以通过测定荧光强度来求出该物质的含量。荧光分析法所测量的是待测物质所发射的荧光强弱，属于发射光谱分析，荧光光度计和荧光分光光度计属于发射光谱仪器。,荧光光谱仪分类荧光光度计（fluorophotometer）：采用滤光片做单色器，结构较简单，功能也较差。荧光分光光度计（fluorospectrophotometer）：采用棱镜或光栅为色散元件，结构较复杂，功能较强，但价格远远高于荧光光度计。,三、荧光光谱仪的原理与
6、分类,三、荧光光谱分析仪的原理与分类,Fluoscence荧光分光光度计,FP-6500荧光分光光度计,三、荧光光谱仪的原理与分类,三、荧光光谱分析仪的原理与分类,Jasco荧光光谱仪,三、荧光光谱仪的原理与分类,ARL 9800 系列 X射线荧光光谱仪,荧光光谱仪的主要结构激光光源：常用汞弧灯、氢弧灯及氘灯等。单色器：一是激发单色器，用于选择激发光波长；二是发射单色器，用于选择发射到检测器上的荧光波长。样品池：放置测试样品，用石英做成。检测器：接受光信号并将其转变为电信号。记录显示系统：检测器出来的电信号经过放大器放大后，由记录仪记录下来，并可数字显示。,四、荧光光谱仪的结构,四、荧光光谱仪
7、的结构,荧光分光光度计光路图,四、荧光光谱仪的结构,荧光光谱仪的性能指标主要包括：灵敏度波长范围波长精度分辨率光谱带通信噪比,五、荧光光谱仪的性能指标,灵敏度灵敏度是指能被仪器检出的最低信号，或某一标准荧光物质稀溶液在选定波长的激发光照射下能检出的最低浓度，是仪器最重要的性能指标之一。多数荧光光谱仪的灵敏度较高，可达10-10g10-12g水平，有利于检测体液中的微量物质。,五、荧光光谱仪的性能指标,波长范围波长范围指荧光光谱仪的有效工作波段，包括激发通道波长范围、投射通道波长范围和荧光通道波长范围。波长范围越大，应用范围越广。一般荧光分光光度计都采用氙灯作光源，光栅为单色器分光元件，其有效工
8、作波段在200nm1000nm范围之内。,五、荧光光谱仪的性能指标,波长精度指其波长计数器的指示值与真实光波长的数值相符的程度。特定的激发波长和发射波长是定性分析和定量测定的基础，因此波长精度也是荧光光谱仪的核心指标之一。目前荧光分光光度计的波长精度误差在（0.2nm2nm）范围之内。,五、荧光光谱仪的性能指标,分辨率指荧光仪器对靠近的峰尖分开的能力，它与波长精度有密切关系，决定着对混合物成分分析特异性的好坏。常用仪器的分辨率在0.2nm5nm之间，主要由光栅的每毫米刻线数决定。,五、荧光光谱仪的性能指标,光谱带通指仪器主机狭缝宽窄程度的指数。以一定狭缝几何密度对应的光谱半宽度来直接表示光谱纯
9、度。光谱纯度直接影响仪器的分辨率、灵敏度以及背景干扰。目前的荧光分光光度计的光谱带通在0.15nm20nm之间，一般都采用连续可调方式。,五、荧光光谱仪的性能指标,信噪比与响应速度用空白样品测得的峰值叫做噪声峰值，待测样品测得的峰值和噪声峰值之比就叫做信噪比。信噪比越高，检测结果的准确性也越高。仪器的响应速度是指电路样品通道对光电信号反映的快慢。响应速度关系到波长扫描速度的选择、光谱峰的尖锐程度以及随机噪声的大小。,五、荧光光谱仪的性能指标,荧光光谱仪的使用与维护严格按照仪器规定的操作步骤进行操作。电源：电压、电流、电源的稳定须符合仪器规定。光源：需预热20min，灯及其窗口要保持清洁。单色器
10、：应注意防潮、防尘、防污和防机械损伤。光电倍增管：加高压时切不可受外来光线直接照射。样品池：使用时应同一个方向插放，不能经常磨擦。,六、荧光光谱仪的使用与维护,仪器出现故障，必须请专门人员进行检修。安全防护：操作者不能直视光源，以免紫外线损伤眼睛。,六、荧光光谱仪的使用与维护,荧光光谱仪的故障排除,七、荧光光谱仪的临床应用,荧光光谱仪主要应用于以下方面：常规分析：用于荧光物质的定性和定量分析、化学表征、色谱流出物的检测等；获得分子信息：如测量分子内间距、决定键合平衡、研究结构变化等；,医药研究：研究膜结构和功能、确定抗体的形态、研究生物分子的异质性、评价药物的相互作用、确定酶的活性和反应、荧光
11、免疫分析、监测体内化学过程等；环境监测：水和空气中污染物的鉴别和计量等。,七、荧光光谱仪的临床应用,第二节 原子光谱分析仪,一、概 述,原子光谱分析仪的特点优点：分析速度快、操作简便、选择性好、灵敏度高、测定范围广、试剂用量少等，可同时测定多种元素，不必进行复杂的分离处理。缺点：对温度、pH值等因素变化比较敏感；应用范围较窄，只能用来测量发荧光的物质，或与某些试剂作用后发荧光的物质。,一、概 述,原子光谱分析仪的分类,二、原子吸收光谱仪,原子吸收光谱法(Atomic Absorption Spectroscopy，AAS)基本原理：从空心阴极灯或光源中发射出一束特定波长的入射光，在原子化器中待
12、测元素的基态原子蒸汽对其产生吸收，通过测定吸收特定波长的光量大小，可求出待测元素的含量。,原子吸收光谱法优点：,灵敏度高、精确高；选择性好、干扰少速度快，易于实现自动化可测元素多、范围广结构简单、成本低,二、原子吸收光谱仪,原子吸收光谱仪（atomic absorption spectrometer）：采用原子吸收光谱法进行测量的仪器，又称原子吸收分光光度仪，是20世纪50年代中期出现并逐渐发展起来的一种新型仪器。结构原理与普通分光光度计相似，只是用锐线光源代替了连续光源，用原子化器代替通常的吸收池。,二、原子吸收光谱仪,原子吸收光谱仪工作原理光源发出与待测元素特征波长相应的射线，把试样的溶液
13、以细粒子流的形式喷射到火焰上，部分射线被吸收。吸收的强度与试样的浓度成正比，通过测量吸收量，即可确定待测物质浓度。不同元素外层电子结构不同，其原子的吸收光谱也不同，因此测量原子吸收光谱也可以对物质进行定性分析。,二、原子吸收光谱仪,原子吸收光谱仪的种类单光束型：仪器结构简单，价格便宜，维护方便，应用比较普遍，但不能克服光源灯不稳定带来的零漂。双光束型：仪器构造比较复杂，能够克服零漂，而且速度也较快，但价格也较昂贵。,二、原子吸收光谱仪,二、原子吸收光谱仪,（1）光源系统：发射被测元素的特征共振辐射。基本要求：光谱纯度高，只发射待测元素光谱；发射较窄的谱线；稳定性好，30分钟内漂移不超过1；结构
14、牢固可靠，使用方便；常用类型：空心阴极灯 蒸气放电灯 无极放电灯,二、原子吸收光谱仪,空心阴极灯,（2）原子化器：提供能量将液态试样中的待测元素干燥蒸发使之转变成原子态的蒸气。常用类型：火焰原子化器 无火焰原子化器,二、原子吸收光谱仪,火焰原子化器,常用的是预混合型原子化器，具有简单、快速、对大多数元素有较高的灵敏度和检测极限的优点，使用最广泛。,二、原子吸收光谱仪,无火焰原子化器,常用的是石墨炉原子化器。其电极插入样品时触点时好时坏、重复性差、设备复杂、不易掌握，但与火焰原子化器相比具有较高的原子化效率、灵敏度和检测极限。,二、原子吸收光谱仪,（3）分光系统：组成：入射和出射狭缝、反射镜和色
15、散元件关键部件：色散元件，可以是棱镜或衍射光栅。要保证既要将谱线分开，又要有一定的出射光强度。,二、原子吸收光谱仪,（4）检测系统：组成：检测器（光电倍增管）、同步检波放大器、对数变换器、指示仪表等。作用：将光信号转变成电信号，然后再经同步检波放大器放大，把非被测信号滤掉。放大了的信号进入对数变换器进行对数变换，变成线性信号，在指示仪表上显示出来。,二、原子吸收光谱仪,光电倍增管,AA5800原子吸收分光光度计,二、原子吸收光谱仪,二、原子吸收光谱仪,ZEEnit650高级石墨炉原子吸收光谱仪,二、原子吸收光谱仪,原子吸收分光光度计结构示意图,原子吸收光谱仪分光系统示意图,二、原子吸收光谱仪,
16、原子吸收光谱仪的性能评价指标特征浓度：指产生1吸收或0.0044吸光度时所对应的被测元素的浓度或质量。特征浓度S值越小，表示原子吸收光谱仪对某个元素在一定条件下的分析灵敏度越高。特征浓度不能用来表征某仪器对某元素能被检出所需要的最小浓度，但可以用于估算较适宜的浓度测量范围及取样量。,二、原子吸收光谱仪,检出限：表示在选定的实验条件下，被测元素溶液能给出的测量信号3倍于标准偏差时所对应的浓度（单位：mg/L）。无火焰光谱仪器中常用绝对检出限表示，单位为g。检出限既反映仪器的质量和稳定性，也反映仪器对某元素在一定条件下的检出能力。检出限比特征浓度有更明确的意义。检出限越低，说明仪器性能越好，对元素
17、的检出能力越强。,二、原子吸收光谱仪,原子吸收光谱仪常见故障及处理方法原子吸收光谱仪在工作过程中常见的故障有：没有吸收、灵敏度低、重现性差、表头回零差、仪器噪音大、曲线弯曲、分析结果误差大和废液不畅通等，要根据具体情况作出不同处理。,二、原子吸收光谱仪,三、原子发射光谱仪,原子发射光谱法：是根据处于激发态的待测元素原子回到基态时发射的特征谱线对待测元素进行分析的方法。由于待测元素原子的能级结构不同，因此发射谱线的特征不同，据此可对样品进行定性分析；根据待测元素原子的浓度不同，因此发射强度不同，可实现元素的定量检测。,原子发射光谱分析特点优点：可同时测定一个样品中的多种元素；分析速度快，试样消耗
18、少；检出限低，可达ng/mL级；准确度较高，相对误差可达1以下。,三、原子发射光谱仪,缺点：高含量分析的准确度较差；常见的非金属元素如氧、硫、氮、卤素等谱线在远紫外区一般的光谱仪尚无法检测；还有些非金属元素，如P、Se、Te等，由于其激发电位高，灵敏度较低。,三、原子发射光谱仪,常用激发方式：火花式与ICP两种火花式：激发源是高压电火花源，它提供单变或振荡电流脉冲。该方法能进行固体样品的多元素分析；电感耦合等离子体（ICP）式：等离子体是由无线电波或在微波范围内的电磁波在惰性气体（氩气）中进行无极或单极感应放电所产生。该方法可进行溶液元素分析。,三、原子发射光谱仪,原子发射光谱仪：利用试样中原
19、子或离子所发射的特征谱线的波长或强度来检测元素的存在和含量的仪器。常用类型：1.火焰光度计和火焰分光光度计 2.摄谱仪和光电直读光谱仪 3.激光显微发射光谱仪,三、原子发射光谱仪,三、原子发射光谱仪,6400A 火焰光度计,摄谱仪：是用光栅或棱镜做色散元件，采用照相方式用感光板记录试样光谱的原子发射光谱仪器。可以把试样的谱线拍摄长期保存备查。摄谱仪聚光性强，有利于提高灵敏度。类型：棱镜摄谱仪、光栅摄谱仪构成：光源、分光系统、检测系统,三、原子发射光谱仪,三、原子发射光谱仪,棱镜摄谱仪,光栅摄谱仪,摄谱仪的激发光源基本功能：提供使试样中被测元素原子化和原子激发发光所需要的能量。要求：灵敏度高，稳
20、定性好，光谱背景小，结构简单，操作安全。常用激发光源：电弧光源、电火花光源、电感耦合高频等离子体光源（ICP光源）等。,三、原子发射光谱仪,几种光源的比较,三、原子发射光谱仪,摄谱仪的光学系统作用：把样品被蒸发和激发产生的辐射光进行分光。组成：照明系统、准光系统、色散系统和投影系统。,三、原子发射光谱仪,照明系统：由透镜组组成，作用是把光源的光聚焦于狭缝上，使尽可能多的光进入狭缝；让光源不同部位发出的光均匀地照射到狭缝各个部位；并使光源电极头所发射出的连续光谱不进入狭缝。准光系统：由狭缝和准直镜构成，作用是将光源发出的光转变为平行光束，使其到达分光元件的第一入射面的各点时，入射角度都相同。,三
21、、原子发射光谱仪,色散系统：指光谱仪的分光元件或色散元件。可以是光栅、单个棱镜或多个棱镜。其作用是通过分光元件所产生的色散，将复合光分成单色光。投影系统：从物镜到其焦面这一部分称为光谱仪的投影系统或“暗箱”。作用是将色散后的单色光束，经物镜聚焦在其焦面上，形成按波长顺序排列的狭缝的像，即光谱。,三、原子发射光谱仪,摄谱仪的检测系统摄谱仪用感光板来检测发射光谱。感光板由照相乳剂均匀地涂布在玻璃板上而成。用测微光度计测量感光板上的照相乳剂感光后变黑的黑度以确定谱线的强度。与相同条件下的标准样品谱线比较，从而测定试样成分含量。,三、原子发射光谱仪,光电直读光谱仪用光电倍增管接收和记录谱线的方法称为光
22、电直读法。光电直读光谱仪与摄谱仪的区别在于用光电倍增管和有关电子电路代替感光板。,三、原子发射光谱仪,光电直读光谱仪分类多道直读光谱仪：采用光电倍增管作为检测器，分析速度快，信号放大能力强，可同时分析含量差别较大的不同元素。单道扫描光谱仪：用光电倍增管为检测器，波长选择更为灵活方便，适用于较宽的波长范围。全谱直读光谱仪：采用固体检测器，具有较好的波长稳定性。,三、原子发射光谱仪,三、原子发射光谱仪,SPECTROMAXx全谱直读光谱仪,三、原子发射光谱仪,ICP光谱仪,光电直读光谱仪特点速度快，可在1min2min显示分析结果；精密度较好，理想条件下测试的重复性可达实际含量的1数量级；一般只能
23、测量一种基体材料内824种元素，可通过将接收器组合成几个“桥”的方式来扩展测量能力，每个“桥”用于一种类型的基体材料；不能象摄谱仪那样长久保存图谱。,三、原子发射光谱仪,四、原子荧光光谱仪,原子荧光光谱分析法（XRF）：利用原子荧光谱线的波长和强度进行物质的定性与定量分析的方法。在一定实验条件下，被测元素的浓度与荧光强度成正比，据此可对物质进行定量分析。特点：设备简单、灵敏度高、光谱干扰少，工作曲线线性范围宽，可以进行多元素测定，应用广泛。,原子荧光光谱仪分类色散型原子荧光光谱仪非色散型原子荧光光谱仪 两类仪器的结构基本相似，差别在于非色散型仪器不用单色器。,四、原子荧光光谱仪,色散型原子荧光
24、光谱仪结构特点辐射光源：激发产生原子荧光；单色器：选择荧光谱线，排除其他光的干扰；原子化器：将被测元素转化为原子蒸气；检测器：检测光信号并转换为电信号，常用光电倍增管；显示和记录装置：显示和记录测量结果，包括了电表、数字表、记录仪等。,四、原子荧光光谱仪,AF-610D环保型原子荧光光谱仪,四、原子荧光光谱仪,AF-630环保型原子荧光光谱仪,四、原子荧光光谱仪,荧光光谱仪的性能指标：检测灵敏度特征浓度分辨率基线稳定度波长精度测量精度,五、原子光谱分析仪的性能指标,检测灵敏度检测灵敏度是指在一定浓度时，测量值的变量（dA）与相应的待测元素浓度的变量（dC）之比，即s=dA/dC。就是校准工作曲
25、线的斜率，表明吸光度对浓度的变化率，可以理解为单位被测元素浓度变化量引起的吸光度变化量。变化率越大，灵敏度越高。,五、荧光光谱分析仪的性能指标,特征浓度指产生1吸收或0.0044吸光度时所对应的被测元素的浓度或质量。特征浓度S值越小，表示分析灵敏度越高。特征浓度还不能用来表征某仪器对某元素能被检出所需要的最小浓度，但它可以用于估算较适宜的浓度测量范围及取样量。,五、荧光光谱分析仪的性能指标,检出限指在选定的实验条件下，被测元素溶液能给出的测量信号3倍于标准偏差时所对应的浓度（mg/L）或质量(mg或g)，反映仪器对某元素在一定条件下的检出能力。既反映仪器的质量和稳定性，也反映仪器对某元素在一定
26、条件下的检出能力范围越大，应用范围越广。检出限越低，说明仪器性能越好，对元素的检出能力越强。,五、荧光光谱分析仪的性能指标,原子光谱分析仪的使用严格按照仪器规定的操作步骤进行操作：,六、原子光谱分析仪的使用与维护,开机故障或没有吸收；灵敏度低；精密度差；表针回零不好；基线不稳，噪音过大。出现故障，必须请专门人员进行检修。,六、荧光光谱仪的使用与维护,原子光谱分析仪的常见故障,原子光谱分析仪在临床检验中的应用血浆（或血清）中钠、钾离子火焰光度法测定血清锌的原子吸收法测定石墨炉原子吸收光谱法测定血铅石墨炉原子吸收光谱法测定血中镉含量 砷元素测定,七、原子光谱分析仪的临床应用与进展,原子光谱分析仪的新进展全谱直读功能智能化、小型化、实用化、低分析成本,七、原子光谱分析仪的临床应用与进展,全谱直读等离子体发射光谱仪,七、原子光谱分析仪的临床应用与进展,便携式光谱仪,七、原子光谱分析仪的临床应用与进展,再见！,
