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1、1,第七章 外源性化学物致突变作用（Mutagenesis of Xenobiotics),2,一般毒性作用特殊毒性作用（致畸、致突变、致癌）“三致”作用,3,致突变作用-造就了“蜘蛛侠”？,4,5,6,7,8,9,10,11,现实生活中,自然界中的自发突变转基因的动、植物（红薯，蓝色玫瑰）各种有害因素引起的突变（物理，生物，化学）外源性化学物致突变作用,12,13,基本概念：突变、遗传毒理学、致突变作 用、致突变物致突变的类型：基因突变、染色体结构异 常、染色体数目异常,【内容】,14,致突变作用机制突变的后果：生殖细胞突变，体细胞突变机体对致突变作用的影响致突变试验,15,第一节 概 述,
2、16,遗传与变异遗传：生物物种以各种繁殖方式来保证世代间生命的持续。种瓜得瓜 种豆得豆变异：亲子之间或子代之间出现不同程度的差异。,一、基本概念,17,突变（mutation)：遗传结构本身的变化及其引起的变异-生物体的遗传物质发生了突然的、根本的变化，因为这种变化起源于基因和染色体，因此，是可遗传的变异.突变”这个词的来源：“突变”是由荷兰DeVries（19011903）提出。他当时在栽培月见草，发现其中有多种可变遗传的变异，因这些变异是不连续的好象突然发生，故叫“突变”孟德尔的豌豆杂交实验为现代遗传学 奠定了基础(基因分离、自由重组),18,1909年摩尔根(Morgan)发现在红眼果蝇
3、中有白眼果蝇因发现了果蝇白眼突变的性连锁遗传，提出了基因在染色体上直线排列以及连锁互换定律，摩根于1933年被授予诺贝尔奖。1946年，摩根的学生，被誉为“果蝇的突变大师”的米勒，证明射线能使果蝇的突变率提高150倍，因而成为诺贝尔奖获得者.,19,基因与染色体,生物界都知道是遗传因子（即基因）决定了生物的遗传。但是，基因究竟在细胞内的什么地方？摩尔根以果蝇为试验对象回答了这一问题，基因在染色体上。,20,21,自发突变(spontaneous mutation):是由于普遍存在的未知因素作用下，在自然条件下发生的突变特点：发生过程长、频率很低，与物种进化有关,从发生原因上，可分为：,22,诱
4、发突变(induced mutation)：是指人为地造成突变特点：发生过程短、频率高，既可被人类利用，也可能对人类产生危害,23,环境中的致突变因素1.化学物质天然存在的致突变物：如黄曲酶毒素、亚硝酸盐等人工合成的致突变物 抗癌药物：如环磷酰胺等 烷化剂：如环氧乙烷、氮芥、硫芥等 有毒金属：如六价铬、有机汞等 农药：如乐果、敌百虫等 食品添加剂：如奶油黄、胭脂红、食用蓝1号和2号等 其他：如多氯联苯、氯乙烯、苯等,24,物理因素：电离辐射、温度剧烈变化等,25,1986年4月26日，原苏联在乌克兰境内修建的切尔诺贝利核电站发生爆炸并引起大火。该事故导致约吨的强辐射物严重泄露，造成了史无前例的
5、放射性污染，其危害至今也未能完全消除。切尔诺贝利事故增加儿童体内DNA变异。,在医院接受治疗的受辐射的孩子,26,3.生物因素：病毒、基因工程等,转基因鲑鱼(上)比同年龄的野生鲑鱼(下)重 11 倍,27,第二节 化学毒物致突变的类型,从遗传学角度或突变角度分为：基因突变染色体结构改变染色体数目改变,28,从机理角度分为：对DNA为靶的损伤（包括基因突变和染色体畸变）不以DNA为靶的损伤(染色体数目异常）,29,基因突变（genetic mutation)：是指基因在结构上发生了碱基对组成和排列序列的改变（point mutation)。不能应用光学显微镜直接进行观察，须采用理化或生物学方法才
6、能检出。光学显微镜可分辨的物质最小为0.2m 相当于4.7106个核苷酸对的长度,一、基因突变,30,基因突变：可分为碱基置换和移码突变两种类型。突变基因：基因内存在的突变的基因野生型基因：没有发生突变的基因,31,(一)碱基置换（base subsititution),转换(transition)：即嘌呤到嘌呤或嘧啶到 嘧啶的变化颠换(transversion):即嘌呤到嘧啶或嘧啶 到嘌呤的变化,碱基置换是某一碱基配对性能改变或脱落而引起的突变。,32,A G T C,腺嘌呤 鸟嘌呤 胸腺嘧啶 胞嘧啶,33,34,后果同义突变(synonymous mutation)：指没有改变基因产物氨基
7、酸序列的突变。,GGG 和GGA 均编码(glycine,Gly,甘氨酸),35,错义突变(missense mutation)：指碱基序列的改变引起了产物氨基酸序列的改变,单核苷酸替代,36,无义突变(nonsense mutation)：指某个碱基的改变使代表某个氨基酸的密码子变为蛋白质合成的终止密码子，导致多肽链在成熟之前终止合成的改变。,终止密码子：UAA UAG UGA,37,终止密码的突变链终止突变：指无义突变使肽链过早终止。延长突变：指如果终止密码子因突变而为氨基酸编码，结果产生过长的肽链的现象。,38,指发生一对或几对不等于3的倍数的碱基减少或增加，以致从受损点开始碱基序列完全
8、改变，形成错误的密码，并转译为不正常的氨基酸。由于碱基序列所形成的一系列三联体密码子相互间并无标点符号，于是从受损位点开始密码子的阅读框架完全改变。,（二）移码突变（frameshift mutation),39,40,结果是从原始损伤的密码子开始一直到信息末端的氨基酸序列完全改变。使读码框架改变其中某一点形成无义密码，于是产生一个无功能的肽链片段。移码突变较易成为致死性突变。,41,单碱基置换,单碱基缺失,42,基因突变的案例白化病,突变-黑色素生成缺陷-眼、毛发色素缺乏发病率，2/1000常染色体隐性遗传,43,全色盲，双色盲，色弱（红绿蓝三原色）发病率，男性7%，女性0.49%X染色体隐
9、性遗传（交叉遗传）尚无有效的治疗方法（色盲矫正隐形眼镜，改善色觉,提高色调分辨能力）,基因突变的案例色盲症,44,45,基因突变的案例多毛症,23岁的墨西哥男子丹尼出生后就患有一种罕见的多毛症，全身都被浓厚的黑色毛发覆盖，看起来就像传说中的恐怖“狼人”。据悉，丹尼一家五代人都患有这种“狼人综合征”，他和26岁的哥哥拉里从小便被当成“怪物”，被关进笼子中四处展出。祖母携带这种变异基因，将它传给了后代。哥哥拉里、堂姐妹莉莉和卡拉、亲妹妹贾米、6岁侄女丹尼拉等,46,狼人综合征和月亮以及狼没有任何联系，而是与基因有关。多毛症基因曾是人类身上的一种“失传基因”。当远古时代的人类还是长满毛发的灵长类动物
10、时，身上就存在着这种基因，但当人类渐渐进化后，这种基因变得不再需要，就开始发生突变而“关闭”。然而丹尼的家族不知何故，他们体内被“关闭”的多毛症基因现在又被“打开来了”。“狼人综合征”非常罕见，患病概率只有100亿分之一，且没有根治办法。,47,二、染色体畸变(chromosome aberration),48,染色体结构异常（畸变）（structural chromosome aberration)：是指由于染色体或染色单体断裂，造成染色体或染色单体缺失或引起各种重排，从而出现染色体结构异常。断裂剂：凡能引起染色体断裂的物质。,49,染色体畸变又可分为染色体畸变（chromosome-typ
11、e aberrations)：指染色体中两条染色单体同一位点受损后所产生的结构异常染色单体畸变（chromatid-type aberrations)：指畸变涉及复制染色体中两条染色单体中的一条,50,染色体结构异常的类型,类型：缺失重复倒位易位,51,(1)缺失（deletion)：染色体上丢失了一个片段。一个染色体发生一次或多次断裂而不重接，就会出现一个或多个无着丝粒断片和一个缺失了部分染色质并带有着丝粒的异常染色体。,52,(2)重复：在一套染色体里，一个染色体片段出现不止一次。,53,(3)倒位(inversion)：一个染色体片段被颠倒了。倒转180再重接臂间倒位：如果颠倒的片段包括
12、着丝点，称为臂间倒位；臂内倒位：如不包括着丝点，称为臂内倒位。,染色体的臂间倒位,54,(4)易位(translocation)：从某个染色体断下的节段接到另一染色体上称为易位。,相互易位,55,染色体结构异常是染色体或染色单体断裂所致。当断端不发生重接或虽重接而不在原处，即可出现染色体结构异常。,56,三、染色体数目异常,Normal human Karyotype:46,XY,57,动物正常体细胞染色体数目2n为标准，为二倍体。染色体数目异常可表现为整倍性畸变和非整倍性畸变。整倍性畸变可能出现单倍体、三倍体或四倍体。超过二倍体的整倍性畸变也统称为多倍体。非整倍性畸变系指比二倍体多或少一条或
13、多条染色体(2n+1,2n-1)。,58,整倍性畸变,59,非整倍性畸变,60,缺体是指缺少一对同源染色体；单体或三体系指某一对同源染色体相应地少或多一个四体则指其比同源染色体多一对。人类中常见有三种三体：（1）21-三体，即Down氏综合征；（2）18-三体，即Edward综合征（3）13-三体，即Patau综合征。,61,患儿具明显的特殊面容体征：眼距宽，鼻根低平，眼裂小，眼外侧上斜，有内眦赘皮，外耳小，舌胖，常伸出口外，流涎多。,3.男性唐氏婴儿长大至青春期，也不会有生育能力。4.易患各种感染，如存活至成人期，则常在30岁以后即出现老年性痴呆症状。,62,突变的类型,63,第三节 化学毒
14、物致突变作用的机制及后果,64,（一）碱基损伤1.碱基错配烷化剂(alkylating agent):是指对DNA和蛋白质具有强烈烷化作用的物质一般情况下甲基化乙基化高碳烷基化烷化剂所致甲基化易产生碱基错配,一、引起突变的DNA变化,65,目前认为最常受到烷化的是鸟嘌呤的N7位，其次是O6位腺嘌呤的N1、N3和N7也易烷化,腺嘌呤 鸟嘌呤 胸腺嘧啶 胞嘧啶,66,67,AP位点（apurinic or apyrimidinic site)：是指丢失碱基的DNA留下了一个无嘌呤或无嘧啶的位点,68,嵌入剂（intercalating agent)：指能以静电吸附形式嵌入DNA单链的碱基之间或DN
15、A双螺旋结构的相邻多核苷酸链之间的物质常见的嵌入物：多环芳烃的环氧化物，吖啶（dng）类化合物，联苯胺等。其共同的结构特征为：平面多环状结构，一般是三个环，长度极为相似约 6.8。,2.平面大分子嵌入DNA链,69,编码链,70,有些化学物的结构与碱基非常相似，称碱基类似物它们能在S期中可与天然碱基竞争，并取代其位置例如5-溴脱氧尿嘧啶核苷能取代胸腺嘧啶；2-氨基嘌呤(2-AP）能取代鸟嘌呤,3.碱基类似物取代,AT A5BU,71,化学物可对碱基产生氧化作用，从而破坏或改变碱基的结构，进而引起链断裂；有些化学物质可在体内形成有机过氧化物或自由基，如甲醛、氨基甲酸乙酯和乙氧咖啡碱等，可间接使嘌
16、呤的化学结构破坏，容易出现DNA链断裂。,4.碱基的化学结构的改变或破坏,72,（二）DNA链受损,1.二聚体的形成：紫外线 环丁烷嘧啶和 4-6光产物 阻止DNA复制 引起细胞死亡,73,二、引起突变的细胞分裂过程改变,a是中心粒，b是纺锤丝，c是染色体，d是着丝点。纺锤丝把着丝点（内部已经一分为二）拉开，复制过的染色体就一分为二了。,74,一些化学物能作用于纺锤体，中心粒或其他核内细胞器，从而干扰有丝分裂过程诱发这种作用的物质称为有丝分裂毒物，又称干扰剂,75,秋水仙碱是典型的引起细胞分裂完全抑制的物质，因此这种效应又称秋水仙碱效应或细胞有丝分裂。有些干扰剂仅使细胞群体的有丝分裂数减少，被
17、称之为抗有丝分裂剂。,76,引起非整倍性的原因,不分离（nondisjunction)一种是同源染色体在第一次减数分裂中联会复合中不分离（可能联会复合体受损）另一种是姊妹染色单体在有丝中或第二次减数分裂中因着丝粒受损未纵裂而不分离,77,不分裂的结果是纺锤体的一极接受了同源或两个染色单体，而另一极则没有。,78,只有一条染色体或一对染色体不分离，在子细胞中将多出一条或一对染色体，而在另一个子细胞中将少一条或一对梁色体。,79,染色体丢失（chromosome loss)纺缍体形成的不完全障碍或着丝粒受损使细胞分裂过程中个别染色体行动滞后没有进入子细胞核,联会复合体形成障碍和第一次减数分裂时着丝
18、粒早熟分离而产生非整倍性,80,引起整倍体的原因,核内复制（endoreduplication),第一次有丝分裂染色体及其着丝粒虽已完成正常复制，但纺缍体形成受到完全的障碍，全部姊妹染色单体不能分开，细胞也不能进行分裂，形成间期四倍体细胞核,第二次有丝分裂：恢复正常的复制和分开，中期便可见每四条染色单体整齐排列的现象,81,1、在细胞增殖过程，细胞周期正常染色体复制，但在接下来的有丝分裂期，染色体分裂时，染色单体不能分离，产生一个4倍体细胞。,82,2、由于接受分裂错误，配子为2倍体，而不是单倍体，所以会产生一个多倍体的受精卵。,83,非整倍体和多倍体是由于染色体分离异常而产生的,84,(二）
19、不以DNA为靶的损伤机制,1.对DNA合成和修复有关的酶系统的作用,一些氨基酸类似物可使与DNA合成有关的酶系统遭受破坏从而诱发突变，脱氧核糖核苷三磷酸在DNA合成时的不平衡也可诱发突变铍和锰除可直接与DNA相互作用外，还可与酶促防错修复系统相作用而产生突变,85,2.对纺缍体的毒作用,与微管蛋白二聚体结合与微管上的巯基结合破坏已组装的微管妨碍中心粒移动其他作用,86,四、突变的后果,突变的后果取决于化学毒物所作用的靶细胞体细胞：其影响仅能在直接接触该物质的个体身体上表现出来，不可能遗传到下一代（肿瘤）生殖细胞：其影响有可能遗传到下一代（遗传性疾病）,87,DNA损伤修复的效率,体细胞突变,生
20、殖细胞突变,良性肿瘤,恶性转化,细胞衰老,未分化的胚胎细胞,分化的胚胎细胞受损,显性致死,隐性致死,存活突变,动脉硬化,未知疾病,癌变,老化,出生缺陷（流产/死胎）癌变,出生缺陷（功能或结构畸形）,流产死产,出生缺陷基因负荷,先天性疾病,化学物和遗传危害示意图,88,（1）致死性突变：显性致死：精子不能受精，或突变配子与正常配子结合后，在着床前或着床后的早期胚胎死亡。基因的致死作用在杂合子中即可表现的称为显性致死。隐性致死：需要纯合子或半合子才能出现死亡效应，杂合子则不出现死亡。,1.生殖细胞突变的后果,89,（2）非致死性突变（可遗传的改变）先天畸形等遗传性疾病遗传易感性改变,致死性突变将导
21、致死胎，它影响后代的数量而非质量。非致死性突变主要影响后代的质量。,90,生物个体生殖细胞发生突变或染色体畸变后，有些可能会在世代传递、选择过程中在人群中固定下来，增加人类的遗传负荷遗传负荷（genetic load)：指人群中每个个体所携带有害基因或致死基因的平均水平,91,（1）癌变：体细胞突变是细胞癌变的重要基础，在许多肿瘤中，都可观察到癌基因的活化和抑癌基因的失活，并存在缺失、易位、倒位等染色体畸变,2.体细胞突变的后果,92,93,（2）致畸胎：致突变物可透过胎盘作用于胚胎体细胞引起畸胎，所以致畸作用不完全是亲代生殖细胞突变的后果（3）其他不良后果：动脉粥样硬化、衰老,94,第四节
22、机体对致突变作用的影响,95,DNA执行高保真的复制,修复DNA损伤,损伤耐受机制:是指DNA遗传可绕过那些阻止DNA复制的DNA损伤机制修复机制：直接修复和切除修复,遗传信息代代相传，并且高度保真,96,一、DNA损伤的修复(直接修复),1.光复活（photoreactivation)：修复紫外线损伤产生的胸腺嘧啶二聚体，广泛存在原核和真核生物体内(光裂合酶)2.“适应性”反应：主要是O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（MGMT)修复鸟嘌呤O6位的烷基化损伤。,97,（1）识别：糖基化酶识别异常的碱基，随后使异常嘌呤的N-9位或异常嘧啶的N-3位与脱氧核糖之间的键发生水解，形成无嘌呤或嘧啶的
23、位点（apurinic-apyrimidinic site,AP位点）。,3.切除修复,98,（2）插入酶将正确碱基插入AP位点（3）DNA聚合酶合成DNA片段，填补空缺（4）DNA连接酶将新合成的补片接上,99,100,切除修复分为：碱基切除修复（BER)：核苷酸切除修复（NER)：总基因组修复（GGR)；转录偶联修复（TCR)错配修复（mismatch repair，MMR)：识别并切除错配的碱基对，如G:T和A:C,101,102,103,易错修复（error-prone repair)：是指突变作为修复的结果或作为损伤旁路发生的DNA修复光复活、适应性修复和切除修复倾向于无误修复双链断
24、裂修复就是易错修复,104,1.DNA损伤不仅可因外源性因素所致，也可因内源性因素所致2.不同类型DNA损伤通过不同的DNA修复途径修复,DNA损伤修复的一般特点,105,3.不同类型DNA损伤修复速度是不同的4.DNA损伤修复机制有些是基本的，有些是可诱导的5.DNA损伤修复功能存在物种和个体差异,106,突变模式：DNA损伤-修复-突变,任何DNA损伤，只要修复无误，突变就不会发生，如果修复错误或未经修复，损伤就固定下来，于是发生突变,107,遗传毒物,终致突变物+DNA,解毒,加合物DNA损伤,修复,无错,易错修复,复制后修复,细胞死亡、静止状态的细胞,DNA复制,加合的碱基错配,损伤正
25、在复制的DNA,突 变,细胞存活,细胞存活,108,第五节 观察化学毒物致突变作用 的基本方法,109,致突变试验的应用,中国预防医学博士张学明:煎炸鱼中合有强致癌物杂环胺。杂环胺的形成量主要受煎炸、烤的温度影响，其次是煎烤时间。煎炸温度小于，杂环胺的形成量就很少；如果煎炸温度超过，煎炸时间少于分钟，杂环胺的形成量也很少；在煎炸的鱼外面挂上一层淀粉糊再炸，也能预防杂环胺形成。美国加州科研人员发现，高温烹调或油炸的肉食中合有突变源，对经过高温烹调的牛肉、鸡、鱼等进行检验，结果测出种致癌化合物，这次研究证实，突变源不是由于炭火等热源将肉烧糊所致，而是肉食本身成分在加温以上时的产物。,110,（1）
26、检测外源化学物的致突变性，预测其对哺乳动物和人的致癌性（2）检测外源化学物对哺乳动物生殖细胞的遗传毒性，预测其对人类的遗传危险性,致突变试验的目的,111,一、观察项目的选择,1.观察效应终点的类型：（1）DNA完整性改变（2）DNA重排或交换（3）DNA碱基序列改变（基因突变）（4）染色体完整性改变（染色体畸变）（5）染色体分离改变（非整倍体和多倍体）,112,1、细菌回复突变试验,美国加州大学的Ames教授在1979年建立并完善，又称Ames试验（鼠伤寒沙门菌/组氨酸回复突变试验）。,113,（1）什么是细菌回复突变试验？以营养缺陷型的突变体菌株为指示生物检测基因突变的体外试验。常用的菌株
27、有组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌和色氨酸营养缺陷型的大肠杆菌。,114,（2）鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验原理,鼠伤寒沙门氏菌原养型(his+),组氨酸营养缺陷型突变株(his-),受试物,代谢活化系统,利用若干不同基因型组氨酸缺陷型菌株，每个菌株具有其独特的回复突变“靶点”顺序，可以由不同类型的碱基置换和移码诱变剂诱发回复突变。该菌株在无外源性组氨酸供给的情况下不能生长繁殖，但当发生回复突变时则可在无外源性组氨酸供给的情况下生长繁殖，计数诱发的恢复菌落数即可判断化学毒物的致突变性。,115,代谢活化系统一般是S9混合液。S9即将一组雄性大鼠进行腹腔注射芳香族化合物如多氯联苯油溶液等诱导大鼠肝脏
28、酶系的活性，4d后杀鼠取肝脏，匀浆，经9000g离心得到的上清液。再加入一些辅助因子，如辅酶(NADP)、葡萄糖-6-磷酸，K+Mg+及缓冲液等组成S9混合液(S9mix)，构成NADPH再生系统。,116,（3）Ames法原理的依据化学物质引起的诱变往往不是直接的，它要经过生物的消化、吸收，特别是高等生物肝脏中的有关酶的作用后再起作用，也许它本来是可以起到诱变作用的，但经肝脏中酶作用后失去了诱变能力，也许正好相反，相来它不具有诱变的能力，但经肝脏酶作用后，反而获得了诱变的能力，因此经过肝脏中酶的作用才能较真实地反映在动物活体中某种化学物的实际诱变能力。诱变剂仅改变突变的频率，但不改变突变的方
29、向，那么同样诱变剂也能导致回复突变，如果用正突变的话是多方向的，所以必需采用反方向的选择方向才行，而用回突变只需用基本的培养基进行筛选即可，步骤就要简单的多。,117,（4）测试菌株TA 98、TA 97（检测移码突变）、TA100（检测碱基置换突变）及TA102（对醛、过氧化物及DNA交联剂较敏感）等。测试菌株含有组氨酸基因突变（his），脂多糖屏障丢失（rfa），紫外线切除修复系统缺失，抗药性标记R。,118,（5）Ames检测方法,119,优点:方法灵敏，检出率高，经试验有90的化学致癌物经都可获得阳性结果；加之方法比较简便、易行，不需特殊器材，容易推广。缺点:微生物的DNA修复系统比哺
30、乳动物简单，基因不如哺乳动物多，不能完全代表哺乳动物的实际情况。尽管如此，由于存在着上述的优势，故目前在致突变试验中占重要位置，为首选的试验方法。,（6）Ames试验的优缺点,120,2、哺乳动物细胞基因突变试验,体外培养细胞的基因正向突变试验。原理是在加入和不加入代谢活化系统的条件下，使细胞暴露于受试物一定时间，然后将细胞再传代培养，突变细胞在含有6硫代鸟嘌呤或三氟胸苷的选择性培养液中能继续分裂并形成集落。基于突变集落数，计算突变频率以评价受试物的致突变性。突变频率是指观察到的突变细胞数与存活细胞数的比值。,121,3、果蝇伴性隐性致死试验,原理：根据隐性基因在伴性遗传中的交叉遗传特征，即雄
31、性的X染色体传给F1代雌蝇。又通过F1代传给F2代雄蝇。X染色体的隐性突变基因在F1代为杂合体，不能表达，而在F2代雄蝇为半合体，能表达出来，如果雄蝇接触受试物后X染色体出现隐性致死性突变，结果其F2代雄蝇数目较雌蝇少一半。由此推断致死突变的存在。,122,4、转基因动物致突变试验,转基因动物指基因组中整合有用实验方法导入的DNA(可以是完整的基因，也可是不完整的DNA片段)，并能遗传给后代的一类动物。目前，用于致突变作用研究的转基因动物主要有商品化的BigBlue小鼠和MutaMouse小鼠。转基因动物致突变试验时，染毒后先抽提纯化不同器官或组织的基因组DNA，把纯化的基因组DNA与噬菌体体
32、外包装抽提物混合，而将导入的基因载体包装进噬菌体中，用这些噬菌体感染大肠菌，可形成噬菌斑，通过噬菌斑颜色变化进行突变的判断并获得突变子。,123,5、染色体畸变分析试验,体外染色体畸变分析试验(in vitro)常用的分析细胞为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、中国仓鼠肺(CHL、V79)细胞及外周血淋巴细胞等。体内染色体畸变分析试验主要有啮齿类动物睾丸细胞染色体畸变和骨髓细胞染色体畸变试验。染色体结构异常主要可观察到裂隙、断裂、断片、缺失、微小体、着丝点环、无着丝点环及各种辐射体等。染色体数目异常包括多倍体及非整倍体。,124,125,6、微核试验(micronucleus assay),微核试验
33、是通过观察有微核的细胞率()，用于检测DNA断裂剂及非整倍体诱发剂。用于微核检测的细胞很多，现已建立了植物细胞(如蚕豆根尖等)、哺乳类动物细胞(如骨髓细胞、肝细胞、肺细胞、淋巴细胞、红细胞、精子等)、非哺乳类动物细胞(如鱼红细胞、蟾蜍红细胞等)的微核试验方法。,126,7、程序外DNA合成试验,当DNA受损后，DNA的修复合成可发生在正常复制合成期(S期)以外的其他时期，称为程序外DNA合成。用同步培养将细胞阻断于Gl期，并将正常的DNA半保留复制阻断，然后用受试物处理细胞，并在加有3H-胸腺嘧啶核苷的培养液中进行培养。如果受试物引起DNA损伤，并启动DNA损伤修复机制，培养液中的3H-胸腺嘧
34、啶核苷就会掺人到DNA链中。利用放射自显影法或液闪计数法测定掺入DNA的放射活性，检测DNA修复合成，从而间接反映DNA的损伤程度。许多哺乳动物及人类细胞可用于UDS的检测。,127,8、姐妹染色单体交换试验,在DNA合成期，所有染色体均进行复制，复制后形成两条姐妹染色单体。姐妹染色单体交换(sister chromatid exchange，SCE)可能与DNA的断裂和重接有关，故可间接反映DNA损伤。SCE的观察方法是采用姐妹染色单体的差别染色,在细胞培养液中加入5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-BrdU)，5-BrdU是嘧啶类似物，在DNA合成期可与胸苷竞争掺人DNA中。DNA复制是半保留复制，
35、经过一次有丝分裂后，5-BrdU掺入后，对染料的亲合力下降，染色后会出现一深一浅两条姐妹染色单体。如果有交换发生就可在光镜下计数SCE。,128,129,二、应注意的一些问题,1、体外试验的活化系统无细胞系统哺乳动物细胞宿主介导试验,130,2、阳性对照和阴性对照的设立阴性对照目的是获得实验的基础数据阳性对照目的是证明实验方法的可靠；实验者在本实验条件下完成技术和鉴定致突变物的能力；证实经一段时间后，本实验的重复性。,131,3、致突变实验结果判定首先应检查试验的质量控制情况：试验程序、操作的正确性、pH、渗透压、代谢活化系统的浓度等；盲法观察；资料的统计学分析；试验结果重复性等。阳性结果应当具有剂量反应关系，即剂量越高，致突变效果越明显，并在观察值与阴性之间有显著差异。,132,阴性结果判定：最高剂量应包括受试物溶解度许可或灌胃量许可的最大剂量；各剂量的组间距不应过大，以防漏检仅在非常狭窄范围内才有突变能力的化学物。对化学物是否具有遗传性或致突变性，通常在检出任一遗传学终点的生物学试验中呈现阳性反应的物质，即可确定其具有致突变性。而要确定某化学物为非致突变物，则需检测5种遗传学终点的一系列试验中，经充分的试验均为阳性。,作业：课后思考题。,133,
