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1、第二章 微生物菌种选育,二、工业微生物来源,source 1,source 2,source 3,向菌种保藏机构索取,从大自然中分离筛选,从发酵制品中分离,国际承认的中国培养物保藏单位,武汉大学的 中国典型培养物保藏中心 CCTCC。保藏了几乎所有的培养物。,(CCTCC),国际承认的中国培养物保藏单位,中科院微生物研究所的 中国普通微生物菌种保藏管理中心 CGMCC。保藏有普通菌种。,(CGMCC),此外，较著名的中国培养物保藏单位还有,中国微生物菌种保藏管理委员会 CCCCM管理机构,工作方案设计（分离）,产品特性微生物生理学知识,微生物生态学知识,分离中如何培养？,微生物生理学知识,三、
2、微生物菌种的选择性分离,工作方案设计（筛选）,产品性质、技术经济指标要求,产品生产工艺,解决质与量的矛盾,三、微生物菌种的选择性分离,三、微生物菌种的选择性分离,微生物样品的采集,微生物样品的富集培养,目的菌种的分离,目的菌的筛选,1.采样,（1）采样原则 样品来源广泛 根据代谢规律（所有菌初生代谢基本相同，次生代谢不同，丝状菌、芽孢菌）在已适应相当苛刻环境压力的微生物类群中寻找新菌种 充分了解目标微生物的性质（种类、生理特征等）如根据微生物的营养类型：纤维素酶产生菌森林土壤蛋白酶和脂肪酶产生菌肉类加工厂和饭店潲水沟中的污水、污泥利用碳氢化合物为碳源的菌株油田附近极端菌的筛选要根据其特殊的生理
3、特征：高温酶产生菌南方、温泉、火山爆发处及北方的肥堆耐压菌油井或海洋深处,(2)采样对象 土壤、水、空气及枯枝落叶等，以土壤为主。从土壤中采样要考虑土壤的以下特点：有机质含量和通风状况耕地、菜园山坡上的森林沙土、无植被土壤、新开垦的生土、贫瘠的土地采样方法：去除表层土，取样的土层深度：5-25cm,几十克，装入无菌牛皮纸袋或塑料袋中,（有机质丰富、通气保水性能好）,细菌、放线菌,（有机质丰富、阴暗潮湿）,霉菌、酵母菌,微生物少,1.采样,1.采样,土壤的酸碱度 偏碱细菌、放线菌 偏酸霉菌、酵母菌土壤的植被状况 葡萄成熟时根部酵母菌增多地理条件 南方土壤比北方土壤微生物含量多季节条件 秋季菜土样
4、最理想,注意事项记录：时间，地点，环境情况等；样品袋应封好口，防止水分失去；土样应在分离前破碎；尽快分离,2.微生物样品的富集培养,概念：利用不同微生物生长繁殖对环境和营养的不同要求，如温度、PH、渗透压、溶氧浓度、碳源和氮源类型及浓度等，人为控制这些条件，使之利于某种微生物的生长，已达到使目的菌种占优势而快速分离纯化的目的的一种方法。适用：样品中目的菌数量不够多时目的：提高样品中目的菌的数量和/或比例原理：通过控制营养成分或培养条件，使目的菌得以繁殖和/或非目的菌的生长受到抑制,富集培养方法,方法控制营养成分 纤维素为唯一碳源，可增殖分解纤维素的菌 可溶性淀粉为唯一碳源，可增殖产淀粉酶的菌
5、酒精废水，可以增殖废水处理菌多种微生物所利用的碳源、氮源不能作控制因素控制培养基pH 细菌、放线菌：中性偏碱，真菌：偏酸 但非目的菌的生长不能被完全抑制,控制培养温度30左右培养，可培殖嗜温微生物5060培养，可培殖嗜热微生物，筛选耐热菌株热处理增殖芽孢细菌 样品悬浮液经80、10分钟处理，杀死营养体，再添加营养培养后可增殖产芽孢细菌,添加抑制剂10%酚数滴：抑制细菌霉菌生长，增殖放线菌抗生素：抑制细菌放线菌，增殖酵母、霉菌多粘菌素B：抑制G-细菌青霉素：抑制G+细菌制毒菌素：抑制真菌放线菌酮：抑制真菌,3.目的菌种的分离,方法,目的：将目的菌从混杂的微生物中分离出来，获得纯培养,平板划线法,
6、b.,连续划线分离法,分区划线分离法,1.稀释平皿分离法,平板稀释法,100ml,1g,9ml,9ml,9ml,9ml,9ml,9ml,1/100,1/1000,10-8,10-7,10-6,10-5,10-4,1ml,1ml,1ml,1ml,1ml,(1)稀 释,b.倾注平皿分离法,a.涂布平皿分离法,（2）倒平板,用刚果红染色法鉴定筛选降解纤维素的菌株,羧甲基纤维素钠作培养物,抗生素筛选,检定菌培养，加上发酵液,4.目的菌的筛选,这一步是采用与生产相近的培养基和培养条件，通过三角瓶的容量进行小型发酵试验，以求得适合于工业生产用菌种。,影印平板法筛选目的菌,四、重要工业微生物菌种的分离,筛选
7、菌株的一些重要指标：（1）菌的营养特征（2）菌的生长温度（3）菌对所采用的设备和生产过程的适应性（4）菌的稳定性（5）菌的产物得率和产物在培养液中的浓度（6）容易从培养液中回收产物。,生产性能,抗生素产生菌的筛选,Text,产生药理活性化合物菌株的筛选 药理活性化合物是指能抑制人类代谢中某一个关键酶的微生物产物即酶抑制剂，从而达到治疗的目的。,多糖产生菌的筛选 从菌落外观判断，选择外观呈粘液状的菌落，然后根据液体培养测定多糖含量来筛选高产菌。,生长因子产生菌的筛选通过观察分离菌能否促进营养缺陷型菌株的生长，来检出生长因子产生菌。,第二节 发酵高产菌种选育,菌种选育的目的,1、提高发酵产量2、改
8、进菌种的性能3、产生新的发酵产物4、去除多余的组分,自然选育,诱变育种,杂交育种,原生质体融合,第二节 发酵高产菌种的选育,主要通过突变和筛选来获得优良菌株,主要通过DNA重组来获得优良菌株,基因工程育种,一、自然选育,自然选育,概念：在生产过程中，不经过人工处理，利用菌种的自发突变，选育出优良菌种的过程。,二、诱变育种,诱变育种是利用物理或化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群，促进其突变率大幅度提高，然后采用简便、快速和高效的筛选方法，从中挑选少数符合育种目的的突变株，以供生产实践或科学研究用。诱变育种包括诱变和筛选两部分。,诱变育种的原理,诱变育种的理论基础是基因突变，包括染色体突变和基因
9、突变两类,紫外线快中子,NTGNM烷化剂,噬菌体转座子,诱变育种步骤,出发菌株的选择制备菌悬液诱变处理突变菌株的筛选,选择纯种菌株（排除异核体）优良性状的菌株（产生孢子、生长速度）对诱变剂敏感的菌株同时选择几株不同的优良菌株,（一）出发菌株的选择,(二)处理菌悬液的制备,这一步骤的关键是制备单细胞和单孢子状态的、活力类似的菌悬液，为此要进行合适培养基的培养，并要离心，洗涤，过滤。,带玻璃珠的三角瓶内,加无菌水,(三)诱变处理,1）选择原则不稳定菌株温和的、常用的诱变剂；稳定菌株强烈的、不常用的、诱变谱广的诱变剂不经常使用一种诱变剂，也不宜频繁更换。注意考虑诱变剂本身的特点。UV DNA的嘧啶碱
10、基；亚硝酸嘌呤碱基,诱变剂的选择,高剂量：致死率90%-99.9%变异幅度大，但负变株多低剂量：致死率75%-80%负变株少，且突变菌株稳定,2）诱变剂量的选择,(四)突变菌株的筛选,筛选分初筛和复筛。初筛以迅速筛出大量的达到初步要求的分离菌落为目的，以量为主。复筛则是精选，以质为主，也就是以精确度为主。因此在具体方法上就有差异。初筛和复筛均要有亲株作对照比较生产能力是否优良。复筛后的优良菌株要考查其稳定性、菌种特性和最适培养条件,根据操作方法可分为随机筛选和理性化筛选,随机筛选,理性化筛选,从产物形成的生理生化途径着手，进行有的放矢的筛选。如营养缺陷型、抗性突变株等。,经过诱变处理后，进行平
11、板分离，随机挑选单菌落，筛选高产菌株,1）营养缺陷型菌株筛选,理性化筛选,所谓营养缺陷型菌株是微生物经诱变剂处理后产生的一种生化突变体。由于基因突变，它失去了合成某种物质（氨基酸、维生素或核苷酸碱基）的能力，在基本培养基上不能生长，大多数营养缺陷型菌株需要补加一定种类的有机物质后才能生长。,与筛选营养缺陷型有关的三类培养基：基本培养基（MM，minimal medium）能满足某一菌种的野生型菌株营养要求的最低成分的合成培养基。补充培养基（SM，supplemental medium）在基本培养基中有针对性地补加某一种或几种营养成分，以满足相应的营养缺陷型菌株生长需要（其他营养缺陷型仍不能生长
12、）的培养基。完全培养基（CM，complete medium）可满足该菌各种营养缺陷型菌株营养需要的天然或半合成培养基。,原理：抗反馈阻遏和抗反馈抑制突变株都是由于代谢失调所造成的，在细胞中已经有大量最终代谢产物时仍然继续不断地合成这一产物。,方法：选育结构类似物抗性突变株,结构类似物是指一些和微生物体内代谢产物结构相类似的物质，因而能够引起反馈，但是它们不能参与生物合成。,目的：突变株能够不受反馈抑制或是反馈阻遏影响，不断积累末端产物,2）抗反馈阻遏和抗反馈抑制突变株的筛选,几个概念反馈调节：当合成代谢途径的终产物或分支代谢途径的终产物过量积累时，抑制合成代谢途径的关键酶（往往是代谢途径或分
13、支代谢途径第一步的酶）的活力或相关酶的合成。反馈调节分为反馈抑制和反馈阻遏。反馈抑制是指合成代谢途径终产物过量积累时对该途径前端某些关键酶酶活性的抑制作用。反馈阻遏是指微生物合成代谢中高浓度终产物对该途径上酶合成的抑制作用。,3）组成型突变株的筛选及应用,组成型突变株：在没有诱导底物存在时也能产生大量诱导酶的突变株。筛选原理：通过诱变处理，使调节基因发生突变，不产生有活性的阻遏蛋白，或者操纵基因发生突变不再能与阻遏物相结合，从而使诱导型酶变为组成型酶。,筛选方法：创造一种有利于组成型菌株生长而不利于诱导型菌株生长的培养条件，造成对组成型突变株的选择优势；选择适当的鉴别培养基，直接在平板上识别两
14、类菌落，从而把组成型突变株选择出来。,4）抗性突变菌株的筛选,抗生素抗性突变株,在抗生素产生菌选育中，通过筛选抗生素抗性突变可提高抗生素产量。,抗生素抗性突变株除能提高抗生素的产量外，还能提高其它代谢产物的量。,条件抗性突变,因环境不同，能表现为野生型菌株的特性和突变型菌株特性的突变称为条件抗性突变或称为条件致死突变。,温度敏感突变常用于提高代谢产物产量,致死,营养缺陷,定义 人为利用真核微生物的有性生殖或准性生殖，或原核微生物的接合、F因子转导、转导和转化过程，促使两个具不同遗传性状的菌株发生基因重组，以获得性能优良的生产菌株。理论基础基因重组,一、定义和特点,定向杂交后对诱变剂敏感消除诱变
15、效应饱和改变产品质量和产量操作复杂，技术要求高，推广和应用受限,特点,三、杂交育种,杂交方式-DNA的转化,杂交方式-转导（借助噬菌体）,杂交方式-准性生殖,准性生殖是指异核体（单个生物个体中含有两种或两种以上基因型）细胞中两个遗传物质不同的细胞核可以结合成杂合二倍体的细胞核。这种杂合二倍体的细胞核在有丝分裂过程中可以发生染色体单倍体化,最后形成遗传物质重组的单倍体的过程。也就是不经过减数分裂就能导致基因重组的生殖过程。,四、原生质体融合,定义 通过人工方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体发生融合，并产生重组子的过程，也叫细胞融合。,提高细胞间重组频率打破物种界限将多个优良性状集中到一个菌
16、株中对设备要求不高，一般实验室都可以进行,原生质体融合的优点,（一）原生质体融合育种步骤,原生质体融合,1.标记菌种的选择 一般以营养缺陷型和抗药性等遗传形状作为标，且标记必须稳定。,2.原生质体的制备,在放线菌和细菌中，制备原生质体主要采用溶菌酶；酵母和霉菌一般可用蜗牛酶或纤维素酶等。,1）菌体的前处理（EDTA、青霉素）,2）菌体的培养时间,4）酶处理温度,3）酶浓度,6）渗透压稳定剂（甘露醇、蔗糖、KCl）,5）酶解时间,3.原生质体融合,在融合剂PEG和Ca2+作用下，发生原生质体融合。,4.原生质体的再生,再生培养基-由渗透压稳定剂和各种营养成分组成。,5.融合子的选择,要获得真正融
17、合子，必须在融合体再生后，进行几代自然分离、选择，才能确定。,1.单一亲株灭活野生型亲株灭活营养缺陷型耐链霉素亲株,链霉素耐药原养型菌株,2.双亲株或多亲株灭活,两株高产菌株两株野生菌株,混合,均分,A热灭活BUV灭活,融合后筛选效价高生长快,采用热、紫外线、电离辐射以及某些生化试剂、抗生素等作为灭活剂处理单一或双亲株的原生质体，使之失去再生的能力，经细胞融合后，由于损伤部位的互补可以形成能再生的融合体。,（二）灭活原生质体融合技术在育种中的应用,1.去除了细胞壁的障碍，亲株基因组直接融合、交换，实现重组，不需要有已知的遗传系统。2.原生质体融合后两亲株的基因组之间有机会发生多次交换，产生各种
18、各样的基因组合而得到多种类型的重组子。3.重组频率特别高。4.可以和其他育种方法相结合。,（三）原生质体融合技术的优点：,五、基因工程育种,定义 基因工程育种是用人为的方法将所需的某一供体生物的遗传物质DNA分子提取出来，在离体条件下切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后导入某一受体细胞中，让外来的遗传物质在其中进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种技术。,一、菌种退化,1.定义是指在较长时期传代保藏后，菌株的一个或多个生理性状和形态特征逐渐减退或消失的现象。,第三节 菌种的退化和菌种的保藏,2.引起菌种退化的原因,（1）基因突变,（2）变异菌株性状分离（广义的退化）,（3）连续
19、传代,3.菌种的复壮,使衰退的菌种恢复原来优良性状。狭义的复壮是指在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和生产性能测定等方法，从衰退的群体中找出未衰退的个体，以达到恢复该菌原有典型性状的措施；广义的复壮是指在菌种的生产性能未衰退前就有意识的经常、进行纯种的分离和生产性能测定工作，以期菌种的生产性能逐步提高。,菌种的复壮措施,纯种分离：（平板划线法、涂布法、倾注法、单细胞挑取法等）。通过寄主体内生长进行复壮（如Bacillus thuringiensis的复壮）；联合复壮（采用比较激烈的理化条件进行处理，以杀死生命力较差的已衰退个体）。,1）合理的育种；2）控制传代次数（一般在DNA的复制过程中
20、，碱基的错 配率是5x10-4，自发突变的频率为10-810-9，采用良好的菌种保藏方法，可以减少移种和传代的数）；3）选择合适的培养条件；4）采用不同类型的细胞进行传代（对丝状微生物而言，通常采用稳定的单核孢子进行接种）；5）采用有效的菌种保藏方法。,4.防止菌种衰退的方法,菌 连续在培养基上（内）移种 种 生活态 传代培养保藏法 连续在活宿主上（内）移种 保 固体斜面 藏 湿法 半固体琼脂柱 方 休眠态 液体介质（蒸馏水、糖液、矿物油）法 干法 藏在玻璃管内 吸附在合适的载体上（沙土、硅胶等）,二、菌种保藏,蒸馏水悬浮法 斜面传代保藏 矿物油中浸没保藏 干燥载体保藏 冷冻保藏 真空冻干保藏
21、,微生物菌种保藏方法,斜面传代保藏,可用于各类微生物的保藏4保藏不适宜长期保藏，一般保存36个月经常转接（36个月转接一次）,矿物油保藏法：液体石蜡 保藏时间12年干燥载体保藏法：沙土 保藏时间110年,冷冻保藏（菌种对数期）：,普通冷冻保藏技术（-20）微生物活力可维持12年，不适宜长期保藏超低温冷冻保藏技术（-60 以下）终浓度810%甘油或5%二甲亚砜 保存5年液氮冷冻保藏技术 最佳保藏方法,真空冻干保藏,原理：水分升华菌种的稳定期保护剂：脱脂乳、蔗糖、动物血清菌种活力10年不丧失,安瓿管,寄主保藏：动植物病原菌和病毒基因工程菌的保藏（质粒）：保藏在含低浓度选择剂的培养基中,几种常用菌种
22、保藏方法的比较,第四节 微生物菌种的扩大培养,菌种制备的过程,1,影响菌种质量的因素,2,菌种的扩大培养,3,1.什么叫种子,将冷冻干燥管、砂土管中处于休眠状态的工业菌种接入试管斜面活化后，再经摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质量的纯种的过程。这些纯培养物都称为种子。,第四节 微生物菌种的扩大培养,中试,小试,任务：提供发酵产量高、性能稳定、接种数量足够的、纯的培养物,2、实验室种子培养,实验室种子培养阶段目的是为种子罐提供种子，包括琼脂斜面、固体培养基扩大培养或摇瓶液体培养。,（1）固体斜面菌种培养,（2）固体培养基扩大培养,（3）摇瓶液体培养,3、生产车间种子制备,（1）种子罐培养
23、基,（2）种子罐接种,微孔接种法：利用注射器在罐的接种口橡皮膜上注入罐内进行接种。,（3）种子罐级数,种子罐级数是指制备种子需要逐级扩大培养的次数。,种子罐级数的确定,种子扩大的级数：制备种子需逐级扩大培养的次数,种子罐级数越少，越有利于简化工艺和控制，并减少由于多次转种而带来的染菌机会以及减少因种子罐生长异常而造成的发酵波动 但考虑能否在一定时间内获得优质、足量的种子以满足发酵的需求,确定方法,取决于：菌种生长特性、孢子发芽及菌体繁殖速度所采用发酵罐的容积,举 例,影响种子质量的因素,接种量,种龄,染菌控制,培养基,培养条件,4.影响种子质量的因素,（1）培养基,生产过程中经常出现种子质量不稳定的现象，其主要原因是原材料质量波动。,配制产孢斜面培养基用的麸皮，因小麦产地、品种、加工方法及用量 制备霉菌用的大米，其产地、颗粒大小、均匀程度不同 蛋白胨加工原料不同（如鱼胨或骨胨）水质的硬度、污染程度,原材料质量的波动，起主要作用的是其中的无机离子含量不同。如微量元素Mg2+、Cu2+、Ba2+能刺激孢子的形成。磷含量太多或太少也会影响孢子的质量。,4.影响种子质量的因素,（2）培养条件,（3）接种量和种龄的影响 种龄是指种子罐中培养的菌体从接种开始到移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。一般5%-10%。并以对数生长末期为合适（4）种子罐的级数（5）避免染菌,
