《第十一章糖的分析课件.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《第十一章糖的分析课件.ppt（34页珍藏版）》请在三一办公上搜索。
1、糖的分析,生命科学与生物医学工程罗云敬,9/24/2022,1,糖的分析生命科学与生物医学工程9/24/20221,一、糖的概念,（一）糖类的存在与来源糖是自然界分布很广的一类化合物，几乎所有的动物、植物和微生物体内都含有糖类。地球上糖类物质的根本来源是绿色细胞进行的光合作用。,9/24/2022,2,一、糖的概念（一）糖类的存在与来源9/24/20222,糖类的主要生物学作用,1可作为生物体的结构物质，如纤维素。2可转变为生命所必需的其它物质，如脂类、蛋白质等。3是生物体主要的能量来源。4可作为细胞识别的信息分子。,9/24/2022,3,糖类的主要生物学作用1可作为生物体的结构物质，如纤维
2、素。9,（二）糖的化学本质,糖也称碳水化合物（carbohydrate），用Cm(H2O)n表示。碳水化合物这个名称并不确切，但因沿用已久，所以至今在西文中还广泛使用。糖是多羟醛或多羟酮及其缩聚物和某些衍生物的总称。,多羟基醛,多羟基酮,9/24/2022,4,（二）糖的化学本质 糖也称碳水化合物（carbohydrat,（三）糖结构的测定,寡糖与多糖的结构复杂：三个相同的氨基酸只能形成一种形式的三肽，而三个相同的己糖却能构成176种异构体！测量的结构包括：分子量糖链中糖残基的种类和数量糖残基结合的位置-连接点构型,9/24/2022,5,（三）糖结构的测定寡糖与多糖的结构复杂：三个相同的氨基
3、酸只,测定方法,早期测定方法：显色分析法滴定分析法基于比重的分析法,现代分析法：自动化液相色谱法流动注射分析离子色谱毛细管电泳分离分析法核磁共振质谱分析法,9/24/2022,6,测定方法早期测定方法：现代分析法：9/24/20226,6.1 糖的结构,单糖：寡糖：多糖,是构成各种糖分子的基本单位，按其分子中所含碳原子的数目，又分为丙、丁、戊、己和庚糖。,由26个单糖缩合而成，二糖最为重要，如麦芽糖、蔗糖。,由多个单糖分子缩合失水而成的高分子聚合物，分子量很大，如淀粉和纤维素等。,结晶、溶于水、具有甜味,不溶于水，无甜味,9/24/2022,7,6.1 糖的结构单糖：是构成各种糖分子的基本单位
4、，按其分子中,单糖的命名：普遍以来源命名，如果糖、木糖、和葡萄糖。其中以五碳糖和六碳糖最为重要。,D-葡萄糖,9/24/2022,8,单糖的命名：D-葡萄糖9/24/20228,D-2-脱氧核糖,b-D-2-脱氧核糖,a-D-2-脱氧核糖,a-D-(+)-葡萄糖,a-D-(+)-甲基葡萄糖苷,五碳糖（核 糖）,糖 苷 键,9/24/2022,9,D-2-脱氧核糖b-D-2-脱氧核糖a-D-2-脱氧核糖a-,淀粉直链淀粉 分子量约1万-200万，250-260个葡萄糖分子，以（14）糖苷键聚合而成。呈螺旋结构，遇碘显紫蓝色。支链淀粉中除了（14）糖苷键构成糖链以外，在支点处存在（16）糖苷键，分
5、子量较高。遇碘显紫红色。,9/24/2022,10,淀粉9/24/202210,6.2 糖的化学分析法,一 羰基的反应是糖许多定性和定量分析方法的基础还原法：糖类化合物的醛基和酮基在溶液中以游离和烯醇两种形式存在，烯醇式糖类是具有一定活性的还原剂。最常见的还原反应是将Cu2+还原为Cu+，在碱性溶液中形成黄色CuOH，在加热的情况下继续转化为不溶性Cu2O。,9/24/2022,11,6.2 糖的化学分析法一 羰基的反应9/24/202211,在严格控制实验条件的情况下，Cu2O生成量的多少可以作为糖量多少的定量指标。Cu2O的量可以通过其还原磷钼酸到深蓝色钼蓝进行定量，其吸收波长在70075
6、0nm。,烯醇式,9/24/2022,12,在严格控制实验条件的情况下，Cu2O生成量的多少可以作为糖,醛糖和酮糖与芳香胺的反应醛糖和酮糖在冰乙酸中与不同的芳香胺发生缩合反应生成有色物质。常用的芳香胺有邻茴香胺、对氨基水杨酸、对氨基苯甲酸、二苯胺和对氨基苯酚等。芳香胺类化合物对于某一种或者某一类的糖的反应具有选择性。但是芳香胺类化合物具有致癌性不适合于实验室使用。,羰基的反应,9/24/2022,13,醛糖和酮糖与芳香胺的反应羰基的反应9/24/202213,与强酸和酚的反应：戊糖和己糖与强酸和酚一起加热，反应时会分别产生呋喃或羟甲基呋喃衍生物，醛基然后与酚缩合产生有颜色的化合物,9/24/2
7、022,14,与强酸和酚的反应：9/24/202214,9/24/2022,15,糖 糠醛或糠醛衍生物 紫色 浓,9/24/2022,16,己酮糖 羟甲基糠醛 红色,6.2.2 多糖的结构分析,化学分析法：寡聚多糖与碘的反应可以作为一些多糖定性分析的基础碘与淀粉 蓝色碘与糖原和糊精 红色碘与纤维素 无色,9/24/2022,17,6.2.2 多糖的结构分析化学分析法：9/24/202217,过氧化反应糖类被强氧化剂如高碘酸氧化时，碳链会发生断裂,pH5.0条件下加入高碘酸钠于4进行24小时，然后加入乙二醇破坏过量的高碘酸。通过所消耗的高碘酸的量可以推测多糖分子中所存在的相邻羟基的数目。反应中所
8、消耗的高碘酸可以通过滴定或光谱法测定。,9/24/2022,18,过氧化反应pH5.0条件下加入高碘酸钠于4进行24小时，然,质谱分析法：关键问题是离子化：快原子轰击（FAB)、电喷雾离子化（ESI)和基体协助激光解吸离子化（MALDI)软电离技术都适用于糖类分析。飞行时间质谱（TOF-MS)和傅立叶变换质谱（FT-MS)测大分子糖的分子量要比光散射法或凝胶渗透法精度高得多，特别是LC/MS和MS/MS分析法更有用。,9/24/2022,19,质谱分析法：9/24/202219,MALDI-TOF/MS用于测量寡糖的分子量，源后衰减技术（Postsource Decay,PSD)用于测寡糖结构
9、。最有效的方法还是MALDI-FT-MS/MS法。,9/24/2022,20,MALDI-TOF/MS用于测量寡糖的分子量，源后衰减技术（,步骤酶降解糖复合物，切割寡糖链；HPLC分离纯化质谱分析得出结论后，用其他方法核证，如GC/MS,MS/MS和NMR等,9/24/2022,21,步骤9/24/202221,6.3 糖的酶法分析,当化学分析法达不到分析特异性的要求，采用酶分析法通常可以在各种异构体的混合物中实现对某一种的选择性测定，并能区分和构型常用的酶：-半乳糖苷酶、-葡萄糖苷酶、-半乳糖苷酶等,9/24/2022,22,6.3 糖的酶法分析当化学分析法达不到分析特异性的要求，采,6.3
10、.1 基于葡萄糖氧化酶的葡萄糖分析,-D-葡萄糖+O2+H2O D-葡糖酸+H2O2-D-葡萄糖被氧化的反应速率低于-D-葡萄糖的1%-D-葡萄糖与-D-葡萄糖两种异构体以平衡的形式存在，在变旋酶的作用下向不断转化，最终使得反应进行完全。,9/24/2022,23,6.3.1 基于葡萄糖氧化酶的葡萄糖分析-D-葡萄糖+O2,基于显色反应的过氧化氢分析上述反应所产生的过氧化氢可以用显色法测定，最早用的底物为邻-连甲苯胺和邻-茴香胺，但是具有致癌性，已被取代。但是要注意避免过氧化物酶的干扰，它可以使过氧化氢变为水和氧气。基于电化学的过氧化氢分析是葡萄糖分析仪的基础分析速度快，一分钟之内就可以完成，
11、而且试剂及样品的消耗少（10l）。,9/24/2022,24,基于显色反应的过氧化氢分析9/24/202224,6.3.2 基于葡萄糖脱氢酶或己糖激酶的葡萄糖分析法,葡萄糖脱氢酶-D-葡萄糖+NAD+/NADP+葡萄糖酸内酯+NADH/NADPH利用动力学法或固定时间法测定产物NADH在340nm处的吸收分析时要用变旋酶加速型向型D-葡萄糖的变化,葡萄糖脱氢酶,9/24/2022,25,6.3.2 基于葡萄糖脱氢酶或己糖激酶的葡萄糖分析法葡萄糖脱,己糖激酶,葡萄糖+ATP,己糖激酶,葡萄糖-6-磷酸+ADP,葡萄糖-6-磷酸+NADP+,G-6-P脱氢酶,6-磷酸葡萄糖酸+NADPH+H+,己
12、糖激酶对于普通帖并不具有专一性，但是第二个反应对葡萄糖-6-磷酸具有很高的专一性。,9/24/2022,26,己糖激酶葡萄糖+ATP己糖激酶葡萄糖-6-磷酸+ADP葡萄糖,6.3.3 其他己糖分析方法,甘露糖-6-磷酸果糖-6-磷酸葡萄糖-6-磷酸6-磷酸葡萄糖酸+NADPH,甘露糖果糖葡萄糖,己糖激酶+ATP,己糖激酶+ATP,己糖激酶+ATP,利用己糖激酶分析甘露糖、果糖、及葡萄糖的原理，检测在340nm处。,9/24/2022,27,6.3.3 其他己糖分析方法甘露糖-6-磷酸甘露糖己糖激酶+,6.4 糖混合物的分离鉴定,脎：黄色晶体，有固定熔点和固定晶形，成脎时间不同，可用来鉴别醛酮
13、三种果糖具有相同的烯醇式，所以成脎的产物完全相同,9/24/2022,28,6.4 糖混合物的分离鉴定 脎：黄色晶体，有固定熔点和固定晶,6.4.1 纸色谱及薄层色谱,糖的样本一般溶于异丙醇中，质量浓度大约为2g/L，点样量一般为10l定义葡萄糖的Rf值为100分离之后一般要经过显色反应以确定糖的位置，使用不同的显色剂有助于未知斑点的鉴定显色是采用喷雾或浸入，在100下加热510分钟,9/24/2022,29,6.4.1 纸色谱及薄层色谱糖的样本一般溶于异丙醇中，质量浓,6.4.2 气相色谱法,当要鉴定或定量一种或多种糖类化合物，特别是量比较小时，用气相或液相色谱法可以分离结构十分相近的糖类化
14、合物糖类需衍化为挥发性衍生物后方可用气相色谱法，常见的衍生物类型有o-三甲基硅（TMS)。,9/24/2022,30,6.4.2 气相色谱法当要鉴定或定量一种或多种糖类化合物，特,1阿拉伯糖arabinose;2.半乳糖galactose;3.葡萄糖glucose;4.甘露糖mannose,羊肚菌多糖的气相色谱图,可以看出,羊肚菌多糖MEP-SP2是由甘露糖、葡萄糖、阿拉伯糖和半乳糖残基为重复单元组成的,摩尔比为1.754.130.710.68,9/24/2022,31,1阿拉伯糖arabinose;2.半乳糖galactos,6.4.3 高效液相色谱,不需要衍生为气化物质用分配或者离子交换色
15、谱分离，检测使用紫外或折光率检测器通常使用键合固定相，以反向色谱方式分离，洗脱用乙腈和水（80：20），其中含0.1mol/L的乙酸。,9/24/2022,32,6.4.3 高效液相色谱不需要衍生为气化物质9/24/202,6.4.4 高效毛细管电泳法（HPCE),用化学衍生法为糖类带上具有紫外吸收或发荧光的基团：还原氨基化多数糖分子在通常情况下难以电离，通过衍生化其电离能力和疏水性也发生了相应的变化。碱性硼酸体系是电泳的首选介质，一般地，硼酸浓度在50200mmol/L之间，pH范围在9.511之间。,9/24/2022,33,6.4.4 高效毛细管电泳法（HPCE)用化学衍生法为糖类带,展 望,目前寡糖和多糖的分析还是一个非常复杂的问题，对于其分析还没能彻底解决。从发展趋势上看，如何将高效的分离技术和灵敏的检测技术结合，已解决复杂体系糖的分析问题，特别是糖的结构分析问题将是一个长期的任务。,9/24/2022,34,展 望目前寡糖和多糖的分析还是一个非常复杂的问题，对于其分析,
