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1、细胞凋亡（Apoptosis）信号通路抑制剂,细胞凋亡也称为程序性细胞死亡（PCD），是由基因控制、高度有序的细胞自主死亡，属于发育和老化过程中发生的正常现象。凋亡被视为细胞更新，分化和免疫系统功能发挥的重要环节之一，而免疫反应或者疾病或有毒物质引起细胞损伤时发生的凋亡则是一种正当的防卫机制。体内凋亡的异常会引发许多顽固性疾病，如凋亡过度会导致糖尿病，神经退行性疾病，艾滋病等，凋亡过少会诱发恶性肿瘤，自身免疫性疾病，病毒感染等。因此，对凋亡机制的研究具有非常重要的生理意义。细胞凋亡的发生伴随着凋亡酶caspase的激活，参与凋亡的caspase分为启动酶（caspase-2，caspase-8
2、，caspase-9，caspase-10）和执行酶（caspase-3，caspase-6，caspase-7）。分别位于凋亡信号的上下游。,凋亡主要通过两条途径来实现，一条是外部途径，通过胞外信号激活细胞内caspase；外部途径又称为死亡受体途径，因其是通过特定的死亡配体（如FasL,TNF）与细胞表面的死亡受体(如Fas,TNFR)相互作用而介导的，从而激活胞内的凋亡酶：起始酶caspase 8caspase 3；或切割Bcl家族成员Bid蛋白细胞色素c释放caspase 9放大caspase 3活化。另一条是内部途径，通过线粒体释放凋亡酶激活因子激活caspase，活化的caspas
3、e降解胞内的重要蛋白从而引起细胞凋亡。内部途径也称为线粒体途径，因其通过线粒体相关的Bcl-2家族调控细胞色素c的释放。胞浆中与 Apaf-1，dATP，caspase-9前体反应形成凋亡复合物。caspase 9前体经活化后激活caspase 3。此途径为脊椎动物最普遍的细胞死亡途径。（见图1 细胞凋亡信号通路）,胞外的死亡信号可通过死亡受体转入胞内。死亡受体为一类跨膜蛋白,属肿瘤坏死因子受体(NFR)基因超家族。其胞外部分都含有一富含半胱氨酸的区域,胞质区有一由同源氨基酸残基构成的结构,有蛋白水解功能,称“死亡区域”(death domain)。“死亡区域”使死亡信号得以 进一步传递而启动
4、凋亡。已知的死亡受体有五种,TNFR-1(又称 CD120a 或 p55),Fas(CD95 或 Apo1),DR3(死亡受体3,又称 Apo3,WSL-1,TRAMP,LARD),DR4 和 DR5(Apo2,TRAIL-R2,TRICK2,KILLER)。前三种受体相应的配体分别为 TNF,FasL(CD95L),Apo3L(DR3L),后两种均为 Apo2L(TRAIL)。,死亡受体通路,Fas介导凋亡先由不同的胞质蛋白与受体(FasL)的死亡域结合,然后连接蛋白即 Fas 相关死亡域蛋白FADD直接与Fas死亡域结合,FADD 激活ced-3相关蛋白酶 即 Caspase-8,引发蛋白
5、水解,导致细胞死亡。TNF 与 TNFR1 结合可诱导受体死亡结构域的聚集,随后,TRADD通过自身的死亡结构域与聚集的 TNFR1 死亡结构域结合。TRADD 可招募TRAF2、RIP 和 FADD 几种信号分子与激活受体结合而形成受体复合物。TRAF2 和 RIP 可以激活NF-kB 和 JNKPAP-1,FADD 则可以激活细胞凋亡机制。在这些蛋白中,只有 RIP 具有酶活性,但是RIP 在 NF-kB 和 JNKPAP-1 的激活过程中的作用还不是很清楚。TRAF2 和 RIP 激活 NIK,后者进而激活IKK(I-kB kinase)。IKK 磷酸化I-kB,导致 I-kB 降解,使
6、NF-kB 进入核内,激活转录凋亡抑制蛋白IAP，IAP出核，抑制Caspase 产生的级联反应。,线粒体通路,此通路由含 BH3 结构域的 Bc-l 2 家族成员 Bid、Bad、Puma、Noxa 等在接受到胞内的死亡信号后激活。这些含 BH3 结构域的 Bcl-2 家族成员与另外的 Bc-l 2 家族成员(Bax 亚家族成员 Bax,Bak 等,主要松散的结合在线粒体外膜面或存在于胞浆)作用,导致后者的寡聚并插入线粒体膜,引起线粒体膜通透性改变,跨膜电位丢失,释放细胞色素 C(Cytc)和其他蛋白。Cytc 的释放是线粒体凋亡路径的主要步骤,在 ATP PdATP 存在的情况下,Cytc
7、 与凋亡蛋白酶活化因子 Apa-f1 形成多聚复合体,通过 Apa-f 1 氨基端的 Caspase 募集结构域(caspase recruitment domain,CARD)募集胞质中的 Caspase-9 前体,并使其自我剪切活化并启动Caspase 级联反应,激活下游的 Caspase-3 和 Caspase-7,完成其相应底物的剪切,引起细胞凋亡。,此外,定位于线粒体上的转录因子 p53 能与Bak、Bax直接相互作用,这种相互作用解除了Bak与 Mc-l 1(Bc-l 2 蛋白家族中的抗凋亡蛋白)的结合,使 Bak 中的 BH3 结构域外露,从而处于促凋亡的结构构象此外,这种相互作
8、用还引起 Bak、Bax多聚化,这一系列的变化导致线粒体通透性的改变,使各种促凋亡因子释放到细胞质中。,内质网通路,内质网是细胞内蛋白质合成的主要场所,同时也是 Ca2+的主要储存库。内质网在维持细胞内钙离子的稳定以及膜蛋白的合成、修饰和折叠等方面都发挥关键性作用。内质网在凋亡信号处理过程中发挥重要作用,内质网通路不同于线粒体或死亡受体介导的凋亡通路。Caspase-12 位于内质网膜,内质网钙离子平衡的破坏或者内质网蛋白的过量积累都会诱导 Caspase-12 表达,同时也导致胞质的Caspase-7 转移到内质网表面。Caspase-7 激活Caspase-12,激活的 Caspase-1
9、2 可进一步剪切 Caspase-3 而引发细胞凋亡。此过程由内质网失常引起,内质网上 Bc-l 2 家族中抑凋亡的蛋白则可以调节网腔中游离 Ca2+浓度,使胞质中的 Ca2+维持在合适的浓度水平,进而起到抗凋亡的作用。,1.Fas ligand（Fas 配基）抑制剂：Fas 配基（又称为Fas L或CD 95L）是II型跨膜蛋白，属于肿瘤坏死因子（TNF）家族成员。Fas配基与FAs（受体）结合从而引发体内凋亡的发生是细胞凋亡外部途径的重要方式之一，此种方式发生的凋亡在免疫系统的调控和癌症的发展进程中发挥着重要作用。,2.caspase抑制剂：Caspase（凋亡酶）参与凋亡，坏死和炎症信号
10、转导通路。参与凋亡的caspase主要分为两类，启动酶（caspase-2，caspase-8，caspase-9，caspase-10）和效应酶（caspase-3，caspase-6，caspase-7），前者位于凋亡信号的上游，后者位于凋亡过程的下游，可直接切割细胞内有重要作用的底物蛋白，引起细胞凋亡发生。至今发现的caspases底物超过700种。启动酶如caspase 8可以直接被死亡受体如FasR激活，另外也可以发现caspases在胞内作为一些多蛋白复合物的组成部分，如凋亡过程中caspase 9被招募聚合形成凋亡复合物，而caspase 1和caspase 5能够组成炎性小体的
11、一部分。,3.Bcl-2家族抑制剂：Bcl-2家族属于较大的蛋白家族，所有成员至少包含4个bcl-2 同源结构域（BH，分别命名为BH1，BH2，BH3，BH4）之一，BH对凋亡功能的发挥意义重大。依据BH结构域组成的差异，其中有的成员是抗凋亡因子如Bcl-2，Bcl-xl和Mcl 1，而有的成员是促凋亡因子如Bax，Bak和Bok，后者又可以细分为只含BH3的促凋亡蛋白（如Bid，Noxa，Puma和Bad）以及同时包含BH13的多结构域蛋白（如Bax和Bak）。绝大多数Bcl-2家族成员含有C端跨膜结构域，该结构域能促使蛋白与线粒体外膜或其他胞外膜结合从而发挥各自功能。Bcl-2基因与多种
12、不同肿瘤的发展和治疗抵抗性密切相关。,4.p53抑制剂：p53是人体中由TP53基因编码的肿瘤抑制蛋白。对多细胞生物而言，p53意义重大，不仅参与调控细胞循环，而且作为肿瘤抑制剂预防肿瘤发生，p53具有许多抗肿瘤机制，在细胞凋亡，衰老，维持基因稳定性，抑制血管生成中都扮演重要角色。P53属于转录因子，其蛋白水平和翻译后修饰状态随细胞应激而发生变化，应激物如DNA损伤，缺氧，纺锤体损伤，热激等等。P53的激活起始于一系列的生理机制包括ATM,ATR,CHk1和MAPKs的磷酸化作用。MDM2是一种与p53结合的泛素连接酶，靶向p53后进入蛋白酶体降解。总而言之，p53的激活常常引起凋亡发生，p5
13、3失活加速肿瘤进程，超过50%的癌症都发现有失活的p53突变型。正常细胞受负调节剂mdm2作用p53处于失活状态，一旦受到细胞损伤或其他应激物刺激，各种通路会引起p53和mdm2复合物的解聚。一旦激活后p53会诱导细胞停滞促进损伤修复维持细胞存活，或者凋亡直接致死损伤细胞。目前就p53如何做修复和凋亡的选择仍不清楚。,5.survivin抑制剂：人体生存素（survivin，也称为BIRC5）是由BIRC5基因编码的蛋白，属于凋亡抑制蛋白（IAP）家族的成员之一。通过扰乱survivin介导的信号途径引起凋亡细胞增加或者减少肿瘤生长，发现Survivin蛋白在功能上能够抑制caspase激活从而作为凋亡负调控因子。人肿瘤细胞或胎儿组织中发现survivin大量表达，但在分化成熟的正常细胞中几乎不表达，因此survivin成为对肿瘤细胞进行肿瘤诊治的最佳靶标。Survivin表达严格受细胞周期调控，只在G2-M期得以表达。,
