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1、1,8.1 凝胶色谱,Size Exclusion/Excluding Chromatography(SEC)Gel Filtration Chromatography(GFC)Gel Penetration Chromatography(GPC),2,8.1.1、凝胶色谱原理 以各种具有网状结构的凝胶颗粒为固定相，根据流动相中所含各组分的分子大小不同而达到物质分离目的的一种色谱技术。,3,凝胶的孔隙大小分布有一定范围（min max）,大、中、小三类分子彼此间较易分开，但每种凝胶分离范围之外的分子，在不改变凝胶种类的情况下是很难分离的。化学结构不同但相对分子质量相近的物质，不可能通过凝胶色谱
2、法达到完全的分离纯化的目的。,若分子 max 全部被排阻在凝胶颗粒之外全排阻两种全排阻的分子即使大小差别很大，也不能有分离效果若分子 min能进入凝胶的全部孔隙。如果两种分子都能全部进入凝胶孔隙，即使它们的大小有差别，也不会有好的分离效果。,4,根据分离的对象是水溶性的化合物还是有机溶剂可溶物，又可分为凝胶过滤色谱（GFC）和凝胶渗透色谱（GPC）。GFC一般用于分离水溶性的大分子，如多糖类化合物。凝胶的代表是葡聚糖系列，洗脱溶剂主要是水。,GPC主要用于分离测定有 机溶剂中可溶的高聚物(聚苯乙烯、聚氯已烯、聚乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯等)的分子量和分子量分布，常用的凝胶为聚苯乙烯凝胶，洗脱溶剂为
3、四氢呋喃等有机溶剂。,5,Vi=g（干凝胶质量）Wr（凝胶单位吸水量）VtVo十Vi十Vg,8.1.2、凝胶色谱理论,Vt：柱床总体积 Vo：柱床内凝胶颗粒外面空隙之间的水相容积 Vi：即凝胶颗粒内部所含水相的容积 Vg：干凝胶颗粒体积,6,Vo、Vi、Vt的测定,Vo的测定 选用分子量约200万的蓝色葡聚糖-2000（或一种不被凝胶滞留的有颜色的大分子物质，便于观察)，测定它的洗脱曲线，洗脱峰峰顶洗出的体积就是该柱的Vo值。Vi的测定 选用一种分子量小于凝胶工作范围下限的化合物，测出其洗脱体积Vei，减去Vo就是该柱的Vi。常用铬酸钾(黄色)或有UV吸收的物质如N-乙酰酪氨酸乙酯来测定Vi。
4、Vt的测定,式中，为常数3.14，D为柱直径，h为凝胶床的高度。,7,分配系数（Kd）,Ve：洗脱体积，自样品加入到组分最大浓度(峰)出现时所流出的容积；,VeVo十KdVi,8,Kd=0，Ve=Vo（分子体积大，完全排阻）0Kd1，Ve在Vo与Vo十Vi之间变化 Kd=1，Ve=Vo十Vi（分子体积小，完全在凝胶颗粒内部扩散）,9,凝胶特性参数,（1）排阻极限（exclusion limit):不能扩散到凝胶网络内部的最小分子的相对分子质量。（2）分级范围（fractionation range):即能为凝胶阻滞并且相互之间可以得到分离的溶质的相对分子质量范围。Sephadex G-50的分
5、级范围为1.5-30kD.,10,（3）溶胀率：溶胀后每克干凝胶所吸收的水分的百分率称为溶胀率，即 交联葡聚糖凝胶（Sephadex）简介 商品名 Sephadex G交联葡聚糖的商品名为Sephndex，不同规格型号的葡聚糖用英文字母G表示，G后面的阿拉伯数为凝胶持水量的10倍，数字越小，交联度越大，网孔越小，持水量越小。Sephadex G50 的溶胀率为500%30%。（4）凝胶粒径：一般为球形，其粒径大小对分离度有重要影响。粒径越小，分离效率越高。,11,8.1.3、凝胶色谱介质,12,凝胶色谱介质,聚合大都仅能得到线性聚合物，小分子量时可溶于水，要想得到具有一定强度的凝胶介质，还需将
6、线性聚合物通过交联反应，形成一定的凝胶网络结构控制交联剂的用量可制成各种型号的凝胶。交联剂越多，孔隙越小。,可分为合成树脂以及多糖类衍生物两类,13,1、合成树脂类,14,1）传统介质聚苯乙烯与二乙烯苯交联共聚物,交联度越高，凝胶溶胀时体积变化越小聚苯乙烯树脂的疏水特性常使蛋白质变性多用于凝胶渗透色谱（GPC）中,商品为Styrogel,15,2）聚丙烯酰胺凝胶商品名为生物凝胶-P（Bio-Gel P）。,16,17,聚丙烯酰胺凝胶,聚丙烯酰胺凝胶的部分结构,(Bio-Gel P),18,聚丙烯酰胺凝胶,19,20,2、多糖类,1）葡聚糖系2）琼脂糖系,21,葡聚糖凝胶部分结构,(Sephad
7、ex),1）葡聚糖(Sephadex)系凝胶,商品名为Sephadex G类,22,蔗糖在葡聚糖酶的作用下发酵，产生葡聚糖（glucosan），相对分子质量很高。但经酸水解的作用，可以分解为较小的分子，平均相对分子质量为 410420104。结构上大部是以-1，6-糖苷键聚合，有少量的分支。这个聚合体（Dextran）若用环氧氯丙烷处理，就发生所谓的交联作用，形成一个网状的分子，这叫作交联葡聚糖（sephadex），结构如下式：,23,厂家：Amersham Pharmacia Biotech安玛西亚公司,“G-X”反映凝胶的交联程度及持水量。G-25为每克干凝胶膨胀时吸水2.5ml交联葡聚糖
8、凝胶的种类有G-10、15、25、50、75、100、150和200。通常G50的常用于样品的脱盐,24,2）琼脂糖(Sepharose)系凝胶,25,Fig1.Gel structure of agarose,Fig2.Structure of the repeating unit of agarose（琼脂糖）,26,琼脂糖凝胶特点：,1、没有共价键的交联。2、孔径依赖于琼脂糖的浓度。3、琼脂糖凝胶的化学稳定性较差。4、非特异性吸附力低。5、分离范围大。6、颗粒强度差。,27,瑞典的商品名称为Sepharose，有3种型号，即Sepharose 2B，4B和6B（同中国相同）。阿拉伯数字表
9、示凝胶中干胶的百分含量。,美国的为BioGA，有6个型号，即Bio-G 0.5M，1.5M，5M，15M，50M和150M。阿拉伯数字乘以106表示排阻限度。,。,琼脂糖的商品名称有:Sepharose(瑞典)Bio-gel A(美国)Segavac(英国)Gelarose(丹麦),28,英国的称为Sagavac，又分为Sagavac 2F，4F，6F，8F，10F和2C，4C，6C，8C，10C。前面的阿拉伯数字表示凝胶中干胶的百分数，F代表粉末状，C代表颗粒状。,丹麦的称为Gelarose，有5种类型，即2，4，6%，8和10。,29,Table 6.Properties of Sepha
10、rose,厂家：Amersham Pharmacia Biotech安玛西亚公司,应用最广，机械强度较低，不能高压灭菌,30,架桥琼脂糖凝胶（Sepharose CL）,架桥琼脂糖凝胶为琼脂线性分子经1，3-二溴丙醇交联的凝胶。它的凝胶孔径均匀，机械强度明显加大。对热和化学物质的稳定性大大增加,在pH3-14范围内稳定。,31,Superdex(高交联葡聚糖),Fig.15.Structure of Superdex.Dextran chains are covalently linked to a highly cross-linked agarose matrix.,厂家：Amersham
11、 Pharmacia Biotech安玛西亚公司,32,Superose(高交联琼脂糖),Superose is composed of highly cross-linked（高度交联）porous rigid agarose beads.,厂家：Amersham Pharmacia Biotech安玛西亚公司,33,33,常用的商品化凝胶介质,34,排阻范围的选择,35,四、凝胶色谱操作,36,凝胶使用前要首先进行处理。估计用量 根据选择的层析柱估算出凝胶的用量。由于市售的是无水干胶，所以要计算干胶用量：干胶用量(g)柱床体积(ml)/凝胶的床体积(ml/g)考虑到损失，故一般凝胶用量再增
12、加1020(质量分数)。,37,1、凝胶的处理,将称好的干粉倾入过量的洗脱液中，室温下充分溶胀。注意不要过分搅拌，以防颗粒破碎。为了缩短溶胀时间，可在沸水浴中加热溶胀3-5小时，这样还可以杀死细菌和霉菌，并排除凝胶内气泡。为了保证流速稳定，获得较好的实验结果，使用前用倾泻法倾去不易沉下的较细颗粒，使凝胶颗粒大小一致。,38,2.柱层析系统的安装,39,3、凝胶装柱,将层析柱垂直装载支架上，将下端输液管夹紧；向柱中加入约1/3体积的0.9NaCl溶液；将一细玻棒伸入柱内，靠近管内壁，顺着玻棒缓慢的向管内加入混匀的凝胶溶液；凝胶加至层析柱顶端约3cm时，打开柱下端输液开关，使流速控制在0.25-0
13、.5ml/cm2min。连续缓慢地加凝胶直到稳定在离管口约5cm处。,40,凝胶床的检查和维护,观察有无凝胶分层、沟流和气泡等现象。有色物质溶液过柱，观察柱床有无沟流，色带是否平整。检查物质为蓝色葡聚糖-2000、或者红色葡聚糖、细胞色素C、血红蛋白等物质配成2mg/ml的溶液过柱。,新柱装好后，要用洗脱缓冲液平衡，一般用35倍体积的缓冲液在恒压下流过柱床。,41,4、样品上柱及洗脱,加样量的控制分析：1-2ml/100ml床体积，制备：10-30ml/100ml床体积 洗脱液的选择：洗脱液应与浸泡凝胶时所用的溶液一致，否则由于更换溶剂，凝胶体积会发生变化而影响分离效果。,42,凝胶粒度的大小
14、对分离效果的影响细粒凝胶柱流速低，但洗脱峰窄，分辨率高，多用于精制分离或分析等。粗粒凝胶柱流速高，但洗脱峰平坦，分辨率低，多用于粗制分离，脱盐等。,凝胶粒度与洗脱效果的关系图,同一流速下不同粒度的Sephadex G-25柱,43,将分子量极为悬殊的两类物质分开，如蛋白质与盐类，称作类分离或组分离。将分子量相差不大的大分子物质加以分离，如分离血清球蛋白与白蛋白，这叫做分级分离。,44,a类分离,（1）使大分子的分配系数Kd=0；（2）小分子的Kd=1。选用Sephadex G-25凝胶，分离范围1 0005 000。,45,b分级分离,（1）使各种物质的Kd值尽可能相差大。（2）不使分子量分布
15、在凝胶分离范围的一侧。（3）分子量大于渗入限的3倍，并小于排阻限的1/3。如用Sephadex G-200分离血清蛋白质的效果要比Sephadex G-150为好。,46,层析柱长度与直径的比值称作“柱比”。对于类分离，柱床体积一般为样品溶液体积的5倍，柱比5:1到10:1即可。对于分级分离，则要求柱床体积大于样品体积25倍以上，甚至多达100倍。柱比在25至100之间。,47,加样量对分辨率的影响,I.加样量少时，A、B二种物质充全分开。II.加样量适当时，A、B 二种物质刚刚分开。III.加样量太大时，A、B二种物质只能部分分开。,48,流速对蛋白质分辨率的影响,49,凝胶层析加样操作示意
16、图,1、平衡好的层析柱。2、沿管壁将样品溶液小心加到凝胶床面上，应避免将床面凝胶冲起。3-4、打开下口夹子，使样品溶液流入柱内，同时收集流出液，5-7、当样品溶液流至与胶面相切时，夹紧下口夹子。按加样操作，用1mL洗脱液冲洗管壁2次。8-9、最后加入34mL洗脱液于凝胶上。10、连接柱层析系统，自动收集记录。,50,凝胶柱层析实物连接,51,51,5 凝胶柱的再生,反冲。重新装柱。,52,6、凝胶柱的保养和凝胶的保存,凝胶的保存可采用以下两种方法：（1）经常使用的凝胶以湿态保存为宜，加入适当的抑菌剂。常用的抑菌剂:0.02叠氮钠(2)较长时期不使用的凝胶可采用干燥保存法。依次用70、90和95
17、乙醇逐步脱水，使凝胶皱缩，最后用乙醚洗涤干燥或在60-80下烘干。,53,五、凝胶色谱的应用,54,1、分离纯化 GFC可用于相对分子量从几百到百万的物质的分离纯化，是蛋白质、肽、脂质、抗生素、糖类、核酸以及病毒（50-400nm）的分离与分析中频繁使用的液相层析法。2、脱盐 盐析沉淀中得到的高盐浓度的蛋白质溶液用凝胶法脱盐后，可用于其它层析过程。,55,3、相对分子量的测定 通过分子量与分配系数的线性关系进行测量，对球形分子较准确。,Ve=K1-K2lgM K1、K2为常数,56,4、浓缩,Sephadex G-25（粗）,待浓缩液，充分混合，放置10min,离心或过滤,上清液或滤液被浓缩,
18、8.2 离子交换色谱法,离子交换色谱法(ion exchange chromatography，IEC)是利用 离子交换树脂为固定相，以适宜的溶剂作为移动相，使溶质按它们的离子交换亲和力的不同而得到分离的方法。生化分离中75%的工艺采用此法。,57,一、基本原理,离子交换色谱是指带电物质因电荷力作用而在固定相与流动相之间分配得以相互分离的技术。蛋白质等两性电解质，当 pH pI时，蛋白质带净负电荷。由于各种蛋白质等生物大分子的等电点不同，可以通过改变溶液的pH和离子强度来影响它们与离子交换树脂的吸附作用，从而将它们相互分离开来。,58,离子交换的基本过程：,(1)初始稳定状态(2)离子交换过程
19、(3)洗脱过程(4)介质的再生过程,59,离子交换树脂是一种不溶于酸、碱和有机溶剂的固体高分子聚合物。它具有网状立体结构并含有活性基团，能与溶剂中其他带电粒子进行离子交换或吸着。,二、离子交换树脂,1.定义,60,交换树脂表面,61,二、离子交换树脂的分类,1.按树脂骨架的主要成分,(1)聚苯乙烯型树脂 由苯乙烯(母体)和二乙烯苯(交联剂)的共聚物作为骨架，再引入活性基团,(2)丙烯酸树脂 由丙烯酸酯类和甲基丙烯酸酯类及其它烯属单体共聚制成的树脂。,(3)多乙烯多胺-环氧氯苯烷树脂 由多乙烯胺与环氧氯苯烷的共聚物作为骨架。,(4)酚-醛型树脂 主要由水杨酸、苯酚和甲醛缩聚而成，水杨酸和甲醛形成
20、线状结构，苯酚作为交联剂。,62,其结构由三部分组成：1.不溶性的三维空间网状结构构成的树脂骨架，使树脂具有化学稳定性和机械强度；2.是与骨架相联的功能基团；3.是与功能基团带相反电荷的可移动的离子，称为活性离子，它在树脂骨架中的进进出出，就发生离子交换现象。,离子交换树脂的结构,63,离子交换树脂的结构-网络骨架,苯乙烯系、丙烯酸系、酚醛系、环氧系,64,离子交换树脂结构,骨架：接有功能基团，本身是惰性,功能基团：连接在骨架 上，可与相反离子结合,待交换分子：在吸附阶段可与活性离子交换，与骨架上的功能基团结合,活性离子：与功能基团所带电荷相反的可移动的离子,离子交换法概述,65,1)阳离子交
21、换树脂 活性基团为酸性，对阳离子具有交换能力。,3.按活性基团分类,(1)强酸性阳离子交换树脂,(2)弱酸性阳离子交换树脂,67,阳离子交换树脂,交换前,交换达到平衡后,68,一般以磺酸基一SO3H作为活性基团，交换反应以磺酸型树脂与氯化钠的作用为例，可表示如下：由于是强酸性基团，其电离程度不随外界溶液的pH而变化，所以使用时的pH一般没有限制。此外，以磷酸基一PO(OH)2和次磷酸基一PHO(OH)作为活性基团的树脂具有中等强度的酸性。,强酸性阳离子交换树脂,69,苯乙烯系强酸性阳离子交换树脂的结构,CH2CHCH2CHCH2CHCH2CH,SO3-H+,SO3-H+,SO3-H+,CH2C
22、HCH2CHCH2CHCH2CH,SO3-H+,CH2CHCH2,SO3-H+,HC=CH2 HC=CH2,m,+n,HC=CH2,70,弱酸性阳树脂,功能团可以为羧基-COOH，-OH(酚羟基）这类树脂的电离程度小，其交换性能和溶液的pH有很大关系。在酸性溶液中，这类树脂几乎不能发生交换反应，交换能力随溶液的pH增加而提高。,对于羧基树脂，应该在pH 7的溶液中操作，而对于酚羟基树脂，溶液的pH应9。,71,2)阴离子交换树脂 活性基团为碱性，对阴离子具有交换能力。,3.按活性基团分类,(1)强碱性阴离子交换树脂,(2)弱碱性阴离子交换树脂,72,阴离子交换树脂,交换前,交换达到平衡后,73
23、,强碱性阴树脂,I型的碱性比II型强，但再生较困难，II型树脂的稳定性较差。和强酸性树脂一样，强碱性树脂使用的pH范围没有限制,有两种强碱性树脂：功能基团为三甲胺基称为强碱型二甲基-羟基-乙基胺为强碱II型,水溶液中 R NOH(Cl),-,74,弱碱性阴树脂,和弱酸性树脂一样，其交换能力随pH变化而变化，pH越低，交换能力越大。,功能团为,水溶液中：RNH3+OH；RNH2+OH；RNH+OH,75,四类树脂的特性比较,虽然强型离子交换树脂可在宽PH范围操作，但吸附后难于解吸，因此在实用中，人们更多考虑用弱型离子交换树脂。,四类树脂的特性比较,对阴离子交换树脂：pH pI，蛋白质带负电，而且
24、pH越高，负电荷越多，越易吸附。虽然高pH吸附容量大，但解吸困难。实际选择的pH是可吸附的最低pH。对阳离子交换树脂：最佳pH是可吸附的最高pH。,盐的稳定性 弱酸、弱碱性树脂成的盐（盐型）不稳定，易水解。,弱酸树脂：RCOOH+NaOH RCOONa+H2O 水解：RCOONa+H2O RCOOH+NaOH*洗到 pH9 10,弱碱树脂：RNH3OH+HCl RNH3 Cl+H2O 水解：RNH3 Cl+H2O RNH3OH+HCl*洗到 pH4 5,NaOH,H2O,RCOONa,RCOOH,NaOH,四类树脂的特性比较,80,81,离子交换吸附应在很低的离子强度下进行（离子浓度高会解吸所
25、吸附的溶质），所以离子交换一般不在盐析后进行。缓冲溶液中离子强度一般在10-50mmol/L,具体浓度有实验确定。,强酸树脂再生时耗用过量的酸；强碱树脂再生时耗用过量的碱。强酸树脂：RSO3Na+HCl RSO3H+NaCl 再生难弱酸树脂：RCOONa+HCl RCOOH+NaCl 易强碱树脂：RN+Cl+NaOH RN+OH+NaCl 难弱碱树脂：R-NH3+Cl+NaOH R-NH3OH+NaCl 易,再生的难易程度 树脂的操作步骤（str）：交换（吸着）3RCOONa+str3+(RCOO)3str+3Na+洗脱（解吸）(RCOO)3str+3HCl 3RCOOH+str3+3Cl 再
26、生 RCOOH+NaOH RCOONa+H2O，水洗至pH 9,四类树脂的特性比较,82,四类树脂的特性比较,83,1977年，我国原石油化工部颁布了离子交换树脂的命名法，规定离子交换树脂的型号由三位阿拉伯数字组成：第一位数字代表产品的分类；第二位数字代表骨架；第三位数字微顺序号。分类代号和骨架代号都分成7种，分别以06表示。,二、离子交换树脂的命名,84,85,大孔树脂在型号前加“D”，凝胶型树脂的交联度值可在型号后用“”号连接阿拉伯数字表示。如D0117，表示大孔强酸性丙烯酸系阳离子交换树脂，其交联度为7,1.交联度交联度表示离子交换树脂中交联剂的含量，例如：聚苯乙烯型树脂是由二乙烯苯将链
27、状分子联成立体网状结构的，二乙烯苯称为交联剂。树脂中交联剂的质量分数称为交联度。聚苯乙烯型交换树脂含有8%的二乙烯苯，则此树脂的交联度为8%。一般树脂的交联度为8%-12%。,三、离子交换树脂的理化性能,86,2.交换容量：交换容量是指每克干燥离子交换树脂或每毫升完全溶胀的离子交换树脂所能吸收的一价离子的毫摩尔数，以mmol/g表示，是表征树脂离子交换能力的主要参数。交换容量的大小，取决于网状结构中活性基团的数目，含有活性基团越多，交换容量也越大。但交换容量太大，活性基团太多，树脂不稳定。,87,粒度是树脂颗粒在溶涨后的大小，色谱用50100目树脂，一般提取纯化用2060目(0.250.84m
28、m)树脂则可。粒度小的树脂因表面大，效率高；粒度过小，堆积密度大，容易产生阻塞；粒度过大又会导致强度下降、装填量小、内扩散时间延长，不利于有机大分子的交换。所以，粒度大小应根据具体需要选择。一般树脂为球形，这样可减少流体阻力。,3.粒度和形状,88,强酸（或强碱）性离子交换剂的滴定曲线开始是水平的，到某一点突然升高（或降低），表明在该点交换剂上的离子交换基团已被碱（或酸）完全饱和；弱酸（或弱碱）性离子交换剂的滴定曲线逐渐上升（或下降），无水平部分。利用滴定曲线的转折点，可估算离子交换剂的交换容量，而由转折点的数目，可推算不同离子交换基团的数目。,4.滴定曲线,89,5.稳定性 树脂应有较好的化
29、学稳定性，不容易分解破坏，不与酸、碱起作用。一般地说，阳离子交换树脂比阴离子交换树脂稳定性好。交联度小的稳定性好。树脂一般可反复使用上千次，稳定性仅成为此要的考虑因素。但含苯酚的硫酸型树脂及胺型树脂不易与强强碱长时间接触。,90,6膨胀性(膨胀度)干树脂浸在水溶液或有机溶剂中时，活性离子因热运动可在树脂空隙的一定距离内运动，同时由于存在着渗透压使外部水分渗入内部促使树脂空隙扩大而体积膨胀。测定膨胀前后树脂的体积比，可得出膨胀度。在设计离子交换罐时，树脂的装填系数应以工艺过程中膨胀度最大时的树脂体积为上限参数，以免装量过度或设备利用率降低。,91,四、离子交换树脂的选择依据离子交换交换色谱常用较
30、细的树脂(50-100目)。但一般树脂的粒度较大，因此需要将树脂粉碎、过筛后使用，过筛分干法和湿法两种。干法较简单，但实际使用时粒度仍不均匀。利用水力浮选法，将树脂分级比较方便。改变水的流速就可得到不同粒度的树脂。,92,四、离子交换树脂的选择依据,树脂的骨架结构。目的分子的大小介质上带电功能基团功能基团的强弱,93,五、流动相的选择依据,离子交换色谱的流动相必须是有一定的离子强度，并且对pH有一定缓冲能力的溶液。使用缓冲液可稳定流动相的pH，使之在层析过程中不致发生明显变化，同时还可以稳定目的分子上的电荷量，保证层析结果的重现性。要使目的分子带有电荷并以适当的强度结合到离子交换介质上，需要选
31、择一合适的吸附pH。对于阴离子交换介质，吸附pH至少应高于目的分子等电点一个pH单位。,94,吸附阶段应选择允许目的分子与介质结构达到最高的离子强度。而洗脱时要选择可使目的分子与介质解吸的最低离子强度。这就定出了洗脱液离子强度的梯度起止范围。在介质再生之前往往还需用第三种离子强度更高的缓冲液流洗柱床以彻底消除可能残留的牢固吸附杂质。在大部分情况下，吸附阶段溶液盐浓度至少应在10mmol/L以上。,五、流动相的选择依据,95,六、操作方法,1.离子交换剂的处理2.装柱及上样 装柱主要是防止出现气泡和分层，装填要均匀。防止产生气泡和分层的方法是装柱时柱内先保持一定高度的起始洗脱液(一般为柱高的1/
32、3)，加入树脂时使树脂借水的浮力慢慢自然沉降。装柱完毕后，用水或缓冲液平衡到所需的条件，如特定的pH、离子强度等。,96,上 样,加压法是采用打气入柱的方式进行加压，可用一个装有样品的分液漏斗与柱用橡皮塞连接，分液漏斗上端串有压力剂并经缓冲瓶与打气管相连，当达到所需压力时就将打气管夹紧。减压法是在柱的排出口增设抽气装置，工业上多采用此法。,97,3.洗 脱,分离不同的物质选用不同的洗脱剂。原则是用一种更活泼的离子把交换在树脂上的物质再交换出来。常用的洗脱剂为酸类、碱类或盐类溶液，改变整个系统的酸碱度和离子强度，以使交换物质的交换性能发生变化，己交换上的物质就逐渐被洗脱下来。为了提高分辨率，常采用梯度洗脱法。,98,
