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1、分光光度计,2016年2月18日,目录,简介,A,722分光光度计,B,仪器故障及解决,C,拓展,D,简介,分光光度法是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸收度，对该物质进行定性和定量分析。分光光度计的基本原理是溶液中的物质在光的照射激发下，产生了对光吸收的效应，物质对光的吸收是具有选择性的，各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱，因此当某单色光通过溶液时，其能量就会被吸收而减弱，光能量减弱的程度和物质的浓度有一定的比例关系，也即符合于比色原理-比耳定律。,分类-按波长,1、可见光分光光度计：测定波长范围为400760nm的可见光区；2、紫外分光光度计：测定波长范围为200400n
2、m的紫外光区；3、红外分光光度计：测定波长范围为大于760nm的红外光区；4、荧光分光光度计：用于扫描液相荧光标记物所发出的荧光光谱；5、原子吸收分光光度计：光源发出被测的特征光谱辐射，被经过原子化器后的样品蒸气中的待测元素基态原子所吸收，通过测定特征辐射被吸收的大小，来求出被测元素的含量。,722分光光度计,简介：该仪器适用于对可见光谱区域内物质的含量进行定量分析，可广泛应用于工厂、学校、冶金、农业、食品、生化、环保、石油化工、医疗卫生等单位的基础实验室。用途：在近紫外和可见光谱区域内对样品物质作定性和定量的分析，是理化实验室常用分析仪器之一。,本页仅供参考，具体需详细查阅相应仪器说明书,工
3、作环境,1、该仪器应安放在干燥的房间内，使用温度为535。2、该仪器应放置在坚固平稳的工作台上，且避免强烈震动或持续震动。3、室内照明不宜太强，且避免日光直射。4、电风扇不宜直接吹向仪器，以免影响仪器的正常使用。5、尽量远离高强度的磁场、电场及发生高频波的电器设备。6、供给仪器的电源为220V10%，49.5-50Hz，并须装有良好的接地线。宜使用100W以上的稳压器，以加强仪器的抗干扰性能。7、避免在有硫化氢、亚硫酸氟等腐蚀性气体的场所使用。,本页仅供参考，具体需详细查阅相应仪器说明书,主要技术性能及规格：,1、光学系统：单光束、衍射光栅。2、波长范围：330800nm.。3、光源：钨卤素灯
4、12V30W。4、接收元件：端窗式G1030光电管。5、波长精度：2nm。6、波长重现性：0.5nm。7、光谱带宽：6nm。8、杂散光：1%（T）（在360nm处）。,9、透过率测量范围：0-100%（T）。10、吸光度测量范围：0-1.999（A）。11、浓度直读范围：0-2000。12、光度精度：a 透过率线性精度0.5%（T）。b 吸光度精度0.004A(在0.5A处)。13、透过率重现性：0.5%（T）。,本页仅供参考，具体需详细查阅相应仪器说明书,722型分光光度计结构方框图,本页仅供参考，具体需详细查阅相应仪器说明书,分光光度计的主要部件,1、光源：发出所需波长范围内的连续光谱，有
5、足够的光强度。a 可见光区：钨灯，碘钨灯(3202500nm)b 紫外区：氢灯，氘灯(180375nm)2、单色器：将光源发出的连续光谱分解为单色光的装置。3、棱镜:玻璃3503200nm,石英1854000nm。4、光栅:波长范围宽,色散均匀,分辨性能好,使用方便。,本页仅供参考，具体需详细查阅相应仪器说明书,5、吸收池：(比色皿)用于盛待测及参比溶液。a 可见光区：光学玻璃池 b 紫外区：石英池6、检测器：利用光电效应，将光能转换成电流信号。光电池，光电管，光电倍增管7、指示器：a 低档仪器：刻度显示 b 中高档仪器：数字显示，自动扫描记录,本页仅供参考，具体需详细查阅相应仪器说明书,72
6、2型分光光度计的使用操作方法,1、预热仪器 打开电源开关，使仪器预热30分钟（为了防止光电管疲劳，不要连续光照，预热仪器时和不测定时应将试样室盖打开，使光路切断）。2、选定波长 转动波长手轮，调至所需要的单色波长。3、固定灵敏度档 在能使空白溶液很好地调到“100%”的情况下，尽可能采用灵敏度较低的档，使用时，首先调到“1”挡，灵敏度不够时再逐渐升高。但换挡改变灵敏度后，须重新校正“0%”和“100%”。选好的灵敏度，实验过程中不要再变动。4、调节T=0%轻轻旋动“0%”旋钮，使数字显示为“00.0”，（此时试样室是打开的）。,本页仅供参考，具体需详细查阅相应仪器说明书,722型分光光度计的使
7、用操作方法,5、调节T=100%将盛蒸馏水（或空白溶液，或纯溶剂）的比色皿放入比色皿座架中的第一格内，并对准光路，把试样室盖子轻轻盖上，调节透过率“100%”旋钮，使数字显示正好为“100.0”。6、吸光度的测定 将空白液及测定液分别倒入比色杯3/4处，用擦镜纸擦清外壁，放入样品室内，将选择开关置于“A”，盖上试样室盖子，将空白液置于光路中，调节吸光度调节旋钮，使数字显示为“0.000”。将盛有待测溶液的比色皿放入比色皿座架中的其它格内，盖上试样室盖，轻轻拉动试样架拉手，使待测溶液进入光路，此时数字显示值即为该待测溶液的吸光度值。读数后，打开试样室盖，切断光路。,本页仅供参考，具体需详细查阅相
8、应仪器说明书,722型分光光度计的使用操作方法,重复上述测定操作1-2次，读取相应的吸光度值，取平均值（吸光度值尽可能在0.2-0.8之间）。7、浓度的测定 选择开关由“A”旋置“C”，将已标定浓度的样品放入光路，调节浓度旋钮，使得数字显示为标定值，将被测样品放入光路，此时数字显示值即为该待测溶液的浓度值。8、关机 比色完毕，切断电源，将比色皿取出洗净，并将比色皿座架用用软布或软纸擦净。,本页仅供参考，具体需详细查阅相应仪器说明书,注意事项,1、该仪器应放在干燥的房间内，使用时放置在坚固平稳的工作台上，室内照明不宜太强。热天时不能用电扇直接向仪器吹风，防止灯泡灯丝发亮不稳定。2、为了防止光电管
9、疲劳，不测定时必须将试样室盖打开，使光路切断，以延长光电管的使用寿命。3、取拿比色皿时，手指只能捏住比色皿的毛玻璃面，而不能碰比色皿的光学表面。4、比色皿不能用碱溶液或氧化性强的洗涤液洗涤，也不能用毛刷清洗。比色皿外壁附着的水或溶液应用擦镜纸或细而软的吸水纸吸干，不要擦拭，以免损伤它的光学表面。,注意事项,5、使用本仪器前，使用者应该首先了解本仪器的结构和工作原理，以及各个操纵旋钮之功能。在未按通电源之前，应该对仪器的安全性能进行检查，电源接线应牢固，通电也要良好，各个调节旋钮的起始位置应该正确，然后再按通电源开关。6、长期不用时，需用将仪器使用防护罩罩住。,维护方法,1、若大幅度改变测试波长
10、，需稍等片刻，等灯热平衡后，重新校正“0”和“100%”点，然后再测量。2、比色杯的配套性问题。比色杯必须配套使用，否则将使测试结果失去意义。在进行每次测试前均应进行比较（具体方法如下；分别向被测的两只杯子里注入同样的溶液，把仪器置于某一波长处（石英比色杯：220nm、700nm装蒸馏水，玻璃比色杯：700nm处装蒸馏水），将某一个池的透射比值调至100%，测量其他各池的透射比值，记录其示值之差及通光方向，如透射比之差在0.5%的范围内则可以配套使用，若超出此范围应考虑其对测试结果的影响）。,本页仅供参考，具体需详细查阅相应仪器说明书,维护方法,3、比色皿使用完毕后，请立即用蒸馏水冲洗干净，并
11、用擦镜纸或干净柔软的纱布将水迹擦去，以防止表面光洁度被破坏，影响比色皿的透光率。有色物质污染，可用3mol/L盐酸和等体积乙醇的混合液洗涤。4、操作人员不应轻易动灯泡及反光镜灯，以免影响光效率。5、在不使用时不要开光源灯，如灯泡发黑（钨灯）、亮度明显减弱或不稳定，应及时更换新灯。更换后要调节好灯丝位置。不要用手直接接触窗口或灯泡，避免油污沾附，若不小心接触过，要用无水乙醇擦拭。6、放大器灵敏度换挡后，必须重新调零。,本页仅供参考，具体需详细查阅相应仪器说明书,典型故障及其排除方法,1、仪器不能调零。可能原因：a 光门不能完全关闭。解决方法：修复光门部件，使其完全关闭。b 透过率“100%”旋到
12、底了。解决方法：重新调整“100%”旋钮。c 仪器严重受潮。解决方法：可打开光电管暗盒，用电吹风吹上一会儿使其干燥，并更换干燥剂。d 电路故障。解决方法：送修理部门，检修电路。,本页仅供参考，具体需详细查阅相应仪器说明书,典型故障及其排除方法,2、仪器不能调“100%”。可能原因：a 光能量不够。解决方法：增加灵敏度倍率档位，或更换光源灯(尽管灯还亮)。b 比色皿架未落位。解决方法：调整比色皿架使其落位。c 光电转换部分老化。解决方法：更换部件。d 电路故障。解决方法：调修电路。,本页仅供参考，具体需详细查阅相应仪器说明书,典型故障及其排除方法,3、测量过程中，“100%”点经常变动。可能原因
13、：a 比色皿在比色皿架中放置的位置不一致，或其表面有液滴。解决方法：用擦镜纸擦干净比色皿表面，然后将其安放在比色槽的左边，上面用定位夹定位。b 电路故障(电压、光电接收、放大电路)。解决方法：送修。,本页仅供参考，具体需详细查阅相应仪器说明书,典型故障及其排除方法,4、数显不稳。可能原因：a 预热时间不够。解决方法：延长预热时间至30分钟左右(部分仪器由于老化等原因，长时间处于工作状态时，也会工作不稳)。b 光电管内的干燥剂失效，使微电流放大器受潮。解决方法：烘烤电路，并更换或烘烤干燥剂。c 环境振动过大、光源附近空气流速大、外界强光照射等。解决方法：改善工作环境。d 光电管、电路等其它原因。
14、解决方法：送修。,本页仅供参考，具体需详细查阅相应仪器说明书,拓展-工作原理,分光光度计采用一个可以产生多个波长的光源，通过系列分光装置，从而产生特定波长的光源，光线透过测试的样品后，部分光线被吸收，计算样品的吸光值，从而转化成样品的浓度。样品的吸光值与样品的浓度成正比。单色光辐射穿过被测物质溶液时，被该物质吸收的量与该物质的浓度和液层的厚度（光路长度）成正比，其关系如下式：A=-lg(I/I。)=-lgT=kLc式中：A为吸光度；I。为入射的单色光强度；I为透射的单色光强度；T为物质的透射率；k为摩尔吸收系数；L为被分析物质的光程，即比色皿的边长,拓展-工作原理,c为物质的浓度物质对光的选择
15、性吸收波长，以及相应的吸收系数是该物质的物理常数。当已知某纯物质在一定条件下的吸收系数后可用同样条件将该供试品配成溶液，测定其吸收度，即可由上式计算出供试品中该物质的含量。在可见光区，除某些物质对光有吸收外，很多物质本身并没有吸收但可在一定条件下加入显色试剂或经过处理使其显色后再测定，故又称比色分析。由于显色时影响呈色深浅的因素较多，且常使用单色光纯度较差的仪器，故测定时应用标准品或对照品同时操作。,拓展-基础概念,Lambert-Beer定律是吸收光度法的基本定律，表示物质对某一单色光吸收的强弱与吸光物质浓度和厚度间的关系。式中：，入射光及通过样品后的透射光强度A吸光度(absorbance
16、)旧称光密度(optical density)C样品浓度d光程，即盛放溶液的液槽的透光厚度,拓展-基础概念,k光被吸收的比例系数T透射比，即透射光强度与入射光强度之比当浓度采用摩尔浓度时，k为摩尔吸收系数。它与吸收物质的性质及入射光的波长有关。当一束平行单色光垂直通过某一均匀非散射的吸光物质时,其吸光度A与吸光物质的浓度c及吸收层厚度d成正比.,拓展-比色皿基础知识,市场面上一般使用的石英比色皿均为石英粉烧接的，可用专用超声波清洗，比色皿清洗时毛面朝下。清洁方法1、比如测定溶液是酸，如果不干净，就用弱碱溶液洗，要是测定溶液是碱，如果不干净，就用弱酸溶液洗，要是测定溶液是有机物质，如果不干净，就
17、用有机溶剂，比如酒精等溶液洗2、选择比色皿洗涤液的原则是去污效果好，不损坏比色皿，同时又不影响测定3、分析常用的铬酸洗液不宜用于 洗涤比色皿，这是因为带水的比色皿在该洗液中有时会局部发热，致使比色皿胶接面裂开而损,拓展-比色皿基础知识,坏。同时经洗液洗涤后的比色皿还很可能残存微量铬，其在紫外区有吸收，因此会影响铬及其他有关元素的测定。一般主张使用过氧化氢和 硝酸（5：1）的 混合 溶液 泡 洗，然后用水冲洗干净4、对一般方法难以洗净的比色皿，还可以采取以下两种方法A、先将比色皿侵入含有少量 阴离子表面活性剂的碳酸钠（20克/升）溶液泡洗，经水冲洗后，再于过氧化氢和硝酸（5：1）混合溶液中侵泡半
18、小时B、在 通风橱中用盐酸、水和甲醇（1：3：4）混合溶液泡洗，一般不超过10分钟C、比色皿不可用碱液洗涤，也不能用硬布、毛刷刷洗,拓展-参比溶液选择,在进行光度测量时，利用参比溶液来调节仪器的零点，可以消除由于吸收池壁及溶剂对入射光的反射和吸收带来的误差，并扣除干扰的影响。参比溶液可根据下列情况来选择。a 当试剂及显色剂均无色时，可用蒸馏水作参比溶液。b 显色剂为无色，而被测试液中存在其它有色离子，可用不加显色剂的被测试液作为参比溶液。c 显色剂有颜色，可选择不加试样溶液的试剂空白作参比溶液。d 显色剂和试液均有颜色，可将一份试液加入适当掩蔽剂，将被测组分掩蔽起来，使之不再与显色剂作用，而显
19、色剂及其它试剂均按试液测定方法加入，以此作为参比溶液，这样就可以消除显色剂和一些共存组分的干扰。e 改变加入试剂的顺序，使被测组分不发生显色反应，可以把此溶液作为参比溶液消除干扰。,拓展-紫外可见与可见光分光光度计的区别,紫外可见分光光度计与可见分光光度计的区别是测定波长范围不同，紫外一般用氢灯，测定波长范围180350nm,可见一般用钨灯，测定波长范围3201000nm。所谓紫外可见分光光度计也就是说这个仪器可以更换光源，能够测定吸收峰在紫外和可见光部分的化合物。发现吸光度超过2，便不再显示，是正常现象。吸光度是透光率的负对数，吸光度超过2就是说透光率小于1，低于仪器的检出限，就不再显示了。
20、,拓展-721、722型分光光度计区别,1、光源：721型分光光计是钨灯；722型分光光度计是碘钨灯。2、单色器：721型分光光计是棱镜；722型分光光度计是光栅。3、检测器：721型分光光计是光电管；722型分光光度计是光电倍增管。4、显示器：721型分光光计是表头指针读数；722型分光光度计是光电直读数据。5、其他：721经典老型号，便宜耐用；722是721数显升级（723自动化程度更高，可以连电脑，波长/时间扫描功能，有应用软件）。,拓展-选购,1、波长检测范围，波长选择方式（手动查找、自动查找或扫描）2、光束：光束类型分为单光束型，双光束型或准双光束型（单光束一般适于在给定波长处测量吸
21、光度，不能作全波段光谱扫描，并且要求光源和检测器具有很高的稳定性；双光束可以自动记录，快速全波段扫描。可消除光源不稳定、检测器灵敏度变化等因素的影响，特别适合于结构分析；假双光束也就是比例双光束，优点是可以监测光源变化带来的误差，它的原理是由同一单色器发出的光被分成两束，一束直接到达检测器，另一束通过样品后到达另一个检测器。但是这种方式并不能消除参比造成的影响。,拓展-选购,3、光源:可见光区主要用钨灯，卤钨(3202500nm)；紫外区主要用氢灯，氘灯(180375nm)；氙灯在紫外和可见光区均可用作光源。4、样品支架：简单的样品支架为推拉式四联池架，一次只能测量一个样品，参比和样品分两次测
22、量；高档型的样品池支架为两个固定式，分别是样品通道和参比通道，可以同时测量参比和样品的吸光值。5、狭缝：简易型的狭缝一般是固定宽度模式，狭缝宽度多数为2nm,也有1.5nm的；高档型的仪器狭缝均为连续可调型，可以适应高分辨率的需要。,拓展-选购,6、光学性能指标：光学性能的高低直接影响到测量的准确性，其中光栅的技术指标尤为重要。高档型仪器的光栅质量较好，一般最佳的光栅为凹面型，并且大尺寸的凹面光栅对应的刻槽数越多，因此在分辨率和杂散光方面指标要优于简易型仪器。7、检测器：检测器是利用光电效应，将透过溶液的光信号转换为电信号，并将电信号放大的装置。简易型仪器一般采用光敏二极管；中档型仪器采用硅光
23、二极管；高档型仪器的检测器使用高灵敏度的光电倍增管和红外检测器。8、显示器：简易型仪器多为机械表头或数码管显示器，没有数据处理器；高档型仪器的显示器为液晶式或连接电脑，数据处理可,拓展-选购,由仪器自身具有的或外接计算机处理。9、测量模式：简易型仪器多为定点(固定波长)吸光度或透过率测量方式，基本不能进行波长扫描测量；高档型仪器的测量模式较多，可以显示透过率、吸光度、浓度直接读数、单光束，单点及扫描均可。10、测量附件：衡量仪器质量高低的重要方面是看仪器是否具有丰富的附属测量器件，如偏振附件、积分球附件、反射附件、自动进样器附件、色度分析软件、薄膜附件。11、测量样品的状态：可见和紫外的分光光度计一般测量液态样品，红外分光光度计一般能分析各种状态(气、液、固)的试样。,
