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1、1,基因操作技术及其应用,2,参考书目资料,分子克隆实验指南（第三版）：美J.萨姆布鲁克等著,黄培堂等译，科学出版社，2008.Gene IX：Benjamin Lewin编著.基因工程原理：吴乃虎，科学出版社，1998.分子生物学实验指导：郜金荣，叶林柏，武汉大学出版社，2007.基因工程：张惠展，华东理工大学出版社，2005.,3,分子克隆,4,5,基因工程是指在微观领域（分子水平）中，根据分子生物学和遗传学原理，设计并实施一项把一个生物体中有用的目的DNA(遗传信息)转入另一个生物体中，使后者获得新的需要的遗传性状或表达所需要的产物，最终实现该技术的商业价值。基因工程的基本特点是，分子水
2、平操作，细胞水平表达。,基因工程,基因工程与建筑工程,6,重组DNA技术的重大突破带动了现代生物技术的兴起，并很快产生了许多生命科学的高技术产业。重组DNA技术，又称为基因或分子克隆技术，是基因工程的核心技术。该技术包括了一系列的分子生物学操作步骤。,基因工程的核心技术是DNA重组技术,7,分子克隆技术 又称为重组DNA技术，是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序。供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。,8,重组DNA操作一般步骤：,（1）获得目的基因；（2）与克隆载
3、体连接，形成新的重组DNA分子；（3）用重组DNA分子转化受体细胞，并能在受体细胞中复制和遗传；（4）对转化子筛选和鉴定；（5）对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。,9,获得需要的目的基因（外源基因）,获得需要的目的基因常用的方法：（1）直接从生物体中提取总DNA，构建基因文库(gene library)，从中调用目的基因；（2）以mRNA为模板，反转录合成互补的DNA片段；（3）利用聚合酶链式反应（PCR）特异性地扩增所需要的目的基因片段，等等。,10,细胞内总DNA的提取分离与基因文库的构建,细胞内总DNA的提取分离程序,11,紫外分光光度计测定D
4、NA溶液的纯度和浓度。,12,基因工程的工具酶,“手术刀”专司切割之职，内切酶“缝纫针”具有连接之功，连接酶“复印机”行使复制之责，DNA聚合酶,13,(“交通工具车子”)载体有了切割与缝合（ligase）基因DNA的工具，还得有一个“车子”将重组DNA送到宿主细胞中去。,14,逆转录酶使真核基因的制备成为可能。（1）真核基因组庞大而复杂，不易制得基因图谱。（2）即使有了基因图谱，因为真核基因有内含子，不能在原核表达系统剪接出mRNA，没有成熟的mRNA就不能得到相应得产物。（3）经过逆转录mRNAcDNA(complementory DNA)得到的cDNA文库要比基因组文库小得多，所以筛选阳
5、性克隆就方便得多。,15,四、分子克隆的技术支撑,核酸凝胶电泳技术核酸分子连接技术细菌转化技术DNA序列分析技术寡核苷酸合成技术基因定点突变技术聚合酶链反应（PCR）技术DNA序列测定技术,16,核酸凝胶电泳,17,细菌转化技术（包括感受态细胞制备）,18,聚合酶链反应（PCR）技术,19,大规模生产生物活性物质,野生细胞,野生细胞,分离工程,酶,分离工程,基因工程蛋白质工程途径工程工程细胞,发酵工程,酶工程,细胞工程生物活性物质,20,21,用携带了外源基因的农杆菌Ti质粒转化植物原生质体，发育成具有新性状的完整植株转基因植物。,22,基因工程的工具酶,“手术刀”专司切割之职“缝纫针”具有连
6、接之功“复印机”行使复制之责,内切酶,连接酶,聚合酶,23,内切酶,“手术刀”专司切割之职“缝纫针”具有连接之功“复印机”行使复制之责,内切酶,连接酶,聚合酶,24,内切酶,25,同裂酶(Isoschizomers）,26,同尾酶,27,星活性*,所谓星活性又称Star活性。是指由于反应条件不同而产生的切断与原来认识序列不同的位点的现象，也就是说产生Star活性后，不但可以切断特异性的识别位点，还可以切断非特异性的位点。产生Star活性的结果是酶切条带增多。Differences which can lead to star activity include low ionic strengt
7、h,high pH,and high(5%v/v)glycerol concentrations.High Fidelity(HF)Restriction Enzymes can be used to reduce star activity.,28,29,DNA聚合酶,Taq酶用Taq酶扩增DNA时常使片段3端凸出一个A。Pfu酶产生平末端产物。,30,连接酶,T4 DNA Ligase(invitrogen)16C过夜或者室温1-2个小时了连接即可。,31,基因工程的载体-用于扩增,32,克隆载体必备条件,（1）具有复制起点（2）具有抗菌素抗性基因（3）具有若干限制酶单一识别位点（4）具有
8、较小的相对分子质量和较高的拷贝数。,33,表达型基因工程的载体-以PET32为例,34,多克隆位点,35,宿主,要考虑宿主菌对密码子的偏爱性 大肠杆菌不同密码子的偏爱性问题，将64组密码子分为强、中、弱密码子,36,目的产物,目的基因不溶性的高效表达过程：目的基因编码的真核蛋白质与宿主基因编码的原核多肽或或其它基因编码的具有其它功能的多肽和结合在一起，这种结合在一起的形成的不溶性无活性的包涵体，又叫为融合蛋白。举例：胰岛素与-半乳糖苷酶形成包涵体优点：避免细菌蛋白酶破坏，提高目的基因表达产物产量。缺点：需要经过溶解和复性才能获得有活性的适合：不需要翻译后修饰的蛋白质产物,37,目的基因的高效分
9、泌表达,概念：目的蛋白分泌到细胞周质和目的蛋白转运到细胞周质后再分泌到细胞外优点：防止宿主菌对表达产物的降解；有利于蛋白质正确折叠，形成天然构象减轻宿主细胞代谢负荷有利于分离需要在质粒设计时加入一段信号肽基因,38,基因克隆操作过程,39,克隆示意图,40,克隆示意图,41,克隆技术流程,分切连转筛,42,分,分离（来自生物组织）、扩增（设计引物，PCR扩增）mRNA-DNA-扩增,43,引物设计与订购,酶切位点双酶切、保护碱基、最合适的缓冲液。引物订购,44,保护碱基,45,1.用限制性酶消化 DNA 样品,46,单酶切,47,双酶切,48,选择合适的双酶切缓冲液,49,2.用限制性内切酶消
10、化质粒DNA,50,3.连接样品DNA和质粒DNA的消化产物,51,连接前最好要定量,连接比例摩尔比例为：插入片度：质粒=10:1-5:1为佳。质粒几十个ng为佳。,52,双酶切,配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。,53,冷循环器,54,4.用连接产物转化大肠杆菌感受态细胞,转化细菌有两个基本方法。一是 化学法，即用CaCl2 处理并加热激以促进DNA进入菌体；二是电激法，即 施加短脉冲的电荷以促进DNA 吸收。,55,用氯化钙化学转化,56,用氯化钙化学转化,57,电激转化,58,一个电激转化程序,加 50-200ng DNA 到 40ul 电激感受态细菌中将混合物放入一个预冷的
11、电激杯中施以脉冲电处理，脉冲长度预期值为 8 to 12ms立即加1ml LB 培养液，在室温下振荡 2-4 小时。分别取10ul 和 100ul 涂布在到两个加有抗菌素的LB 琼脂平板上，保温培养1天。,59,5.细菌在加有Amp+X-Gal的培养基上生长以进行筛选,连接会有三种结果，一是要插入的序列自连；二是切开的质粒重连；三是要插入的序列与质粒相连。第一种连接结果没有菌落形成。第二种连接结果表现为蓝色菌落。只有后一种结果是符合需要的，产生白色的抗氨苄青霉素菌落。,60,灭菌器,61,加IPTG和X-GAL,62,倒平板,63,互补,利用互补原理筛选重组体pUC18,64,筛选结果,蓝菌落
12、代表含有质粒的耐药菌，表达出由完好的 LacZ序列编码的功能性的 片段。白菌落代表含有质粒的耐氨苄青霉素菌，质粒上 LacZ序列上有插入片段。,65,乳糖和诱导物IPTG的化学结构,isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside,66,X-gal,X-Gal是-半乳糖苷酶(-galactosidase)的显色底物，在-半乳糖苷酶的催化下会产生蓝色产物。常用于-半乳糖苷酶的原位染色检测以及蓝白斑筛选。,67,X-gal水解,68,筛选结果模式图,69,蓝菌落,建议用DH5做宿主菌。,70,蓝白菌落,71,电泳仪,72,经过双酶切、PCR等鉴定，送阳性克隆测序。提取正
13、确的克隆菌中的质粒，转入表达型的菌株，如BL21等。诱导表达蛋白,73,鉴定方法,74,PCR鉴定,75,原位杂交,76,鸡的肌球蛋白的克隆和检出,免疫学方法,77,蛋白质的纯化,78,谢谢！,79,多利诞生的过程 为什么震惊和惊呼，我们先了解一下多利诞生的过程以及胚胎细胞克隆和体细胞克隆的区别这两个基本问题，对我们学习后面内容或许有所帮助和启发。多利诞生的过程：1.取出第一只成年母羊乳腺的普通细胞，分离基因备用。2.取出第二只母羊未受精的卵细胞，取出基因换上第一只羊乳腺细胞基因（“掉包”），放电激活该卵细胞，使之象正常受精卵一样进行细胞分裂，直至一定阶段，胚胎成熟。3.将成熟的胚胎移植到第三
14、只母羊子宫中发育，妊娠（同正常一样），最后产下多利。这样一只与第一只羊基因百分之百一样的复制品诞生了。,80,81,82,目的基因高效表达规律,目的蛋白无须变形和复性就具有生物活性的表达方式对于翻译后需要修饰蛋白质结构，能够进行目的蛋白结构修饰的表达方式能够将目的蛋白分泌到细胞周质、特别是分泌到细胞外的分泌型表达方式降低不含目的基因细胞的比例，保持目的基因的稳定性，使目的基因在宿主细胞内长时间超持和表达通过选择好的培养方法和能够进行高密度培养的细胞，提高细胞密度在宿主细胞选择、质粒构建、培养基设计都应该考虑有利于产物的分离提纯,83,概述基因克隆工具酶基因克隆载体目的基因的分离基因克隆操作过程目的基因在宿主中的表达,84,CIAP去除5磷酸,外源DNA,限制性内切酶酶切,5P,3OH,5P,3OH,T4连接酶连接,5OH,5OH,3OH,转化E.Coli,限制性内切酶酶切,载体多克隆位点,3OH,筛选重组子，测序,85,重组体筛选,
