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1、分子诊断在感染性疾病中的应用,袁艳军,感染的慨念,感染是病原体在宿主的个体内进行有害的复制、繁殖过程.病原体:细菌、真菌、病毒、支原体、衣原体、螺旋体、寄生虫 条件致病菌,微生物,人体,微生物,人体,不同的感染状态,共生状态,在正常情况下，人体的一些腔道和体表均有微生物寄生,感染性疾病的分子诊断策略,一般性策略（检出病原体的DNA/RNA）：判断有无感染是何种病原体感染常用方法：PCR 分子探针杂交完整性策略检出病原体分型（分类）亚型耐药性常用方法：杂交、PCR、基因芯片、DNA测序,分子生物学检验技术在感染性疾病中的应用主要包括对病原生物进行鉴定、分型、耐药诊断和治疗过程中的疗效监测等动态、
2、定量地检测病原体核酸，能对疗效判断和病情预后评价提供客观的依据目前已经应用于一些重要的感染性疾病，如结核病、病毒性肝炎、艾滋病、SARS、人禽流感等,感染性疾病的分子诊断临床价值,一、感染性疾病的诊断和治疗监测,（一）结核分枝杆菌,（二）肝炎病毒,（三）人类免疫缺陷病毒,（五）SARS冠状病毒,（四）HPV病毒,感染方式 呼吸道、消化道或皮肤损伤侵入机体 所致疾病 疾病种类多样化 以肺结核为主,结核分枝杆菌(M.tuberculosis),生物学主要特点：1.结核分枝杆菌细胞壁中含有大量脂质2.引起的疾病都呈慢性，并伴肉芽肿3.抗酸染色阳性,结核分枝杆菌(M.tuberculosis),实验室
3、诊断现状,分子生物学检测方法,近年来核酸扩增技术和杂交分析技术的发展，为分枝杆菌的检测、鉴定和药敏实验提供了极大的方便，可将诊断时间从几周降低到几天。结核病基因诊断技术主要包括聚合酶链反应(PCR)、核酸探针杂交、DNA序列测定、基因芯片、基因分型等。,现代分子生物学快速诊断,共价封闭环状结构 标准株结核分枝杆菌 基因组全长4.4kb,包含4000个蛋白质编码基因和50个RNA编码基因,基因组特点,MDR早期诊断,分枝杆菌分子诊断系统,菌种鉴定,筛查、鉴别诊断,实时荧光PCR,基因芯片快速检测平台,高 效：一个样本可同时检测结核分枝杆菌和NTM快 速：4周（菌培）3 小时灵 敏：10 个菌/反
4、应（TB）；102 个菌/反应（NTM）,13,分枝杆菌核酸检测,功能：TB快速筛查；TB/NTM鉴别诊断,高 效：同时检测 17 种分枝杆菌（包括TB）快 速：4周（菌种鉴定）6 小时灵 敏：103 个菌/反应,检测范围：结核、胞内、鸟、戈登、堪萨斯、偶然、瘰疬、浅黄、土、龟-脓肿、草、不产色、海-溃疡、金色、苏尔加、蟾蜍、耻垢。,14,分枝杆菌菌种鉴定（DNA微阵列芯片法）,通 量：两个一线抗结核药（MDR）速 度：8周（药敏）6 小时灵敏度：103 个菌/反应,基于rpoB（利福平）和katG/inhA（异烟肼）的基因突变，对耐多药结核病做出快速诊断。,15,结核分枝杆菌耐药基因检测试剂
5、盒,病毒性疾病的分子检测,乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）,全世界有3.5亿慢性携带者，75%在亚太地区每年有一百万人死于HBV感染，是全球范围内第9位死因中国：50%70%的人受过感染，8%10%是HBV携带者,世界其它地区,亚太地区75%,75%的长期慢性携带者来自亚太地区,HBV的形态特征,DNA 病毒 双链（非环状）DNA不等长 正链（2/3）负链,最常见的血清型为adw、adr和ayw 亚型的地区分布不同，我国以adr为主，adw次之，而ayw见于新疆、西藏和内蒙古等地,HBV基因组结构,pre-S1 pre-S1蛋白 pre-S2 pre-S2蛋白 S H
6、BsAg pre-C HBeAg C HBcAg P DNAP X HBxAg,编码,HBsAg,pre-S2,pre-S1,S区,C区,P区,X区,基因重叠,急性感染时期HBV的标志物,HBV 检测窗口期血清学（HBsAg）：56天PCR：33天缩短23天（平均6-15天）,HBV分子诊断方法,HBV-DNA检测（PCR）PCR 引物是PCR扩增的关键，决定扩增的特异性和敏感度。PCR引物常根据其S、C、P和X基因中的高度保守序列来设计。,部分常用的引物序列,1样本处理（样本处理区）2核酸扩增2.1 试剂配置（PCR前准备区）2.2 加样（样本处理区）2.3 PCR扩增（检测区）,HBV D
7、NA FQ-PCR（real time PCR）,HBV DNA FQ-PCR（real-time PCR）,结果判断：FQ-PCR进行HBV DNA的定量检测，检测范围为2.51022.5109 copies/ml 检测样本中5102 copies/mlHBV DNA5107 copies/ml，测定结果有效，可直接报告相应的拷贝数检测样本中HBV DNA5107 copies/ml，既可直接报告为5107copies/ml，也可用正常人血清按10倍剃度做相应稀释，使其拷贝数落在1105-5107 copies/ml范围内，再重新测定，测定结果应以稀释倍数进行校正检测样本HBV DNA510
8、 copies/ml时，拷贝数仅供参考，报告为小于最低检出限Ct值无数值时,报告为0.0 copies/ml,支链DNA（bDNA）技术,一种核酸探针杂交标志信号放大技术。优点：稳定性和重复性较好，结果准确，操作简单，将待测病毒裂解释放核酸后变性为单链，即 可进行检测。缺点：敏感性较低、检测范围窄而不适用于低水平病 毒的检测。,还可以用于乙肝病毒基因检查的方法主要有：荧光PCR法、竞争PCR法、PCR酶联免疫吸附法、荧光标记物法和PCR酶联化学发光等方法。,变异株与耐药突变检测,HBV可能发生自然变异HBV在人体活疫苗接种和抗病毒治疗等压力下发生变异 HBV基因组的变异常引起病毒生物学特性的改
9、变，从而导致HBV感染发病机制的变化、血清学检测指标的改变以及免疫逃逸，给乙型肝炎的诊断和治疗带来困难,一、感染性疾病的诊断和治疗监测,HBV耐药突变类型及其核苷酸、氨基酸变化,46.91 54.64 50.74,丙型肝炎病毒（HCV）,急性丙肝的临床诊断1.流行病学史：有输血史、应用血液制品史或明确的HCV暴露史。2.临床表现：全身乏力、食欲减退、恶心和肝区疼痛等，其他可有低热，轻度肝肿大，脾肿大，黄疸。部分患者无明显症状。3.实验室检查：ALT多呈轻度和中度升高，抗-HCV和HCV RNA阳性。约90%的输血后非甲非乙型肝炎和7080%的无输血史的散发型非甲非乙型肝炎由HCV感染所致,HC
10、V,血中HCV含量仅为HBV的千分之一HCV的细胞培养尚未成功，病毒的分离极为困难HCV的变异性很高，使其诊断十分困难HCV的免疫学标志仅有抗HCV一项，且由感染至抗体产生大约需要70天，部分病人感染后始终都不形成抗体,HCV分子诊断技术尤为重要,HCV基因组（单链RNA）,呈球形颗粒直径约50nm有一脂质包膜核心：单股正链RNA，全长9.4 kb仅一个开放读框（ORF），编码一条含有3008 3037个氨基酸的病毒前体多肽,HCV基因分型的多样性,由于HCV的RNA聚合酶的忠实性不高，所以引起HCV的基因型呈多样性HCV分为6个主要基因型（Simmonds），HCV亚型已超过50个.HCV
11、RNA基因分型有助于判定治疗的难易程度及制定抗病毒治疗的个体化方案.,HCV分子诊断,HCV-RNA定性试验逆转录PCR 有许多因素影响着PCR方法，如标本处理及储存形式，引物设计、扩增倍数、反应条件、DNA产物的污染、扩增后产物检测系统等 严格的质控、操作人员的熟练程度尤为重要 HCV RNA定性检测的特异度在98%以上，只要一次病毒定性检测为阳性即可确证HCV感染一次检测阴性不能完全排除HCV感染，应重复检查,HCV-RNA定量试验,估价血清中HCV-RNA水平 反映感染机体的病毒复制率及清除率 在未治疗的慢性丙肝机体内病毒负荷相对稳定 目前有二种方法可定量HCV-RNA水平-靶扩增技术如
12、定量PCR方法-信号扩增技术如支链DNA法,HCV RNA定量（real-time RT-PCR）,质控标准阴性对照的检测结果为阴性强阳性对照的Ct值应小于等于30.0临界阳性对照的Ct值应大于强阳性对照的Ct值否则此次实验视为无效结果判断Ct值无数值的样本为阴性样本Ct值36.0的样本为阳性Ct值大于36.0的样本建议重做，重做结果无数值者为阴性，否则为阳性,HCV RNA定量结果表示方法,HCV RNA定量检测法有两种表示方法：拷贝/ml（罗氏公司Cobas V2.0）IU/ml（美国国立遗传学研究所的SuperQuant）两者之间可以进行换算，IU/ml与拷贝数/ml换算公式是：IU/m
13、l=0.854拷贝数/ml+0.538,特别说明,应注意HCV RNA检测中的假阳性和假阴性在HCV急性感染期，在血浆或血清中的病毒基因组水平可达到105107拷贝/ml在慢性感染者中，HCV RNA水平变化范围在51045106拷贝/ml之间，同一患者血液中HCV RNA的水平相对稳定HCV病毒载量的高低与疾病的严重程度和疾病的进展并无绝对相关性，但可以作为抗病毒治疗疗效评估的观察指标（“评估”和“预测”）,HCV基因型测定,检测基因型方法一般分为二类：检测HCV基因的点突变的筛选试验 评估HCV基因更大片段的验证性试验 HCV基因型的筛选试验有：(1)对HCV高度保守的5-NC区域行限制性
14、片段长度多 型性分析（RFLP）(2)对HCV-5NC区域行逆转录斑点杂交分析，又名 LIPA方法(3)用型特异的引物对HCV核心基因巢式PCR。(4)病毒蛋白抗原性分型 评估HCV基因更大片段的验证性试验-序列分析,人类免疫缺陷病毒（HIV）,全国累计报告HIV感染者地理分布,截至2005年12月底,HIV在宿主细胞中的复制,Step 1:BindingStep 2:Reverse TranscriptionStep 3:IntegrationStep 4:ReplicationStep 5:TranslationStep 6:Viral Assembly,靶细胞：CD4+T 细胞,HIV基
15、因组,基因组为RNA双分子，与其它逆转录病毒基本相同其正链RNA分子大小为 HIV-1 9.3 kb 有3 组共8个基因 HIV-2 9.7 kb 有3 组共9个基因5端有帽子结构，3端有poly(A)结构,HIV基因组,第一组：逆转录病毒共同的结构基因和侧翼末端重复顺序 gag（group of antigen)基因：编码核心蛋白 pol（polymerase）基因：编码逆转录酶，DNA聚合酶 env（envelop）基因：编码包膜蛋白LTRs：不编码任何蛋白，可起始其它病毒基因的表达，无种属特异性第二组：参与基因表达的调节基因 tat（trans-acting transcriptiona
16、l gene）rev（regulator of expression of viral protein）nef（negative regulator factor）第三组：负调控病毒的感染性，成熟或释放的基因 vif（viral infectivity factor）vpu（viral protein U）vpr（viral protein R）,HIV基因组遗传变异率高,高度变异区在env基因内，相当于gp120的五个区段HIV疫苗研发难度大,HIV-1感染后病毒标志物的变化,窗口期：检测抗体 2-12周检测p24抗原 2-3周 检测RNA 11天,HIV病毒载量（HIV RNA 定量）,主
17、要有三种技术：RT-PCR（最低检测限为50copies/ml）bDNA（最低检测限为50copies/ml）NASBA（最低检测限为20 copies/ml）NASBA（nucleic acid sequence-based amplification）基于核酸等温扩增技术,病毒基因组是双链DNA.具有宿主和组织特异性：人是HPV惟一自然宿主传播途径：主要通过接触感染经性接触传播新生儿可经产道感染不同型的HPV侵犯的部位和所致疾病也不同HPV的免疫防御机制尚不十分清楚HPV的致癌潜力分为高危型：主要包括HPV 16、18、31、33、45、35、39、51、52和58等（其中HPV 16和H
18、PV 18与子宫颈癌发生密切相关）低危型：主要包括HPV6和HPV11,人乳头状瘤病毒（HPV）,中国妇女人乳头状瘤病毒（HPV）感染和宫颈癌流行病学调查大规模的人群专项调查发现：我国城乡妇女高危型HPV感染率均较高，并在2024岁和4044岁两个年龄段呈现感染高峰；以医院为基础、覆盖7个地区的调查显示：我国妇女83%的子宫颈浸润癌、84%的子宫颈鳞癌均有HPV 16型或18型引起；HPV 16型和18型是导致我国妇女患子宫颈癌的最主要原因,HPV,HPV检测,实验室诊断分子生物学方法检测HPV DNA在诊断同时确定型别：如斑点杂交、原位杂交，DNA印迹法（此法为最可靠的方法）以HPV基因型特
19、异性引物进行PCR扩增，再用特异性探针杂交法检测扩增产物（此法特异、敏感、被广泛采用）免疫印迹（Western blot）检测病人血清中基因型特异性抗体,SARS相关冠状病毒,2003年4月，香港研究者Peiris等报告了50 例严重型急性呼吸道综合征(serious acute respiratory syndrome,SARS)病人的临床表现和病毒学研究结果。一种新的冠状病毒(Coronavirus)是SARS的致病原因。(Lancet,2003,361:9365),SARS冠状病毒（SARS coronavirus）,严重急性呼吸综合症（severe acute respiratory
20、syndrome,SARS）SARS冠状病毒（SARS CoV）是一种新的变种的冠状病毒引起传染性非典型肺炎，是一种急性呼吸系统感染疾病,SARA CoV基因组,基因组为正链单链RNA，全序列共约29KB有11个ORF，编码：依赖于RNA的RNA聚合酶（rep）、4种结构蛋白（S,E,M,N）、5种未知蛋白特点：RNA和RNA之间重组率非常高，重组改变了RNA序列，进一步可导致蛋白质的氨基酸序列改变，出现高变异,spike protein,membrane protein,small membrane protein,nucleocapsid protein,SARA CoV 检测,WHO推荐
21、SARS-CoV特异性检测方法：细胞分离培养：所需时间较长，分离阳性率不高 免疫学检测;难以在感染的窗口期对病毒感染进行早期检测 分子生物学检测NASBA：反应在42进行，循环4到5次即可扩增106倍，可以在2小时左右将模板RNA扩增约109倍 RT-PCR、FQ-PCR：大约需要20次循环才能扩增106倍。,检测标本 痰液、咽拭子、鼻拭子、支气管肺泡灌洗液、血浆、粪便。有报道显示，在可能SARS病人中病毒的检出 率为100%。在疑似SARS病人中的检出率为23%。所有健康接触者中未检测到病毒。,另一项研究显示 检测病毒的3种方法（血清学检测、病毒分离、PCR技术）中，PCR技术的检出率最高。
22、,讨 论,PCR技术在疾病的早期即可获得阳性结果(早于血清转换期）。SARS患者中的阳性率约为80%，提示(当时的)PCR方法有较高的特异性但灵敏度较差，阴性结果不能排除病毒感染。对照中的阴性率约为98%100%。,SARS相关冠状病毒基因检测必须注意的问题,必须在规范的基因扩增实验室中进行。应采取必要的质控规程，包括阳性对照和阴性对照。阳性结果时必须对原始样本重复检验：或者扩增另一个基因片段 或在另一个实验室对同一样本进行检测。,分子诊断技术在很大程度上改变了感染性疾病的诊断方法,适用于检测不能或不易培养、生长缓慢的病原微生物，如结核分枝杆菌、苍白螺旋体、病毒等；通过检测细菌16SrRNA基因或对其测序，对细菌进行种属鉴定，并可能发现新菌种；进行病原体感染的早期诊断，确定感染病原体的类型；通过对病原体核酸的定量检测动态监测疾病进展；进行病原体感染的分子流行病学调查；对病原体进行基因分型；检测病原体的耐药基因等，为临床诊治、疗效观察提供科学依据，避免了病原体传统检测技术的缺点，避免了血清学检测的不足，如血清学检测的“窗口期”问题，具有快速、特异、灵敏度高等优点。,病毒感染的潜伏期（窗口期）血清中并无抗体的存在，无法以免疫学的方法来检测 PCR检测病毒量的变化上，比传统的方法更快速，有更高的特异性及灵敏度,分子诊断技术在很大程度上改变了感染性疾病的诊断方法,Thank you!,
