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1、1,第17章 色谱分析法概论,2,17.1.1.色谱法的起源和发展混合物最有效的分离、分析方法。俄国植物学家茨维特在1906年使用的装置：色谱原型装置，如图。,色谱法是一种分离技术色谱法（层析法）不仅用于有色物质分离，且大量用于无色物质分离。管内填充物，称为固定相。另一相是携带试样混合物流过此固定相的流体（气体或液体），称为流动相。,17.1 概述,3,30年代 出现薄层色谱法40年代 纸色谱法(塔板理论)50年代 气相色谱法兴起，奠定了现代色谱法的基础，可“在线”分析。（速率理论）60年代气相色谱-质谱联用技术70年代高效液相色谱法(HPLC)的崛起,把色谱法又推进到一个新里程碑。80年代
2、液相色谱联用技术、超临界流体色谱90年代 毛细管电泳法,发展历程,4,(1)按两相分子的聚集状态分：,流动相 固定相 类型,17.1.2.色谱法的分类,5,(2)按操作形式分类：,3按分离机制分：,6,色谱法,气相色谱法(GC)Gas Chromatography,液相色谱法(LC)Liquid Chromatography,超临界流体色谱法（SFC）,柱色谱法,气固色谱,气液色谱,平板色谱法,柱色谱法,毛细管电泳法,纸色谱法,薄层色谱,离子交换,液固,液液,空间排阻,7,17.2 色谱过程与术语,当流动相中携带的混合物流经固定相时，其与固定相发生相互作用。随着流动相的移动，混合物在两相间经过
3、反复多次的分配平衡，使得各组分被固定相保留的时间不同，从而按一定次序由固定相中流出。,（动画）,两相及两相的相对运动构成了色谱法的基础,17.2.1 色谱过程,8,经色谱柱分离后的样品组份通过检测器时，所产生的电信号强度对时间作图，所绘得曲线称为色谱图或流出曲线,17.2.2 基本术语(P436),1.色谱,9,(1)基线,基线是在操作条件下，没有组份流出时的流出曲线基线反映仪器的噪音随时间的变化稳定的理想基线应该是一条水平直线基线漂移:基线在一段时间内朝某一个方向变化.,10,(2)峰高或峰面积,色谱峰顶点与基线之间的垂直距离，以h表示，,11,用来衡量色谱峰宽度的重要参数，有三种表示方法：
4、（1）标准差()：正态分布曲线上两拐点间距离的一半。反映组分分散程度。（2）峰底宽(W)：W=4（3）半峰宽(W1/2)：色谱峰高一半处的宽度 W1/2=2.355 或W=1.699 W1/2,(3)峰宽,12,保留时间和调整保留时间是色谱法的基本定性参数,(1)保留时间（tR）：试样从进样开始到某个组份色谱峰顶点的时间间隔，称为保留时间；,(3)调整保留时间（tR）：tR=tRt0,(2)死时间（t0）：不与固定相作用的物质（如空气）的保留时间；,2.保留值,13,(4)保留体积（VR）：VR=tRFcFc为流动相流速，单位：m L/min。(5)死体积（V0）：V0=t0 Fc(6)调整保
5、留体积(VR)：V R=VR V0,VR 也是常用的色谱定性参数之一,14,又称Kovats指数，是一种重现性较好的定性参数。测定方法：将正构烷烃作为标准，规定其保留指数为分子中碳原子个数乘以100（如正己烷的保留指数为600）。其它物质的保留指数（IX）是通过选定两个相邻的正构烷烃，其分别具有Z和Z1个碳原子。被测物质X的调整保留时间应在相邻两个正构烷烃的调整保留值之间如图所示：,(7)保留指数(I),15,保留指数计算方法,16,例 在Apiezol L柱上，柱温100，用正庚烷及正辛烷为参考物质对，测得t0=30.0s，正庚烷的tR=204.0s，乙酸正丁酯的tR=340.0s及正辛烷的
6、tR=403.4s。,说明乙酸正丁酯在Apiezol L柱上的保留行为相当于7.756个碳原子的正构烷烃的保留行为。,17,3.分配系数与容量因子(P439),(1)分配系数,组分在固定相和流动相间发生的吸附、脱附，或溶解、挥发的过程叫做分配过程。在一定温度和压力下，组分在两相间分配达到平衡时的浓度（单位：g/mL）比，称为分配系数，用K 表示，即：,分配系数是色谱分离的依据。,18,分配系数 K 的讨论,一定温度下，组分的分配系数K越大，出峰越慢；试样一定时，K主要取决于固定相性质；某组分的K=0时，即不被固定相保留，最先流出。,K有不同的概念：吸附色谱法为吸附系数，离子交换色谱法为选择性系
7、数（或称交换系数），凝胶色谱法为滲透参数,19,容量因子是指，在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的质量比：,分配系数与容量因子都是与组分及固定相的热力学性质有关的常数，随分离柱温度、柱压的改变而变化。分配系数与容量因子都是衡量色谱柱对组分保留能力的参数，数值越大，该组分的保留时间越长。容量因子可以由实验测得。,容量因子也称：分配比；质量分配系数；,(2)容量因子,20,(3)分配系数和容量因子的关系,21,(4)分配系数和容量因子与保留时间关系,k值相当于组分被固定相滞留的时间和流动相通过系统所需时间的比值,22,tR与K的关系：,23,结论：色谱分离前提各组分分配系数不等,注：应选择合
8、适分离条件使得难分离的组分K不等,24,4.分离参数,(1)分离因子(),两种物质调整保留值之比，又称为分配系数比或选择性系数,25,色谱分离中的几种情况如图所示：,分离度（Rs），又称分辨率：反映组分在色谱柱分离情况。,(2)分离度(Rs),26,分离度的表达式：,R=0.8：两峰的分离程度可达89%；R=1：分离程度95.4%；（4）R=1.5：达99.7%（相邻两峰完全分离的标准）。,27,根据色谱峰的个数，可以判断样品中所含组份的最少个数根据色谱峰的保留值(或位置），可以进行定性分析根据色谱峰下的面积或峰高，可以进行定量分析色谱峰的保留值及其区域宽度，是评价色谱柱分离效能的依据色谱峰两
9、峰间的距离，是评价固定相(和流动相)选择是否合适的依据,小结：色谱流出曲线的物理意义,28,组分保留时间为何不同？色谱峰为何变宽？组分保留时间：色谱过程的热力学因素控制；（组分和固定液的结构和性质）色谱峰变宽：色谱过程的动力学因素控制；（两相中的运动阻力，扩散）,17.3 色谱分离的基本理论,塔板理论速率理论,色谱理论需要解决的问题：色谱分离过程的热力学和动力学问题。影响分离及柱效的因素与提高柱效的途径，柱效与分离度的评价指标及其关系。,29,1.塔板理论,最早由Martin等人提出塔板理论，把色谱柱比作一个精馏塔，沿用精馏塔中塔板的概念来描述组分在两相间的分配行为，同时引人理论塔板数作为衡量
10、柱效率的指标,30,塔板理论的四个基本假设,（i）色谱柱是由一系列连续、等距的水平塔板组成。在柱内每层塔板内部，组分可以在两相间迅速达到平衡。（ii）流动相进入色谱柱不是连续进行的，而是间歇式前进，每次前进为一个塔板体积。（iii）所有组分开始时存在于第1号塔板上，而且试样沿轴（纵）向扩散可忽略。（iv）分配系数在所有塔板上是常数。,31,分配色谱过程模型的举例,根据上述假定，在色谱分离过程中，该组分分布可计算如下：开始时，若有单位质量，即m=1（例1mg或1g）的该组分加到第1号塔板上。由于kA=1，即ns=nm故nm=ns=0.5。KB=0。,（动画）,32,理论塔板高度和理论塔板数,H=
11、2/L,n=L/H,n=16(tR/W)2,n=(tR/)2,n=5.54(tR/W1/2)2,理论塔板高度(H)和理论塔板数(n)都是柱效指标。,或W1/2，H，柱效,用tR代替tR计算塔板数，称为有效理论塔板数(nef)；求得的塔板高度为有效理论塔板高度（Hef）,33,从上两式可以看出：1：色谱峰W越小，n就越大，而H就越小，柱效能越高。因此，n和H是描述柱效能的指标。2：在同一色谱柱上，不同组分得到不同的理论塔板数，同一组分在不同色谱条件下理论塔板数也不相等。,n=16(tR/w)2,n=L/H,34,2.速率理论,1956年荷兰学者范第姆特（Van Deemter）等在研究气液色谱时
12、，提出了色谱过程动力学理论速率理论。他们吸收了塔板理论中板高的概念，并充分考虑了组分在两相间的扩散和传质过程，从而在动力学基础上较好地解释了影响板高的各种因素。该理论模型对气相、液相色谱都适用。范第姆特（Van Deemter）方程的数学简化式为,式中u为流动相的线速度；A，B，C为常数，分别代表涡流扩散项系数、纵向扩散项系数、传质阻抗项系数。现分别叙述各项系数的物理意义。,35,（1）涡流扩散项的概念,在填充色谱柱中，当组分随流动相向柱出口迁移时，流动相由于受到固定相颗粒障碍，不断改变流动方向，使组分分子在前进中形成紊乱的类似“涡流”的流动，故称涡流扩散。,（动画）,36,涡流扩散项的影响因
13、素,1:涡流扩散项与填充物的平均直径的大小和填充不规则因子有关，与流动相的性质、线速度和组分性质无关。2:为了减少涡流扩散，提高柱效，使用细而均匀的颗粒，并且填充均匀是十分必要的。对于空心毛细管，不存在涡流扩散。因此A0。,A=2dp dp：固定相的平均颗粒直径：固定相的填充不均匀因子,37,（2）纵向扩散项的概念,纵向扩散是由浓度梯度造成的。组分从柱入口加入，其浓度分布的构型呈“塞子”状。如右图所示。它随着流动相向前推进，由于存在浓度梯度，“塞子”必然自发地向前和向后扩散，造成谱带展宽。,（动画）,38,B=2 Dg：扩散阻碍因子。填充柱色谱，1。Dg：试样组分分子在气相中的扩散系数（cm2
14、s-1）(1)存在着浓度差，产生纵向扩散;(2)扩散导致色谱峰变宽，H(n)，分离变差;(3)分子扩散项与流速有关，流速，滞留时间，扩散;(4)扩散系数：Dg(M载气)-1/2；M载气，B值。,纵向扩散项的影响因素,39,传质过程的概念,在气液填充柱中，将高沸点液体(固定液)涂在多孔性载体上构成固定相。样品混合物被载气带入色谱柱后，组分在气液界面进入固定液，并扩散至固定液深部，进而达到动态分配“平衡”。当纯净载气或含有低于“平衡”浓度的载气到来时，固定液中该组分的分子将逐次回到气液界面，逸出，而被载气带走(转移)。这种溶解、扩散、转移的过程称为传质过程。影响此过程进行的阻力称为传质阻抗，用传质
15、阻抗系数描述。,（3）传质阻抗项,（动画）,40,传质阻抗对峰宽的影响,由于液相传质阻抗的存在，增加了组分在固定液中停留的时间，而晚回到载气中去。因此这些组分的分子落后于在两相界面迅速平衡并随同载气流动的分子，使峰展宽，如图所示。,41,减少传质阻抗的办法,降低固定液液膜厚度(df)是减小传质阻抗系数的主要方法。在能完全覆盖载体表面的前提下，适当减少固定液的用量。但固定液也不能太少，否则柱寿命短。且df还影响k值，df小，k小。,42,载气流速与柱效最佳流速,载气流速高时：传质阻抗项是影响柱效的主要因素，流速，柱效。载气流速低时：纵向扩散项成为影响柱效的主要因素，流速,柱效。,H-u曲线与最佳
16、流速：由于流速对这两项完全相反的作用，流速对柱效的总影响使得存在着一个最佳流速值，即速率方程式中塔板高度对流速的一阶导数有一极小值。以塔板高度H对应载气流速u作图，曲线最低点的流速即为最佳流速。,43,速率理论的要点,(1)组分分子在柱内运行的多路径与涡流扩散、浓度梯度所造成的纵向扩散及传质阻力使气液两相间的分配平衡不能瞬间达到等因素是造成色谱峰扩展柱效下降的主要原因。,(2)通过选择适当的固定相粒度、载气种类、液膜厚度及载气流速可提高柱效。,(3)速率理论为色谱分离和操作条件选择提供了理论指导。阐明了流速和柱温对柱效及分离的影响。,(4)各种因素相互制约，如载气流速增大，分子扩散项的影响减小
17、，使柱效提高，但同时传质阻力项的影响增大，又使柱效下降；柱温升高，有利于传质，但又加剧了分子扩散的影响，选择最佳条件，才能使柱效达到最高。,44,假设两组分n1=n2=n，W1W2，从分离度公式可推导,17.3.5 影响分离度的因素,45,k 影响峰位,n 影响峰宽窄,影响两峰间距,46,47,吸附色谱 分配色谱 离子交换色谱 空间排阻色谱,17.4 基本类型色谱法的分离机制,48,吸附色谱法利用被分离组分对固体表面活性吸附中心吸附能力的差别而实现分离。其固定相为固体吸附剂，大部分GSC和LSC都属于吸附色谱法。(Ka为吸附系数)吸附过程是样品中各组分的分子(X)与流动相分子(Y)争夺吸附剂表
18、面活性中心(即为竞争吸附)的过程。,1.吸附色谱法,49,2.分配色谱法,分配色谱法利用被分离组分在固定相或流动相中的溶解度差别而实现分离。其固定相为液体，GLC和LLC都属于分配色谱法范围。,溶于流动相与溶于固定相的溶质分子处于动态平衡，平衡时浓度之比(严格应为活度比)为狭义分配系数：溶质分子在固定相中溶解度越大，或在流动相中溶解度越小，则K越大。,50,离子交换色谱法利用被分离组分离子交换能力的差别而实现分离。其固定相为离子交换树脂，按可交换离子的电荷符号又可分为阳离子交换树脂和阴离子交换树脂。以阳离子交换色谱为例说明分离机制。,交换反应达平衡时，以浓度表示的平衡常数称为选择系数,3.离子交换色谱法,（动画）,51,空间排阻色谱法根据被分离组分分子的线团尺寸而进行分离。其固定相是多孔性填料凝胶，故此法又称为凝胶色谱法(gel chromatography)，也称为分子排阻色谱法。,4.空间排阻色谱法,以有机溶剂为流动相者称为凝胶渗透色谱法(GPC)；以水溶液为流动相者为凝胶过滤色谱法(GFC)。,
