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1、专题2 动物细胞工程,植物细胞工程常用的技术手段有哪些？,那么动物细胞常用的技术手段呢？,植物组织培养植物体细胞杂交,问题探讨,动物细胞培养,动物细胞融合,生产单克隆抗体,动物细胞核移植,动物细胞工程常用技术,其中动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础,动物细胞培养和核移植技术,学习目标：1、简述动物细胞培养的过程、条件及应用2、对比说出动物细胞培养与植物组织培养原理、条件、结果、培养目的,一.动物细胞培养,从动物机体中取出相关组织，将它们分散成单个细胞，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。,(一)概念,一、动物细胞培养过程,阅读“动物细胞培养过程”并思考：,1、动物细胞培养的
2、技术实施的原理是什么？特点是什么？2、为什么要对取出的动物组织进行处理，使细胞分散？3、用胰蛋白酶对动物组织进行处理是因为细胞间的物质主要是什么？用胃蛋白酶可以吗？4、胰蛋白酶真的不会把细胞消化掉吗？为什么？5、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细胞培养材料？6、简述动物细胞培养的操作过程。,1、动物细胞培养的技术实施的原理是什么？,原理是细胞增殖（有丝分裂）。,一、动物细胞培养过程,动物细胞生长特点：,细胞贴壁：悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。要求：培养瓶或培养皿的内表面光滑、无毒、易于贴附。细胞的接触抑制：当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增
3、殖，这种现象称为细胞的接触抑制。,细胞贴壁过程,那么什么是接触抑制？,接触抑制：细胞在贴壁生长过程中，随着细胞分裂，数量不断增加，最后形成一个单层，此时细胞间相互接触，细胞分裂和生长停止，数量不再增加。,接触抑制,动物细胞生长特性,部分细胞突变，获得不死性，向癌细胞方向发展，糖蛋白减少。,2、为什么要对取出的动物组织进行处理，使细胞分散？,分散的单个细胞容易摄取所需的营养，排出代谢废物；而用大块组织培养时，内部细胞的营养供应和代谢废物的排出都较困难。,一、动物细胞培养过程,3、用胰蛋白酶对动物组织进行处理是因为细胞间的物质主要是什么？用胃蛋白酶可以吗？,细胞间的物质主要是蛋白质（胶原纤维）。胃
4、蛋白酶作用的适宜pH约为2，当pH大于6时，胃蛋白酶就会失去活性。胰蛋白酶作用的适宜环境pH为7.28.4。多数动物细胞培养的适宜pH为7.27.4。,一、动物细胞培养过程,4、胰蛋白酶真的不会把细胞消化掉吗？为什么？,胰蛋白酶除了可以消化细胞间的蛋白外，长时间的作用也会消化细胞膜蛋白，对细胞有损伤作用，因此必须控制好胰蛋白酶的消化时间。,一、动物细胞培养过程,5、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细胞培养材料？,动物胚胎或幼龄动物的组织、器官，它们的细胞分化程度低，增殖能力强，分裂旺盛，容易培养。,一、动物细胞培养过程,6、简述动物细胞培养的操作过程,分离组织（低幼动物）,分散细
5、胞（胰蛋白酶）,原代培养（细胞增殖）,传代培养（细胞增殖）,分装,聚焦一、动物细胞培养过程,深度思考：,7、什么是原代培养、传代培养？为什么要进行传代培养？8、传代培养中，第10代细胞与第50代以后细胞的主要区别是什么？9、你如何解释“多利”的早衰现象？,一、动物细胞培养过程,10、动物细胞培养能否象植物组织培养那样获得克隆个体？需要诱导其脱分化的过程吗？,7、什么是原代培养、传代培养？为什么要进行传代培养？,原代培养：取材（动物组织）细胞分散初次培养传代培养：培养的细胞细胞分散继续培养进行传代培养的原因：接触抑制,一、动物细胞培养过程,8、传代培养中，第10代细胞与第50代以后细胞的主要区别
6、是什么？,细胞癌变,失去接触抑制特性。,一、动物细胞培养过程,9、你如何解释“多利”的早衰现象？,培育“多利”所取细胞核来自成年羊。从细胞年龄来看，“多利”出生时，已是“羊”到中年。,一、动物细胞培养过程,10、动物细胞培养能否象植物组织培养那样获得克隆个体？需要诱导其脱分化的过程吗？,不可以，因为高度分化的动物细胞的全能性受到抑制。不需要诱导其脱分化。,一、动物细胞培养过程,小结过程：,幼龄动物或胚胎的组织、器官,胰蛋白酶,动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，将细胞网络起来形成具有一定弹性和韧性的组织和器官。,（分解弹性纤维）,10代细胞,传代培养,无限传代,遗传物质未改变,遗传
7、物质改变,接触抑制,剪碎,一、动物细胞培养过程,动物细胞培养不能最终培养成生物体,原代培养(primary culture),定义：把第1代细胞的培养与传10代以内的细胞培养统称为原代培养。,过程：从动物机体中取出组织 剪碎 加胰蛋白酶 细胞游离 加培养液 将细胞接种到培养瓶内 培养（12天换一次培养液）细胞贴壁生长 长成单层细胞,取材（动物组织）细胞分散初次培养,传代培养(subculture),定义：当原代培养的细胞生长停止，这时如果要使细胞继续生长，就要及时用胰蛋白酶等，使细胞从瓶壁上解离下来，然后加入新的培养液，将细胞分离稀释，并从原培养瓶内转接到新的培养瓶内，这个过程称传代培养,培养
8、的细胞细胞分散继续培养,细胞株：原代细胞一般传至10代左右细胞生长停滞，大部分细胞衰老死亡，少数细胞存活到4050代，这种传代细胞为细胞株。,细胞系：细胞株传代至50代后又出现细胞生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，使其在培养条件下可以无限制传代，这种传代细胞为细胞系。,细胞株和细胞系的区别：细胞系的遗传物质改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，容易传代培养。,多细胞动物和人体的细胞都生活在内环境中据此思考：1.内环境稳态包括呢些方面？适宜的温度、pH值、渗透压、营养、氧气。2.体外培养的细胞需要什么样的环境条件？无菌、无毒的环境。,二、动物细胞培养条件,3.体外培养细胞时需要提供哪
9、些物质？如何才能保证类似于内环境的营养环境？培养基应是液态还是固态？充足的营养、适宜的温度、pH和气体环境。加入动物血清。培养基应是液态。,思考：动物血清的作用？,主要是：提供有利于细胞生长增殖所需的激素、生长因子或提供合成培养基所缺乏的营养物质等。,保证细胞顺利的生长增殖,多细胞动物和人体的细胞都生活在内环境中，根据你所学的内环境的知识，思考以下问题：1.体外培养细胞时需要提供哪些物质？2.体外培养的细胞需要什么样的环境条件？,P46讨 论,充足营养（糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等合成成分及血清、血浆等天然成分。）,适宜温度、PH和气体环境；无菌无毒环境,动物细胞培养条件总结：,
10、1、无菌、无毒的环境（添加一定量的抗生素，定期更换培养液）2、营养（葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、动物血清等。）3、温度和PH 36.5+（-）0.5度,7.2-7.44、气体环境：O2和CO2（95%空气和5%CO2）,保证细胞顺利的生长增殖,动物细胞培养液的主要成分：,葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等。,（1）液体培养基,（2）含有动物血清,动物体细胞大都生活在液体的环境,植物组织培养呢？,无机盐、蔗糖、维生素、生长调节物质、植物激素,成分比较：,三、动物细胞培养的应用,P47最上面1、获得细胞产物，如蛋白质生物制品病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体等2、获得烧伤病人植皮所需的细胞
11、3、获得细胞用于检测有毒物质4、为治疗及预防疾病提供理论依据。,植物组织培养和动物细胞培养的比较,1、叙述多莉羊、高产奶牛的克隆过程 2、说出多莉羊和高产奶牛的克隆过程的不同点？3、说出体细胞核移植技术的应用前景及存在的问题,学习目标：,221动物细胞培养和核移植技术,动物细胞培养能获得克隆个体吗？如何才能获得克隆动物？,另一头绵羊的子宫,四、动物体细胞核移植技术和克隆动物,归纳动物核移植定义：,将动物的一个细胞的细胞核移入一个已经去核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育成动物个体（克隆动物）,动物细胞全能性受限。,分类,细胞分化程度低，恢复全能性容易,细胞分化程度
12、高，恢复全能性不容易,四、动物体细胞核移植技术和克隆动物,细胞质,细胞核,细胞核移植,多莉羊的培育过程,阅读p47思考：1、哺乳动物核移植可以为哪几类？全能性如何？2、动物克隆实例很多，为何多莉就举世闻名呢？,四、动物体细胞核移植技术和克隆动物,“多莉”是世界上第一例经体细胞核移植出生的动物。这一巨大进展证明了分化了的动物细胞核具有全能性,四、动物体细胞核移植技术和克隆动物,1997年，美国威斯康星州的一个奶牛场有一头名叫卢辛达的奶牛，年产奶量为30.8 t，创造了世界奶牛产奶量最高新纪录。目前世界各国高产奶牛场奶牛，年平均产奶量一般为十几吨，而我国奶牛产奶量年平均水平仅为34 t。能否依据“
13、多利”的培育过程，进行优质奶牛的快速繁育？请说明理由。,体细胞的细胞核具有全能性。,读图2-21，思考：,1、对比多莉羊和高产奶牛的克隆过程，找出操作过程的不同点？2、在体细胞的细胞核移植到受体卵母细胞之前，为什么必须先去掉受体卵母细胞的核？3、为什么用于核移植的供体细胞一般都选用传代10代以内的细胞？4、体细胞核移植方法生产的克隆动物是对体细胞供体动物进行了100%的复制吗？为什么？5、多莉羊和高产奶牛的克隆过程,哪一种更科学且易操作？6、简述高产奶牛的克隆过程。,四、动物体细胞核移植技术和克隆动物,1、对比多莉羊和课本高产奶牛的克隆过程，找出操作过程的不同点？,多莉克隆过程的受体细胞是去核
14、卵细胞，而高产奶牛的克隆过程的受体细胞是去核次级卵母细胞；多莉克隆过程是将供体细胞核注入受体细胞，而高产奶牛的克隆过程是将供体细胞注入受体细胞。,四、动物体细胞核移植技术和克隆动物,2、在体细胞的细胞核移植到受体卵母细胞之前，为什么必须先去掉受体卵母细胞的核？,为使核移植动物的遗传物质全部来自有利用价值的动物提供的细胞。,四、动物体细胞核移植技术和克隆动物,3、为什么用于核移植的供体细胞一般都选用传代10代以内的细胞？,10代以内的细胞一般保持正常二倍体的核型，未发生突变。,四、动物体细胞核移植技术和克隆动物,4、体细胞核移植方法生产的克隆动物是对体细胞供体动物进行了100%的复制吗？为什么？
15、,不是，克隆动物绝大部分DNA来自供体细胞核，但核外还有少部分DNA（如线粒体DNA）来自受体卵母细胞,四、动物体细胞核移植技术和克隆动物,5、多莉羊和高产奶牛的克隆过程,哪一种更科学且易操作？,卵母细胞当中的细胞周期蛋白含量、活性比卵细胞高，用它作受体更容易成功。将供体细胞注入受体细胞，使克隆动物更像供体动物。高产奶牛的克隆过程操作简便。,四、动物体细胞核移植技术和克隆动物,6、简述高产奶牛的克隆过程。,四、动物体细胞核移植技术和克隆动物,6、简述高产奶牛的克隆过程。,四、动物体细胞核移植技术和克隆动物,供体细胞培养,（M卵母细胞）,去核的卵母细胞,胚胎移植,供体细胞注入去核卵母细胞,激活受
16、体细胞，完成分裂、发育,去核卵母细胞体积比较大,M卵母细胞去核,培养的体细胞,重组细胞,重组胚胎,新个体,四、动物体细胞核移植技术和克隆动物,电刺激促融合、分裂、发育,1997年，美国威斯康星州的一个奶牛场有一头名叫卢辛达（Lucinda）的奶牛，年产奶量为30.8 t，创造了世界奶牛产奶量最高新纪录。目前世界各国高产奶牛场奶牛，年平均产奶量一般为十几吨，而我国奶牛产奶量年平均水平仅为34 t。（2）如果将克隆高产奶牛卢辛达的任务交给你，你将如何对它进行克隆？,四、动物体细胞核移植技术和克隆动物,首先从卢辛达耳朵（也可用别的组织、器官，耳朵在活体上容易取）上剪取一小块组织，在体外培养获得该组织
17、（如软骨组织）的细胞。从屠宰场取废弃的牛卵巢，抽取卵母细胞体外培养成熟。用显微针去除卵母细胞的核，再将耳细胞注入卵母细胞，用电刺激方法使卵母细胞与体细胞融合，这时供体核就进入了受体卵母细胞，再用电刺激或化学物质激活注入了体细胞核的卵母细胞，使其完成减数分裂和发育过程。核移植胚胎在体外短时间培养后，挑选正常卵裂的胚胎植入经同期发情处理的受体母牛体内。,M卵母细胞去核,培养的体细胞,重组细胞,重组胚胎,新个体,电刺激促融合、分裂、发育,1、加速家畜遗传改良进程，促进优良畜群繁育 2、保护濒危物种，增加动物的存活数量 3、可作为生物反应器，生产医用蛋白 克隆动物细胞、组织、器官可作为移植的供体了解胚胎发育及衰老过程、做疾病模型等,五、体细胞核移植技术的应用前景,五、体细胞核移植技术的应用前景,胚胎移植动物幼体产出概率10克隆动物存在着健康问题。例如：许多克隆动物表现出遗传和生理缺陷，如体型过大，异常肥胖，发育困难，脏器缺陷，免疫失调等。克隆动物的食品安全性问题存在争议,六、体细胞核移植技术存在的问题,
