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1、,枸杞多糖的提取与含量测定,实验目的,1、掌握提取多糖的原理和方法；2、掌握多糖的纯化原理及方法；3、掌握多糖含量测定的原理及方法。,实验原理,多糖的提取方法生物活性多糖主要有真菌多糖、植物多糖、动物多糖等等3大类。多糖的提取首先要根据多糖的存在形式及提取部位，决定在提取之前是否要做预处理。动物多糖和微生物多糖多有脂质包围，一般提取时需要加入丙酮、乙醚、乙醇或是乙酸乙酯的混合液进行回流脱脂，释放多糖。植物多糖提取时应该注意一些含脂较高的根、茎、叶、花、果及种子类，在提取前应先用低极性的有机溶剂对原料进行脱脂预处理，目前多糖的提取方法主要有溶剂提取法、生物提取法、强化提取法等等。,实验原理,易溶
2、于水的多糖的提取 水提取多糖中的多糖大多是中性多糖。用水作溶剂来提取多糖时，可以用热水浸煮提取，也可以用冷水浸提。结合多糖的提取结合多糖主要指黏多糖。以新鲜组织或丙酮脱水的组织为原料，可用水或盐溶液提取部分多糖。但是，以为大多数的黏多糖是与蛋白质结合的，需要用酶降解蛋白质部分或用碱使多糖和蛋白质之间的糖肽键断裂，以促进黏多糖在提取时的溶解。在碱性提取的同时用蛋白酶处理组织，可将提取过程简化。提取液中存在的蛋白质可用普通蛋白质沉淀剂沉淀，也可用其他方法进行多糖的提纯。,实验原理,多糖的提取液一般浓度较低，需在提取后对提取液进行浓缩。浓缩的方法可根据性质确定，如对热比较稳定的多糖，可用加热蒸发或减
3、压蒸出水分法；对于相对分子质量大的多糖可用超滤法。向多糖溶液中加入一定量的与水混溶的有机溶剂（如乙醇）可得到粗多糖的沉淀物。Sevag法Sevag法是自多糖中去除蛋白质的最缓和的方法，原理是利用蛋白质变性沉淀而多糖不沉淀出去蛋白质。将样品提取液与Sevag试剂按照5:1的比例混合，剧烈震荡后离心除去变性的蛋白质，反复多次至蛋白质除尽为止。该方法较为温和，配合蛋白质水解酶消化法使用效果更佳。,实验原理,蒽酮-硫酸比色法进行多糖的含量测定糖类在较高温度下可被硫酸作用而脱水生成糠醛或羟甲基糠醛后，与蒽酮（C14H100）脱水缩合，形成糠醛的衍生物，成蓝绿色。该物质在620nm处有最大吸收，在150u
4、g/ml范围内，其颜色深浅可与可溶性糖含量成正比。这一方法有很高的灵敏度，糖含量30ug左右就可进行测定，所以可作为微量测糖含量只用。一般样品少的情况下，采用这一方法比较合适。,实验试剂仪器,实验试剂 干燥枸杞子、葡萄糖标准溶液、蒽酮、浓硫酸、95%乙醇、无水乙醇、三氯甲烷正丁醇（4:1）。实验仪器 分析天平、托盘天平、离心机（大）、离心机（小）、水浴锅、电炉、漩涡震荡仪、真空烘箱、分光光度计、800ml烧杯、100ml烧杯、离心管、分液漏斗、50ml容量瓶、玻璃棒、量筒、加盖试管若干。,实验内容,提取 粗略称取20g 枸杞于，粉碎后放入800ml 烧杯中，加500ml 蒸馏水，热水提取2h。
5、过滤，加入1/4 体积的三氯甲烷正丁醇（4:1），剧烈振摇15min，3000rpm 离心25min，弃去中间变性蛋白和氯仿层，留用上清液。上清液于80水浴搅拌浓缩至50ml。在搅拌状态，将浓缩液加入3 倍体积95%乙醇中，室温静置1h 左右，3000rpm 离心10min，固形物用95%乙醇洗涤，3000rpm离心10min,然后用无水乙醇洗涤，3000rpm离心10min,真空干燥,得LBP 粗品。,实验内容,标准曲线的绘制 取干燥试管6 支，按下表数据配置一系列不同浓度的葡萄糖溶液。,在620nm波长下以第一管为空白试验，迅速测量吸光值，以葡 萄糖含量（mg）为横坐标，吸光度值为纵坐标，
6、绘出标准曲线。,实验内容,枸杞多糖的含量测定 精密称定20mg 多糖粗品，溶于50ml 蒸馏水中，制成样品液。分别吸取0.5ml，1ml 多糖溶液至试管中，加蒸馏水至总体积为1ml。冰浴中冷却，再加入4ml 蒽酮试剂，沸水浴中煮沸10min，取出后自来水冷却，620nm 比色，其他条件与作标准曲线同。测得吸光度值由标准曲线查出样品液的糖含量。,实验数据记录与处理,标准曲线的绘制以下表格是不同浓度的标准葡萄糖溶液吸光度的实验数据。,即可得到如下标准曲线。,实验数据记录与处理,实验数据记录与处理,枸杞多糖的含量测定根据标准曲线可以查得枸杞多糖样液吸光度的数值。,样液1含0.02367mg枸杞多糖，
7、样液2含0.04735mg枸杞多糖。,实验数据记录与处理,枸杞多糖的含量计算根据已经查得的数值，可以进行一下计算 c（样品1）=（0.02367 mg/0.5 ml）*50 ml/21.4 mg*100%=11.06%c（样品2）=（0.04735 mg/1.0 ml）*50 ml/21.4 mg*100%=11.06%,注意事项,蒽酮-浓硫酸比色法的注意事项：该法的特点是几乎可以测定所有的碳水化合物，所以蒽酮法测出的碳水化合物的含量，实际上是溶液中可溶性碳水化合物的总量。不同的糖类和蒽酮试剂显色的深度不同，果糖最深，葡萄糖、半乳糖、甘露糖和五碳糖依次降低，因此测定糖的混合物的时候，常常因不同
8、糖类的比例不同造成误差，但是测定单一糖类则可以避免此类误差。在进行枸杞多糖的提取提纯的时候，一定要注意沉淀枸杞多糖所需乙醇的浓度，切不可加入无水乙醇而没有意识到乙醇浓度的降低，引起提取枸杞多糖的量的降低。,注意事项,在Sevag法中，可以通过配合蛋白质酶消化法达到更好的提纯效果。在进行枸杞多糖的定量测量的时候，一定要注意葡萄糖标准溶液以及样品的用量，否则会造成较大误差，标准曲线的绘制中要用线性回归进行拟合。在进行620nm波长的吸光度测量时，一定要进行比色池的校准，否则将会带来较大的误差，比色池的校准，直接用标准曲线绘制时第一组试剂进行校准即可，且必须在实验开始前进行校准，及时交换吸光度不同的比色池，用吸光度小的比色池做100%吸光度的校准池。,谢谢！,所有实验报告内容。,
