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1、液相色谱基础知识,2017年04月11日,一、什么是色谱,色谱是一种分离工具，而不是传统意义上的分析仪器。色谱法也叫层析法，它是一种高效能的物理分离技术，将它用于分析化学并配合适当的检测手段，就成为色谱分析法。常见的分离方法：蒸馏、离心、电泳、过滤、超滤、等等。色谱法的发明人：俄国科学家：麦克海尔.塞蒙诺维奇.维茨特 M.S.Tswett,二、什么是液相色谱呢,液相色谱：流动相是液相,三、什么是高效液相色谱,High Performance Liquid Chromatography高效液相色谱法，简称：HPLC是一种区别于经典液相色谱；基于仪器方法的高效能分离手段。具有高性能的色谱柱，高精度
2、、耐高压的输液泵以及高灵敏度的检测器。,HPLC的分离原理、仪器配制和工作流程,分离原理,动画演示,溶剂,色谱泵,进样器,HPLC色谱柱,检测器,废液,数据处理系统,请单击,请单击,请单击,请单击,请单击,四、高效液相色谱法的特点,“三高一广一快”：高压：对载液加高,流动相能迅速通过色谱柱压.高效：分离效能高。高灵敏度：紫外检测器可达0.01ng，进样量在uL数量级。应用范围广：百分之七十以上的有机化合物可用高效液相色谱分析。分析速度快：较经典液体色谱法速度快得多，通常分析一个样品在1530分钟，有些样品甚至在5分钟内即可完成，一般小于1小时。,五、高效液相色谱法的主要类型及原理,1、液-液分
3、配色谱2、液-固吸附色谱3、离子交换色谱4、离子对色谱5、离子色谱6、排阻色谱7、亲和色谱(AC),1、液-液分配色谱,固定相与流动相均为液体（互不相溶）；基本原理：组分在固定相和流动相上的分配；流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定液的极性（正相 normal phase），反之，流动相的极性大于固定液的极性（反相 reverse phase）。正相与反相的出峰顺序相反；固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用；化学键合固定相：将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。C18柱（反相柱）以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂。,反相高效液相色谱法,
4、即指流动相的极性大于固定相极性的色谱方法。在本法中常采用化学键合相作为固定相，流动相采用水甲醇或水乙腈系统，在反相色谱中，极性强的组分在分离时先流出柱子，极性弱的组分后流出。因此适合于共存组分极性差异较大的样品分析。,乙腈(jng),乙腈又名甲基氰，分子式CH3CN，无色透明液体，密度小于水，约为0.79，能与水和乙醇等有机溶剂以任意比混溶，易燃，有毒性。,2、液-固吸附色谱,基本原理：各组分在固定相吸附剂上竞争性吸附与解吸固定相：固体吸附剂为硅胶、氧化铝等，较常使用的是510m的硅胶吸附剂；流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。特点：适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有官能团的化合
5、物和异构体有较高选择性；缺点：非线形等温吸附，常引起峰的拖尾,六、色谱柱,液相色谱柱的分离作用是在填料与流动相之间进行的，柱子的分类是依据填料类型而定。正相柱：多以硅胶为柱填料。根据外型可分为无定型和球型两种，其颗粒直径在3-10m的范围内.另一类正相填料是硅胶表面键合-CN,-NH2等官能团即所谓的键合相硅胶。反相柱：主要是以硅胶为基质，在其表面键合十八烷基官能团(ODS)的(C18)非极性填料。也有无定型和球型之分。常用的其他的反相填料还有键合C8、C4、C2、苯基等，其颗粒粒径在310 m之间。,1.色谱柱的选择,2.本公司使用的柱子,主要特点:使用过程中柱压稳定，即使长时间使用也不会出
6、现拖尾等异常情况使用寿命长，清洗频度低，仅为同类产品的15%,七、样品的前处理,a、最好使用流动相溶解样品。b、使用予处理柱除去样品中的强极性或与 柱填料产生不可逆吸附的杂质。c、使用0.45m的过滤膜过滤除去微粒杂 质。d、利用超声仪脱气。,八、流动相的配制,a、流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱中。b、流动相具有一定惰性，与样品不产生化学反应。c、流动相的黏度要尽量小，以便得到好的分离效 果；同时降低柱压，延长液体泵的使用寿命d、流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。最好使用对紫外吸收较低的溶剂配制。e、流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡。f、在流动相配制好后，使
7、用0.45 m滤膜过滤，并进行脱气。,九、流动相流速的选择,因柱效是柱中流动相线性流速的函数，使用不同的流速可得到不同的柱效。对内径为4.6mm的色谱柱，流速一般选择1mlmin，对于内径为4.0mm柱，流速0.8mlmin为佳。当选用最佳流速时，分析时间可能延长。可采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分析时间(如使用反相柱时，可适当增加甲醇或乙腈的含量)。,十、检测过程的操作,样品检测前控制平台的准备工作,样品检测时的操作,请单击,请单击,请单击,十一、HPLC常用操作步骤,1)首先对流动相进行过滤，常用的孔径为0.22um和0.45um。2)对抽滤后的流动相进行超声脱气10-20分钟。3)
8、正常情况下，先用甲醇冲洗10-20分钟，然后再进入测试用流动相。4)一般情况下，流动相冲洗20-30分钟后，仪器和基线稳定，方可进样测试。5)同时进两针标样，若结果的比值在0.98-1.02之间，可正式进样。6)测试结束，要进行色谱仪及色谱柱的清洗和维护。如流动相为缓冲试剂，要用重蒸水清洗10-20分钟，方可用有机相进行保护，否则，有损色谱柱。7)关机时，先关计算机，再关液相色谱。,注意事项：1)流动相均需色谱纯度，水用20M的去离子水。2)脱气后的流动相不要振动，尽量不引起气泡。3)不使用不过滤的液体，所有过柱子的液体均需严格的过滤。4)压力不能太大，最好不要超过15MPa。5)不能随意更换流动相，因为缓冲试剂遇有机溶剂，会结晶，有损色谱柱，所以，每次由有机相变缓冲剂或缓冲剂变有机相均需用蒸馏水清洗。,整体认识一下我们的HPLC,
