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1、一.耐热冻干保护剂基质的分类 二.耐热冻干保护剂作用机理三.耐热保护剂在配制过程中注意事项四.耐热保护剂冻干工艺的优化五.耐热冻干保护剂活疫苗在冻干过程中常见 异常现象的处理,1.耐热保护剂特性有免疫活性但无药理活性能在冻干和保存时维持疫苗的稳定性在初次干燥时适宜的温度下疫苗不倒塌低成本易获取易灭菌可溶性外形美观,.耐热冻干保护剂基质的分类,2.按相对分子量分类低分子化合物提高微生物存活率形成均一悬液。酸性物质：谷氨酸、天冬氨酸、乳酸 中性物质：乳糖、蔗糖、海藻糖、山梨醇 碱性物质：精氨酸、组氨酸高分子化合物对微生物保护作用，促进升华形成耐热骨架阻断热传导和热辐射。如：白蛋白、明胶、蛋白胨、脱
2、脂奶粉,明胶Sigma公司：175、225、325水解明胶：德国、美国国产明胶（北京、上海）,脱脂奶粉Difco脱脂奶粉国产脱脂奶粉制备酸奶用，无抗生物素食品用脱脂奶粉 工业用，沉淀剂、絮凝剂,脱脂奶粉、明胶（175、225、325）在冻干过程中的作用促进升华易取得均质产品加热灭菌扩大细胞相互间的距离,3.按保护剂功能和性质分类（1）耐热冻干保护剂 疫苗在冻结和干燥过程中，防止活性组分发生变性。如：海藻糖、蔗糖、聚乙烯吡咯酮（PVP）等（2）填充剂 防止组分随水蒸气一起升华逸散。如：甘露醇、明胶等,（3）抗氧化剂自身氧化，消耗冻干样品内部和环境中的氧阻断冻干样品中氧化链式反应抑制氧化酶的活性，
3、防止样品在冷冻干燥及储藏过程中氧化变质。如硫代硫酸钠、维生素E、维生素C（4）酸碱调整剂 将生物制品pH调整到活性物质的最稳定范围进行冷冻、干燥。如：磷酸二氢钾、磷酸氢二钠,4.按物质的种类分类 糖/多元醇类 聚合物类表面活性剂类其它添加剂类,糖/多元醇类 单糖：葡萄糖、半乳糖 低聚糖：蔗糖、海藻糖 多元醇：甘露醇、山梨醇、丙三醇功能和作用:糖与生物制品活性组分的分子形成氢键而代替了原有水的位置起保护作用低聚糖：低温保护功能和脱水保护作用多元醇和糖一样，官能团也是羟基,海藻糖具有相对较高的玻璃化转变温度。海藻糖蛋白质水微冰晶的形成而提高，有效防止了水对玻璃化态的增塑作用较弱的吸湿性内部氢键少，
4、有利于蛋白质分子之间形成氢键化学活性非常低,甘露醇白色 结晶粉末，无臭、味甜，水中易溶无菌滤液稳定，不易被氧化提供支持结构不与活性组分发生反应1.4%PVP冻干样品脆断力为142g，有收缩迹象，与甘露醇联合使用，抗断裂的强度可提高325倍，保证冻干物料的颜色和质地均匀，没有收缩,山梨醇 山梨醇是甘露醇的同分异构体，但其溶解度比甘露醇大，在常温下黏稠状透明液体，有旋光性；略有甜味，具有吸湿性，高温下不稳定。在冷冻干燥配方中，山梨醇用作填充剂 与PVPk30合用减少产品裂纹，易碎性,聚合物类如：聚乙烯毗咯烷酮、葡聚糖、牛血清白蛋白聚合物类具有以下的性质：聚合物在冻结过程中优先析出 具有一定的表面活
5、性 在蛋白质分子之间产生位阻 提高溶液黏度,显著提高玻璃化转变温度 抑制小分子赋形剂（如蔗糖）的结晶 抑制溶液pH值变化,聚乙烯毗咯烷酮（PVP K30）常被用作澄清剂、色素稳定剂和胶体稳定剂 PVP对生物材料的低温保存和冷冻干燥，都是很好的保护剂 它在脱水干燥过程中又是很好的填充剂，对生物制品起到很强的支撑作用 在含有缓冲剂的乳酸脱氢酶配方中，10的PVP因能抑制磷酸氢二钠的结晶，从而抑制了系统的pH降低,表面活性剂类 降低界面的张力，亲水、亲油基组成的化合物。表面活性剂在冻结和脱水过程中降低冰-水界面张力所引起的冻结和脱水变形，又能在复水过程中对活性组分起到润湿剂和重褶皱剂的作用。表面活性
6、剂可分为离子型和非离子型。凡是溶于水时能电离成离子的，称为离子型表面活性剂，否则，称为非离子型表面活性剂。在冻干生物制品测定长期储藏中，表面活性剂并没有保护作用。,氨基酸类保护剂氨基酸是蛋白质的基本构成单位，其中最主要的是-氨基酸。它是由一个氨基（-NH2）、一个羧基（-COOH）、一个氢原子（-H）和一个R基团（-R）连接在一个碳原子所组成 常用的氨基酸类的保护剂：甘氨酸、谷氨酸、精氨酸、组氨酸甘氨酸是最好的填充剂,氨基酸 甘氨酸、谷氨酸或谷氨酸钠 L-半胱氨酸 L-组氨酸 L-精氨酸 复合氨基酸（199、MEM）,甘氨酸低浓度甘氨酸可通过抑制10或100mol/L磷酸缓冲盐结晶，所致pH值
7、的改变而阻止蛋白质药物变性可阻止冻干过程中重组人生长激素的聚集能升高成品的塌陷温度，阻止因塌陷而引起的蛋白质药物的破坏,不同氨基酸对微生物的保护甘氨酸、谷氨酸钠病毒、细菌、HVTL精氨酸POX、HVT、PPVL-半胱氨酸ND、IBD、IBVL-组氨酸MD、IBD、IBV,其它添加剂类（1）抗氧化剂（2）缓冲剂（3）冻干加速剂抗氧化剂自身氧化，消耗冻干样品内部和环境中的氧，使冻干样品物料不被氧化 给出电子或氢原子，阻断冻干样品中的氧化链式反应 通过抑制氧化酶的活性而防止冻干样品的氧化。如：维生素E、维生素C、硫代硫酸钠、硫脲.,缓冲剂蛋白质具有两性电解质性质，既能和酸又能和碱作用。在中性环境中，
8、大多数蛋白质是稳定的 由于蛋白质溶液在冻结过程中，溶液的浓度逐渐升高。在高浓度时可改变溶液的PH，pH值变化4个单位导致蛋白质变性，使生物制品失活。在冻干保护剂配方中，需添加适量缓冲剂。如：磷酸二氢钾、磷酸氢二钠,冻干加速剂冷冻干燥过程耗时长、耗能多，迫切需要对冻干循环进行优化，降低生产成本。如：叔丁醇叔丁醇是一种小分子醇，与水完全互溶，具有低毒性、高蒸气压。,叔丁醇在药品水溶液中能起到以下作用：可以降低干燥层阻力，从而加速干燥过程，缩短干燥时间溶解难溶于水的药品使产品具有高的比表面积、好外观，并易于复水可提高药品溶液和冻干品的稳定性有一定的抑菌作用,=.耐热冻干保护剂作用机理1 冻结过程中低
9、温保护的机理2 干燥过程中的保护机理3 储藏过程中的保护机理,1 冻结过程中低温保护的机理“优先作用”机理认为，蛋白质溶液在达到最大冻结浓度之前，优先与水作用（优先水合），而保护剂优先被排斥在蛋白质区域外（优先排斥）。这是由于保护剂的加入，增大了水分子的表面张力，促使了蛋白质分子优先与水分子相互作用。在这种情况下，蛋白质分子外表面比其体相中有相对较多的水分子和相对较少的保护剂分子，从而也就保护了蛋白质的天然构象,“优先作用”机理并不能完全解释用聚合物或蛋白质自身在高浓度时保护蛋白质的现象。因此，必然存在其他保护作用机理。表面张力减小的机理可以用于解释表面活性剂对蛋白质溶液冻结过程的保护。限制蛋
10、白质分子扩散的机理认为，许多保护剂都能够提高溶液的黏度，抑制活性分子的扩散,2 干燥过程中的保护机理（1）玻璃态假说 在含有保护剂溶液的干燥过程中，当浓度足够大且保护剂不发生结晶时，保护剂与活性组分混合物就会形成玻璃态分为强玻璃、弱玻璃在玻璃化转变温度以下进行降温，弱玻璃黏度的增加比强玻璃来的快。因此，赋形剂形成弱玻璃要比形成强玻璃的保护效果要好得多。蔗糖和海藻糖就是因为能够形成一种弱玻璃而具有很好的保护作用,（2）水替代假说 在蛋白质分子中存在大量的氢键，结合水通过氢键与蛋白质分子联接。当蛋白质在冷冻干燥过程中失去水分后，保护剂的羟基能够替代蛋白质表面上水的羟基，使蛋白质表面形成一层“水合层
11、”，这样就可以保护氢键的联结位置不直接暴露在周围环境中，从而保持了蛋白质天然结构和功能的完整性,“水替代”假说，当冷冻干燥时，保护剂可与生物大分子的失水部位形成氢键，替代保持生物大分子空间结构和生物活性所必须的水分子，从而减轻了生物大分子冻干损伤,保护剂对细菌细胞膜的保护 水分子可通过氢键与细胞膜中磷脂的极性端相连，而且每个磷脂的极性端与其他磷脂分子的极性端被水分子隔开。冻干保护剂特别是糖类保护剂分子上的羟基具有与膜磷脂上的磷酸集团连接形成氢键的能力，从而阻止和限制细胞膜因脱水而融合，降低相变温度，使脂膜不易向凝胶相转变而保持液晶相，增加膜的流动性,保护剂对蛋白质的保护 由于蛋白质分子中存在大
12、量的氢键，结合水通过氢键与蛋白质分子联结。当蛋白质在冷冻干燥过程中失去水分后，保护剂的羟基能够替代蛋白质表面上水的羟基，使蛋白质表面形成一层“水合层”，这样就可以保护氢键的连结位置不直接暴露在周围环境中，从而保持了蛋白质天然结构和功能的完整性,3 储藏过程中的保护机理 干燥过程中出现的引起蛋白质变质的时间尺度为小时，而对于储藏而言，时间尺度为月或年。在正确冷冻干燥工艺中，要求产品温度接近于其玻璃化转变温度，而在正确的储藏条件下，环境温度应当比其玻璃化转变温度低得多，以获得很长的松弛时间,保护剂指导原则蛋白质、二糖、氨基酸和缓冲盐水疫苗块的倒塌温度由赋形剂组成的相对浓度决定保护剂应在抗原收获或冻
13、干前加入抗原中它应含有中和羧基活性的物质电解质成分应含量最少,影响保护剂的因素种类、浓度、配制方法灭菌方法pH值制品表面积,四.耐热保护剂在配制过程中注意事项,1.保护剂在配制过程中注意事项水的标准称量的准确度和误差溶解顺序大分子物质与小分子物质混合保护剂贮存温度,配制过程中水的要求配制用水为注射用水或去离子水，水的电导率1s/cm（相当于100万）。保护剂的称量在配制过程中，用量筒准确量取所需注射用水量，准确称取各保护剂成分逐次加入，一种成分完全溶解后再加入另一种成分，直至完全加完。（操作必须由2个人来完成，1人称量、1人复核）。,按照保护剂配方中的先后顺序依次加入溶解。大分子物质与小分子物
14、质混合时，边摇边加，使二者充分混匀，混合后观察有无沉淀，如有沉淀应停止使用。耐热保护剂均应按保护剂质量标准要求进行保存，不合理的保存也会影响保护剂的耐热性能。,2.耐热保护剂的灭菌大分子部分（高压部分）高压温度高，时间过长高压瓶子的大小也会影响保护剂的性能，同是一批保护剂，使用1000ml装量瓶与8000ml装量瓶高压后保护剂的性能有明显差异，装液体多的瓶子上温时间较慢，这样在达到某一温度就需要很长时间，导致保护剂中各成分分解变性,高压后闷锅现象保护剂在高压后不及时打开高压锅门，致使保护剂在同一温度停留的时间比较长，影响保护剂中各成分性能，导致保护剂在冻干过程中起不到保护作用,解决方法：按耐热
15、保护剂灭菌的要求时间、温度进行操作（12115分钟）,建议使用适当的容器，装量不宜过大（达到上温快、降温快）。高压后，仪表降至零，应立即打开高压锅门，不要把保护剂闷在锅里等冷却后取出，更不要在高压锅里过夜,小分子部分（过滤部分）不匹配的滤芯也会影响保护剂的质量。不合理滤芯对耐热保护剂中各物质分子吸附过多，致使保护剂各成分的最终含量低于保护剂配方的要求含量。影响耐热保护剂活疫苗的产品质量,解决方法：要求吸附性小的滤芯，最好是进口的。进口滤芯（Millipore）即可以增加使用次数，除菌效果又好。国产滤芯吸附性大，而且使用次数少，又不稳定，影响保护剂的质量,3.耐热保护剂保存与使用按耐热保护剂质量
16、标准要求保存。大分子部 分与小分子部分按比例混合后置28保存，一 般不要超过10日每一种保护剂在使用过程中禁止单一加入(如：将小分子加入抗原后，再加入大分子物质)，应将小分子物质与大分子物质按比例混合均匀后与抗原混合，进行分装,五.冻干工艺的优化,冻干过程1 预 冻2 一次干燥（冰升华）3 二次干燥（解吸附作用）,1.预冻预冻速度：控制在每分钟下降1左右产品降至40或冻干机所能降的温度，确保箱内所有疫苗瓶内都降到共熔点以下,2.一次干燥一般以每小时25为宜板层温度应控制在-10至3之间兽用活疫苗在-30或以下温度进行真空应维持在100120tor(1333216000帕斯卡）成品看不到冰，产品
17、温度开始向板层温度靠近,3.二次干燥以510/h 为宜，最终制品温度不能超过它的安全温度每步增加板层温度，每2小时升温10成品温度应该迅速等于板层温度最终板层温度在2535之间，决定成品的水分含量病毒类产品要求25，细菌类产品可达35,在冻干过程中，真空度与产品温度相对应的压力一致，冰上蒸汽压对应关系和优化冻干过程见表1、表2。,冻干过程优化,表1 冰上蒸汽压表,表2 冻干过程的优化,包装物指示管制玻璃瓶和配套胶塞：45水浴24小时瓶是否进水成品45水浴24小时疫苗是否变形胶塞应该在135干燥4小时,胶塞灭菌含饱和水分冻干品水分由2升至5以上,冻干产品质量控制冻干损失量，效检前后测定样品瞬间放
18、电实验测定真空测定产品水分11.537耐老化试验是产品工艺中关键一步,冻干产品保存通常在28保存20或以下胶塞失弹性导致失真空,1 外观差2 喷瓶3 制品冷爆脱底4 制品温度上升5 剩余水分偏高6 制品的厚度,六.耐热保护剂活疫苗在冻干过程中异常现象的处理,异常现象,（1）塌陷原因升华过程中，搁板温度过高，系统真空度下降，已干燥部分因处于水蒸气浓度较高的环境中潮解而发生塌陷停电或因设备故障中断真空和制冷系统运转，也会导致样品塌陷，在升华高峰阶段，设备停机10min以上即可导致产品全部报废,1.外观差,措施在升华阶段，搁板温度应低于制品共熔点510，同时保证干燥箱内真空度不高于0.2mbar=2
19、0p在升华过程中突遇停电或其它原因停机，应立即关上真空蝶阀，使制品处于真空状态，并尽快修复开机继续升华,（2）分层原因分装后的样品久置，溶液中的一些不溶物沉淀析出，导致分层停机10min以上或干燥箱漏气导致分层,措施可采用速冻方法，使液态制品在沉淀发生之前冻结实，保证沉淀物在制品中均匀分布，同时尽可能提高进箱效率，缩短沉淀时间提高供电系统的安全性和冻干设备的可靠性及设备操作人员素质，是解决问题的唯一途径,（3）起壳原因：产品进箱温度过高、分层，预冻过程中样品冻结不坚实所致措施：产品进箱温度控制在05为宜。延长预冻时间，确保样品冻实,（4）裂纹原因：制品中干物质含量过高或粘稠度不够措施：减少干物
20、质含量，正常含量应控制在2025%左右,（5）萎缩原因药品内含有残留水分；样品浓度不宜太高或太低；升华时温度高于共熔点或解析温度升高过快，真空密封不良；胶塞水分含量偏高，未作干烤处理，都能导致冻干品萎缩,措施升华过程中严格控制样品温度低于共熔点，解析时搁板升温速度不宜太快，一般控制在5/h左右，其产品温度不能超过崩解温度；产品出箱后严格检验真空度，确保良好的密封性；使用干烤过的胶塞,(6)粗结晶原因粗结晶是在预冻阶段形成的，与后期干燥无关。入箱时板层温度和冻干过程中的降温速度是导致样品产生粗结晶的主要因素措施样品入箱时，板层温度控制在010，同时加快入箱速度；入箱后，立即将板层温度降至样品共晶
21、点温度以下1015，保证冻结过程一次性完成，即快速预冻,2.喷瓶原因冻结不实，升华干燥时升温过快，局部过热，部分制品溶化成液体，在高真空度条件下，少量液体从已干燥固体表面穿过孔隙喷出而形成 分装样品时，液体流速较快，形成一定量的气泡存在瓶内液体中,措施 严格控制预冻温度在共熔点以下1015，并保持2小时以上，使药品冻实后再升温；升华干燥时的供热量要控制好，适当放慢升温速度，且控制温度不超过共熔点,当液体中有气泡时，将液体放置一定时间让气泡充分逸出放气速度不宜太快，否则会使箱内真空度突然大幅度变化，会形成一股湍流冲入容器内，使制品变成絮状或粉末,3.制品冷爆脱底原因制品在没有完全冻结实的情况下，
22、系统就开始对箱体抽真空，当压力达到某一数值时，没有冻结好的部分就开始蒸发沸腾，产生放热现象，而其本身温度急剧下降，到达共晶点温度时，产品冻结，随之开始出现爆瓶脱底现象,随着压力的继续下降，温度也相应下降。冻干机的真空泵达到0.1mbar以下，样品温度达到-40左右。由于西林瓶底与下部的板层没有以上的蒸发冷冻特性，在短时间内西林瓶承受不了如此大的温度差而导致西林瓶冷爆脱底,措施 解决冷爆脱底问题需要生产人员严格执行预冻参数，确认将制品冻结实后再抽真空,4.制品上升与箱体的真空度有关，在升华过程中，泵组真空度很大时，突然打开大蝶阀，箱内真空度会突然大幅度上升，从而导致制品上升,5.剩余水分剩余水分
23、偏高的原因（1）样品的装量过多，样品层过厚（2）干燥过程中供热不足，使其蒸发量减少（3）真空度不够，水蒸气不能顺利排出,（4）冷凝器温度偏高，不能有效地将水蒸气捕 集下来（5）冻干周期较短（6）压塞时制品温度低于箱体，真空度未达到标准而出现制品吸潮,剩余水分对疫苗的影响（1）水分含量过高，样品可能碎裂，且在极微量的剩余水分存在的情况下，脱氨基的降解会继续，促使蛋白失去活性的速度加快（2)水分含量过低，可能发生聚合、不适当的重组和活性损失（3）疫苗质量的稳定在水分太多和太少之间需要达到一个平衡，适宜的剩余水分（12%）,措施：（1）按样品体积调整西林瓶规格，减少装液厚度，一般应控制在1015mm（2）加强热量供给，促进水分蒸发（3）检查真空度不高的原因，排除泄露点或真空系统的异常,（4）降低冷阱温度在-60以下（5）延长二次干燥时间，确保制品含水量合格（6）对放入箱内的气体要进行除菌及脱水干燥处理，尤其是易吸潮的制品更要注意（7）制品压塞时的温度应与箱体温度一致,6.制品厚度 一般应为1015mm。过厚，干燥时间过长，而且容易造成制品离壁、萎缩、结块以及致使病毒失活,通过上述几方面的分析，影响疫苗的耐老化试验因素很多（1）抗原制备与标准（2）原材料的选择、配制、灭菌、保存以及配苗等（3）冻干曲线的优化和企业冻干机的性能（4）标准操作程序SOP,谢谢！,
