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1、第三章 污染物的生物效应检测,2023/1/15,提纲,第一节生物测试及方法第二节一般毒性试验第三节生物的分子和细胞水平检测第四节生物致突变、致畸和致癌效应检测第五节微宇宙法,第一节生物测试及方法,生物测试的定义生物测试的方式生物测试的标准化,1.1 生物测试的定义,生物测试（Bioassay）系统地利用生物的反应测定一种或多种环境污染物或环境因素单独或联合存在时，所导致的影响或危害注释1：所利用的生物反应包括分子、细胞、组织、器官、个体、种群、群落、生态系统各级水平上的反应。注释2：生物测试不同于常规的物理、化学检测。前者能够测定污染物对生物机体的影响，而后者只能测定污染物的浓度。,短期生物
2、测试（Short Term Bioassays）主要用于测定LC50、IC50、EC50，用来快速估计污染物的毒性，评定几种不同毒物或废物对某种生物的相对毒性或评定不同生物对不同条件如温度、pH的相对敏感性等。多数采用静止式。中期生物测试（Intermediate Term Bioassays）时间为8d到90d，多数情况下为流动式。长期生物测试（Long Term Bioassays）包括全部生活史的生物测试（Complete Lifecycle Bioassays）和部分生活史的生物测试（Partial Lifecycle Bioassays）目的是要测定出在持续情况下不造成有害效应的毒物
3、最大浓度或最大允许毒物浓度（MATC）只能采用流动式，要保证试验的环境条件和自然界的季节变化相符合。,1.2 生物测试的方式,1.2 生物测试的方式,测试气体（液体）的给予方式静止式生物测试流动式生物测试（重复循环式、更新式）被测试生物的种类单物种多物种模拟生态系统生物测试,1.2 生物测试的方式,受试生物选择对试验毒物具有敏感性有广泛地理分布和足够的数量是生态系统重要组成，有重大生态学价值实验室内易于培养和繁殖已有较丰富的生物学背景资料对试验毒物的反应能够被测定具有重要的经济价值、旅游价值，考虑与人类食物链的关系个体大小、生活史长短、曾经受污染情况,1.3 生物测试的标准化,影响生物测试结果
4、的主要因素受试生物：受试生物的年龄、生活阶段、尺寸大小、季节、食物等都会影响生物对毒物的敏感性试验条件：温度、水体pH、试验装置、材料实验室：人员操作水平、数据统计分析,标准化,1.3 生物测试的标准化,测试方法标准化的优点增加数据精确度测试可被其他实验室重复各种人员容易进行该测试方便进行数据比较可为环境管理、环境立法提供可靠数据缺点仅能回答普遍性关注的某些问题，对非常见的污染物、易分解污染物和混合污染物等，目前还难于进行。,第二节一般毒性试验,生物毒性的基本概念急性毒性试验亚慢性和慢性毒性试验蓄积毒性试验,2.1 生物毒性的基本概念,毒物：毒物与非毒物之间不存在绝对的界限，通常一种物质只有达
5、到中毒剂量时才是毒物。中毒：机体受毒物作用而表现出的疾病状态。中毒是各种毒性作用的综合表现，包括急性中毒、亚急性中毒、慢性中毒。毒性：毒物引起机体易感部位产生有害作用 的能力。,效应（Effect）也称为作用，指接触一定剂量化学物后，使机体产生的生物学改变。效应是对个体而言的，这种改变可用一定的计量单位表示。反应（Response）指接触一定剂量化学物后，产生某种效应并达到一定强度的个体在群体中所占的比例。反应是对群体而言的，用百分率或比值来表示，如发病率、死亡率等。剂量效应关系和剂量反应关系以剂量为横坐标，以表示效应强度的计算单位或表示反应的百分率或比值为纵坐标绘制散点图所得到的曲线，即为剂
6、量效应关系和剂量反应关系曲线。不同的化学物或同一化学物在不同条件下，其剂量与效应或反应的相关关系不同，可呈现不同类型的曲线,剂量效应关系和剂量反应关系曲线图,表示毒性的常用参数致死剂量（LD）或致死浓度（LC）绝对致死剂量（浓度）LD100（LC100）:引起被测试生物全部死亡的最低剂量（浓度）半致死剂量（浓度）LD50（LC50）:引起被测试生物50%全部死亡的剂量（浓度）最小致死剂量（浓度）MLD（MLC）:仅引起被测试生物个别死亡的最高剂量（浓度）最大耐受致死剂量（浓度）LD0（LC0）:不能引起被测试生物发生死亡的最高剂量（浓度），但发生了其它中毒症状,表示毒性的常用参数最大无作用剂量
7、:用于制定最高容许浓度和最高人体每日摄入量最小有作用剂量（MEL）:中毒阈剂量毒作用带急性毒作用带=（LD50/急性MEL），值越大，引起死亡的危险性越小。慢性毒作用带=（急性MEL/慢性MEL），值越大，引起慢性毒性中毒的可能性越大。半数效应浓度（EC50）半数抑制浓度（IC50）,2.2 急性毒性试验,哺乳动物急性毒性试验资料检索类似试验的LD50（LC50）根据文献设计试验，得到LD100（LC100）和LD0（LC0）继续缩小范围试验，得到LD50（LC50）,2.2 急性毒性试验,哺乳动物急性毒性试验微囊藻对小白鼠的LD50=50500mg/kg,2.2 急性毒性试验,水生生物急性毒
8、性试验鱼类毒性试验藻类急性毒性试验水蚤类急性毒性试验,2.3 亚慢性和慢性毒性试验,亚慢性毒性试验在动物生命周期1/30-1/20的时间内所进行的毒性试验实验动物：与急性和慢性试验中的动物品系相同，健康，年幼染毒剂量：最高剂量不引起大量致死；最低剂量无任何中毒反应 中间剂量介于上述二者之间；设置对照组染毒途径：模拟人类在环境中的染毒方式观察与评价：初步评估靶器官、最大无作用浓度等,2.3 亚慢性和慢性毒性试验,慢性毒性试验哺乳动物的慢性毒性试验实验动物：与亚慢性试验中的动物品系相同，但年龄更小染毒剂量：在LD50的1/1001/20中取3-4个剂量染毒途径：模拟人类在环境中的染毒方式观察与评价
9、：最终确定最大无作用浓度,2.4 蓄积毒性试验,蓄积毒性作用：低于中毒阈剂量的外来化合物，反复多次与机体持续接触，经一定时间后使机体出现明显中毒的表现物质蓄积：污染物进入机体的量大于排出的量，量的积累功能蓄积：污染物反复作用于机体，最终致病，效的积累,2.4 蓄积毒性试验,试验方法蓄积系数法蓄积系数固定剂量每天连续染毒法剂量定期递增染毒法,2.4 蓄积毒性试验,试验方法20天蓄积试验法,2.4 蓄积毒性试验,试验方法受试生物半减期测定法方法：机体接触受试物后，在一定间隔时间内分别 测定血液、尿液或器官组织中该物质的量。,第三节生物的分子和细胞水平检测,生物致死前，其行为、生理、生化已发生反应。
10、因此，可选择分子和细胞水平的指标测定污染物对生物的影响。常进行的检测：加合物测定、一般代谢酶的活性测定、解毒系统酶类诱导作用的检测、抗氧化防御系统检测这些指标都具有测定周期短、灵敏度高的特点，故可以对污染物的环境影响进行更为准确有效的预报。,3.1 加合物的测定,DNA加合物外界物质进入生物体后，经过生物体内酶的作用，转化形成亲电活性中间产物，该产物与DNA链上特异位点结合形成共价化合物，即称DNA加合物。最早关于DNA加合物的研究是Brooks和Lawley于1964年在Nature上关于多环芳烃与DNA形成加合物的报道。DNA加合物在生物体内含量的多少一定程度上反映了化学物质对遗传物质DN
11、A的损伤程度，主要表现在以下几个方面：(1)DNA加合物可以直接造成DNA单链断裂、双链断裂或交联；(2)可以影响DNA的复制过程。,3.1 加合物测定,DNA加合物测定要在大量的正常碱基中检测到含量极低的异常碱基比较困难。伴随分子生物学的发展和仪器分析高新技术的应用，高灵敏度的加合物检测方法越来越多。主要测定方法：色谱/质谱法免疫法荧光法32P后标记法,3.1 加合物测定,免疫法基本原理是抗原与抗体的反应，用抗DNA加合物的抗体（单克隆或多克隆抗体）来检测靶组织中相应的加合物。免疫法最早用来检测DNA加合物是在1988年，Santella等用自己创建的酶联免疫吸附法(ELISA)检测了铸造工
12、人外周血白细胞中苯并(a)芘的终代谢产物二氢二醇环氧苯并(a)芘与DNA形成的加合物。用免疫法检测DNA加合物的方法有竞争性放射免疫测定(RIA)、固相竞争或非竞争性酶联免疫吸附测定(ELISA)、超敏酶促放射免疫测定(USERIA)等。其检测限一般为1个加合物107-8核苷酸，目前已有几十种单克隆抗体可供使用。,3.1 加合物测定,荧光测定法方法以多环芳烃(PAH)为代表的一些具有较强共轭电子结构的化学物所形成的DNA加合物，在光照后可发射荧光，利用这一特性使用荧光法可对DNA加合物定量。荧光法主要包括同步荧光色谱法、激发-发射荧光法、低温激光法、荧光标记法等。其中，Vahakangas等人
13、（1985年）发展出的同步荧光色谱法（SFS）应用最为普遍，这种方法的灵敏度为3-10个加合物/108核苷酸。优缺点荧光法的优点是检测时不需破坏DNA链，且可确定加合物不同的立体异构体及DNA链上不同位点的加合物，还可以研究DNA加合物形成和切除与时间之间的动态关系。然而这种方法所需DNA样品量较大（1001000g），并且使用面窄（许多DNA加合物无荧光性），所以常与其他方法联用。,3.1 加合物测定,32P后标记法32P后标记法是目前应用最广泛的方法，它由Randerath和Gupta等在1981年首先建立。其基本步骤是：将含有加合物的完整DNA降解为脱氧3-单核苷酸；消除正常核苷酸，富集
14、被加合的核苷酸；在T4多聚核苷酸激酶的作用下，将32P标记到被单核苷酸的5羟基端，使之形成3,5-二磷酸核苷；多向薄层层析(TLC)分离出32P标记的加合物；通过放射自显影测定加合物的含量。从标准法建立以后，为了提高灵敏度，又针对第二步陆续发展出一系列新的富集方法，如限量ATP法、丁醇富集法、核酸酶P1/S1富集法、HPLC富集法、二核苷酸/5-单磷酸法。这些方法中以丁醇富集法和核酸酶P1富集法最为常用，它们的区别在于，在第二步中，丁醇富集法采用正丁醇提取加合的核苷酸，而核酶P1富集法则用核酸酶P1将正常的3-单核苷酸去磷酸化，使之不受T4激酶催化，从而仅让加合的核苷酸获得标记。两种方法的灵敏
15、度都可以达到1个加合物/109-10核苷酸，样品用量则只需要110g。,DNA加合物常用检测方法比较方法灵敏度(加合物/108核苷酸)每次分析所需DNA量(g)荧光法 同步荧光法310501000 低温激光法10100100 激发发射荧光法10100100色谱质谱法 色谱质谱法0.11 502000 加速器质谱法0.00010.001 0.0010.01免疫法免疫法101002560放射免疫法110505000 竞争性酶联免疫法10 50 非竞争性酶联免疫法101000.11超敏酶促放射免疫法0.51 255032P后标记法32P后标记法0.10.01 110（据常平，1995、姚群峰等，20
16、00整理）,3.1 加合物测定,3.1 加合物测定,蛋白质加合物测定各种蛋白质也可作为大分子形成化学物质加合物，且形成量与特定化合物的接触程度有关。外周血蛋白（血红蛋白Hb、血清白蛋白）的加合物研究最多。Hb-加合物最常用检测方法有色谱-质谱法和免疫法。灵敏度因化学物质和选用方法不同而异。Hb的生存期在120天左右，因而其加合物可作为中长期暴露的指标。,3.2一般代谢酶的活性测定,乙酰胆碱酯酶（AChE）用于指示有机磷农药当20%乙酰胆碱酯酶被抑制说明暴露作用存在，如超过50%则会威胁生存。测定方法：典型的酶学方法(比色)。腺三磷酶（ATPase）其活性高低代表了生命活动能量的大小测定方法：用
17、钼蓝发测定经酶水解释放的无机磷。,3.3 解毒系统酶类诱导作用的检测,混合功能氧化酶的诱导作用谷胱甘肽硫转移酶,3.4 抗氧化防御系统检测,过氧化氢酶（Ct）谷胱甘肽过氧化酶（GPx）,第四节生物致突变、致畸和致癌效应检测,致突变效应致畸效应致癌效应,4.1 致突变效应,突变：遗传物质发生了基因结构的变化（致突变作用、致突变物）基因突变染色体畸变致突变物作用于生殖细胞的效应显性致死突变引起后代的先天性遗传缺陷,4.1 致突变效应,致突变试验体外（In vitro）基因突变试验Ames试验哺乳动物体细胞株突变试验细胞遗传学试验染色体畸变试验微核试验体内（In vivo）基因突变试验显性致死突变试
18、验果蝇伴性隐性致死试验DNA损伤试验姐妹染色单体交换试验DNA修复合成试验,4.1 致突变效应,致突变试验体外基因突变试验Ames试验（鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验法）,Ames试验原理同一种微生物的营养缺陷型突变型菌株与受试物接触，若此化学物质具有致突变性，可使突变型微生物再发生一次突变，重新成为野生型微生物。这种突变叫做回复突变。鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验法方法原理：在动物体外将待测物经肝微粒体酶系活化后，检测其所诱发的沙门氏菌回变菌落数，即由不能自行合成组氨酸的营养缺陷型突变菌株（his），回复为能自行合成组氨酸的（his）菌落数。突变率诱发回复突变菌落数/自发回复突变
19、的菌落数（对照）当突变率大于2.0时，为阳性结果。,4.1 致突变效应,致突变试验体外基因突变试验哺乳动物体细胞株突变试验,V79、CHO,4.1 致突变效应,致突变试验细胞遗传学试验染色体畸变试验,4.1 致突变效应,致突变试验细胞遗传学试验微核试验：微核是在细胞的染色体发生断裂后,细胞进入下一次分裂时,染色体片段不能随有丝分裂进入子细胞,而在细胞质中形成直径小于主核的,嗜色与主核一致,完全与主核分开的圆形或椭圆形核。,蚕豆根尖微核试验已列入我国的标准化环保法规环境监测技术规范。,4.1 致突变效应,致突变试验体内基因突变试验显性致死突变试验,4.1 致突变效应,致突变试验体内基因突变试验果
20、蝇伴性隐性致死试验,4.1 致突变效应,致突变试验DNA损伤试验姐妹染色体单体交换试验,很多化学突变物能够大幅度提高姐妹染色单体的交换率Brdu 胸腺嘧啶核苷的类似物,4.1 致突变效应,致突变试验DNA损伤试验DNA修复合成试验,羟基脲可抑制正常的半保留复制合成，那么剩下的只有修复合成,4.2 致畸效应,致畸作用：致畸物通过母体作用于胚胎而引起 胎儿畸形的现象。化学致畸作用机理：突变引起胚胎发育异常对细胞的生长分化较为重要的酶类受到抑制母体正常代谢过程被破坏细胞分裂受阻致畸作用的毒理学特点不同发育阶段的胚胎的敏感性不同种属差异较为明显,4.2 致畸效应,试验方法,致畸试验的目的检测环境污染物
21、能否通过妊娠母体引起胚胎畸形。一般试验动物要求其对化学物质的代谢过程与人相似，胎盘结构也相似，还要求孕期短，产仔多，经济实用，如家兔、大鼠、小鼠等。,4.2 致畸效应,致畸作用的评价应对试验结果进行统计综合分析应采用同种动物的重复试验并比较多种动物试验结果的一致性区分自然畸变和致畸畸变动物的种属差异导致畸变敏感性不同,4.3 致癌效应,化学致癌作用：化学物质引起肿瘤的过程。化学致癌物：能诱发肿瘤的化学物质。化学致癌物的特点在体内也进行生物转化，致癌试验一般可见剂量-反应关系；也受受试动物种属品系及环境因素影响；生物学效应具有持久性和迟发性；动物试验中，剂量相等时，多次给于比一次效应大；机理上，
22、一般都和细胞的遗传物质或其它大分子的相互作用有关。,4.3 致癌效应,细胞癌变形成的原因体细胞突变学说：致癌物使正常体细胞的DNA发生突变，造成细胞功能异常分化障碍学说：DNA未必突变，但细胞分化过程的相关基因调控受到干扰，使细胞分化和增殖紊乱癌基因学说：所有细胞都有癌基因，正常情况被阻遏，调节机制遭到破坏后，癌基因表达导致癌变。癌变过程引发阶段促长阶段浸润和转移阶段,4.3 致癌效应,试验方法短期筛检试验（体细胞突变学说）各种致突变试验方法长期动物诱癌试验慢性试验方法,第五节 微宇宙法,微宇宙法简介标准化水生微宇宙烧杯水生微宇宙室外水生微宇宙土壤核心微宇宙模拟农田生态系统,5.1 微宇宙法简
23、介,微宇宙（Microcosm）法（模拟生态系统法）研究污染物在生物种群、群落、生态系统和生 物圈水平上的生态效应的一种方法微宇宙是自然生态系统的一部分（包含生物和非生物的组成和过程，能提供生态系统的群落结构和功能）；但又不完全等同于自然生态系统（不包含所有的组成和过程）。微宇宙应用于污染生态系统中，可以研究：污染物对生物和非生物组成的影响；在生物和非生物组成中的分布；对生物之间或生物与非生物之间相互关系的影响；生物和非生物组成及其过程对污染物生物效应的影响。,5.1 微宇宙法简介,微宇宙法分类自然微宇宙：直接来自自然生态系统的一部分人工微宇宙：根据研究需要组建（开放式、封闭式）陆生微宇宙水生
24、微宇宙（烧杯、河流、池塘等）,5.2 标准化水生微宇宙,简称SAM，Frieda Taub及其同事建立。用于在实验室测定有毒物质在多物种水平对淡水生态系统的影响。试验时间64天，容器为4L的玻璃广口瓶，试验生物包括10种藻、4种无脊椎动物、1种细菌。对温度、光照强度、光暗比等理化参数均有具体要求。设置6个平行实验组，每组3个处理和1个对照。测量参数包括溶氧、营养物浓度、光合作用、呼吸作用、pH、各种生物的生物量等。,5.3 烧杯水生微宇宙,又称烧杯混合培养（MFC），经过6周建立稳定后，试验时间为1214周，容器为1L的玻璃广口瓶，试验生物包括4种藻、2种无脊椎动物、一些细菌和原生动物。对温度
25、、光照强度等理化参数均有具体要求。与SAM不同的是通过加入来自生态系统浸出液提供给微宇宙中生物群落所需的基质。,5.4 室外水生微宇宙,又称中宇宙（Mesocosm），试验单元6 m3，试验生物包括浮游植物、浮游动物、鱼类、大型水生植物和无脊椎动物。控制重复组温度统一的方法：以土壤为温控器，地埋；以水为温控器，浸入池塘。缺点：设置在特定地区的室外，因而受地区环境因素影响较大；试验生物多为地方种，其结果仅能表明毒物在一个地区的生物效应和归趋。,5.5 土壤核心微宇宙,塑料管高60cm直径17cm,土壤核心：取自20cm的表层土；研究对象（试验生物因土壤核心采集场所不同而不同）：植物、土壤无脊椎动物、微生物,用于研究外源性化合物对农业生态系统及生长的植物、土壤无脊椎动物和微生物的影响。该法采用野外环境的土壤核心，将其设置在环境条件控制的实验室中，并且实验室要建立在植物温室中。需专门化设备和足够经费。,5.6 模拟农田生态系统,系统可用于测定：农药的挥发性、残留性下雨对农药迁移的影响植物对农药迁移的影响,该系统模拟农田条件，无陆生动物。采用0.75 m3的矩形玻璃室，可打入足够数量的空气，通过玻璃室模拟微风并能收集挥发的农药。,
