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1、制片技术是生物科学中必不可少的研究手段，在生物科学的领域中占有重要的地位，现在已经成为生物学工作者必须掌握的一门技术。生物制片技术简单地说就是要利用各种方法将生物体或者组织、器官制成适合于显微镜下观察的薄片，并要显示出清晰的显微结构的一门技术。,第五章 生物显微制片技术,一、生物制片的分类,根据所制成片子保存时间的长短分类:临时制片 永久制片根据其制作的方法分类：活体观察 切片法 非切片法,1、活体观察,活体观察是将生物体的个体或者其一部分，就其生活状态置于载玻片上加一滴水和盖玻片或放置于培养皿中直接进行镜检，从而达到预定的检查目的 优点：简便省时；可观察到活体的情况；不需要什么特殊设备。缺点
2、：未经其它处理，材料或者过厚阻碍光线通过，或者无色透明难以区分，结果不能令人满意。,2、切片法,切片法是利用锋利的刀具(简单的刀片或复杂的切片机）将材料切成薄片 徒手切片法(free hand section)滑走切片法(sliding section)火棉胶切片法(celloidin method)冰冻切片法(freezing method)石蜡切片法(paraffin method)超薄切片法(电镜切片法)(electron microscopic section method)振动切片法,徒手切片法,利用刀片或有柄剃刀徒手将材料切成薄片后置于载玻片上进行活体观察，或经过一系列药品处理，制
3、成永久片子。此法常做临时制片，必要时也可作成永久制片。方法简便、快速，要求设备简单。徒手切片技术要求熟练，才能切出符合要求的薄片，切片厚度为20-25um。,切取的标本,材料和夹持物,滴水,放置标本,加盖盖玻片,叶的横切,徒手切片法,蓖麻茎厚角组织和花青素，未染色,徒手切片法示海桐花嫩茎初生结构,滑走切片法,滑走切片法(sliding section)：是用滑走切片机进行切片，可以获得一定厚度、完整和均匀的切片，主要用于切一些硬质材料（如木本茎、枝条、骨质等），不需要包埋的过程，但也可以切包埋的材料。切片厚度为1-25um。,德国Leica公司SM2000R滑走切片机,滑走切片法,锦鸡儿的次生
4、木质部，番红染色,火棉胶切片法,火棉胶切片法是利用火棉胶作包埋剂，使组织材料包埋在火棉胶中，再行切片的方法。火棉胶易溶于酒精和乙醚的等量混合液，其溶液不溶于氯仿（包括含有氯仿的混合液），遇氯仿即变硬，利用这一性质，经固定的材料，脱水后，浸入由等量酒精和乙醚配制的火棉胶溶液中透胶、包埋、再置于氯仿中使其硬化，制成包埋块，便可行切片、染色等步骤。火棉胶切片法与石蜡切片法相比较，能减少组织收缩，但是所需时间较长及制成连续切片手续麻烦。,冰冻切片法,冰冻切片法是将已固定或新鲜的组织块不经脱水先进行冰冻，然后在切片机上进行切片的一种方法。冰冻切片法具有手续简单、制片速度块并能完整保存细胞结构及生物大分子
5、活性（如脂肪、酶等）的特点，常用于临床上的病理快速诊断及原位杂交或细胞化学的制片。切片厚度为10-50um。,德国Leica CM3050S冰冻切片机,石蜡切片法,石蜡切片法是动物、植物和病理组织切片制作上最重要、最常用的一种方法。石蜡切片法就是将材料经过各种处理，包埋于石蜡中，然后在切片机上切成薄片，最后制成永久制片 一般的材料都可以使用石蜡切片法（除了藻类、菌类、木材外），它既可以制成较薄的切片，使材料各部分清晰可见，同时也可制连续切片，观察材料的动态发生及层次。切片厚度为5-15um。,石蜡切片法,洋葱根尖细胞有丝分裂，铁矾-苏木精染色,石蜡切片法,花生老根横切面，番红-固绿双重染色,石
6、蜡切片法,南瓜茎横切面，番红，固绿和橘红G三重染色,小白鼠肝脏细胞,石蜡切片法,莴苣瘦果石蜡切片横切面,3、非切片法,所谓非切片法，是指不经过切片手续而作成制片的方法。它与活体观察的区别在于：非切片法常常经过药剂或染色剂的处理，这样组织被杀死后经过染色可作成临时或者永久制片。分类：整体制片法（整体封藏法）：昆虫口器、浮游动物、花粉粒涂片法：血液、粪便伸展法：皮下结缔组织、肠系膜磨片法：牙齿、耳石、贝壳压片法：根尖、果蝇唾液腺离析法（组织分离法）：木材纤维（铬酸硝酸）、肌纤维（KOH-HNO3）,整体封固（装片）法,整体封固法就是不必经过切片手续而将整个微小的或透明的生物体或器官封藏起来，制成整
7、体装片的方法。适用于一些小型或者扁平的材料，如单细胞、丝状或叶状的藻类、菌类或蕨类的原叶体、孢子囊、纤细的苔藓植物，种子植物的花粉粒和表皮、幼胚以及其他幼小的器官，原生动物、蠕虫、昆虫的幼胚等不必经过切片手续，就可以显示生物体或生物器官的整体。优点：是能明显地表现出其器官的全部特性；缺点：是由于生物的整体有的是几层细胞，比较厚，不容易看清楚。,整体封固法的分类：根据所用的脱水剂、透明剂和封固剂的不同而有多种方法，包括有甘油法、甘油冻胶法、甘油二甲苯法、松节油法、叔丁醇树胶法、二氧六环树胶法等。,整体封固法,茄叶表皮毛和花青素，未染色,整体封固法,马铃薯淀粉粒,整体封固法,辣椒外果皮细胞和纹孔对
8、，固绿染色,米根霉形态整体装片,菊花花粉粒的整体装片,组织分离法（离析法）,组织分离法：是利用一些化学药品或者酶的作用把生物细胞间的胞间层溶解，是生物组织的细胞分离开来，从而得到单个完整细胞，以便在显微镜下观察细胞的立体形态结构。缺点：是由于组织的细胞间彼此分离，细胞间的关系无法显示，也就不可能了解整个组织的结构。,离析法,杨茎的木纤维和导管分子,组织分离法,叶片表皮细胞及气孔,压片法,压片法（压碎法）：是把动、植物的器官或组织经过处理后压在载玻片上，使细胞成一薄层，以便进行观察。压片法为细胞学、遗传学研究较为理想的方法，主要用于染色体的形态观察、染色体计数、细胞分裂观察等。,压片法,莴苣染色
9、体,磨片法,一些含有矿物质的比较坚硬的动物组织要作成玻片标本时，常把材料直接放在砂石上磨成薄片，此法即为磨片法。如珊瑚的骨骼、软体动物的贝壳，脊椎动物的硬骨、角以及牙齿等都可以用此法制成玻片标本。,三、生物制片的总体原则,各种生物制片方法各有优缺点，应用时根据具体情况，决定选择哪一种制片方法，必要时可以相互配合，以发挥制片技术的效果。因此，要根据观察的目的，材料的性质而决定采用何种制片方法。,四、生物制片的基本要求,要尽量保持材料原来结构的真象；切片要根据观察的目的切成适当的厚度；无论运用何种染色方法，都要使内部结构清晰易见；制成的片子要保持长久、不褪色、不变形。,五、生物制片的基本程序及原理
10、,以石蜡切片法为例说明基本程序选材；杀死、固定及保存；冲洗与脱水；透明与包埋切片染色；透明与封藏,1、选材,选材的原则：选材时，应根据实验的目的、要求，决定选取生物体的哪一部分；确定选择哪一部分后，应注意选择有代表性的材料，材料要求新鲜、准确、完整，材料要避免挤压、挫伤、干枯、病、虫等危害、生长不良；取材时，在有代表性的基础上，材料宜小不宜大，动物组织的切片，厚度不超过3mm，体积不大于1.5cm 1.5cm0.5cm，植物组织应根据试剂情况，细的茎和窄的叶片可切取3-5mm长一小段，粗的根、茎或宽的叶片，也可以切取一部分进行固定。,所采集材料应立即放入固定剂，并编号，注明采集时间、地点、名称
11、、组织部位，所取组织块要大小适当，即要能说明问题，又要考虑固定剂的穿透能力。一般组织学取材稍大，细胞学取材稍小，植物组织取材稍小，动物组织取材要稍大。,2、杀死,杀死：指用物理或化学的方法，迅速地终结生物组织的生命，不仅要求生物体立即死亡，而且还要使每个细胞差不多同时停止生命活动。植物体：直接割取所需部分，但需要足够快；动物体：断头法、木棒猛击头部使它昏倒、动物麻醉以后，割取材料；不论是植物还是动物在切取材料之前，应先把材料用水冲洗干净（如观察菌类寄生状况的材料，则不应经水冲刷），然后将材料切成小块。,2.1 动物的麻醉和杀死,从活的动物体上采取材料不象采集植物材料那么容易，因为在不施加麻醉的
12、情况下，有的动物会收缩(如蚯蚓、水蛭)，有的会骚动(如蛙、鼠)，使我们无法下手。但制片所需的材料又要求越新鲜越好，尤其是细胞学方面的研究对材料的新鲜程度要求更严。因此，要割取生活着的动物组织，在一般情况下，就要对动物施行麻醉，然后再割取材料加以固定。但是，所用的麻醉药品，必须以不影响细胞结构为原则。,若是一般的组织学制片，要求不太严格的话则可将动物先杀死然后速取其组织进行固定。蛙、蟾蜍、鼠等较小的动物，可用断头法杀死，即用普通剪刀剪断颈部。较大的动物，如大竺鼠、免、猫等可用木槌猛击头后部，使其昏倒，或用50m1的注射器从耳静脉向心脏注入空气，使动物发生急性空气栓塞痉挛而死。,上述动物若需麻醉后
13、取材，则可用脱脂棉球蘸氯仿或乙醚、置于动物的鼻尖部，令其吸入麻醉。大动物(狗、猴等)应用氨基甲酸乙酯作静脉注射麻醉剂量一般为每kg动物体重用1g。麻醉后的动物也需放血后进行取材固定。昆虫等小动物可投入充满氯仿或乙醚蒸气的大口瓶中，令其麻醉。若要杀死，可将其投入含氰化钾的毒瓶中。,2.2 动物组织块的切割,割取动物组织块时，需注意以下几点：第一，要考虑所取的材料应包括各脏器的重要结构或全部结构，如消化管就应包括粘膜、粘膜下层、肌层和外膜四层结构。若所取的器官太大，不易全部制片时，则可切取能代表该器官的部分材料，如狗的肾脏，可切取包括皮质、髓质和肾盂的一部分为材料。第二，应注意切割方向如在管状器官
14、(肠等)取材时，一般是取其横切面制片，但要观察小肠的环行皱壁时，就应取其纵切面制片。第三，组织块必须切得小而薄。细胞学制片的组织块不能超过2mm，一般组织块的大小以0.5*0.5*0.2cm为宜，柔软组织不易切小,可先取稍大的组织块固定2-3h。等组织稍硬后再切成薄的小块继续固定。,3、固定和保存,固定：在杀死的基础上，把组织或细胞按生活状态固定下来，使其在制片的任何过程中都不会发生变化。固定是制片极为关键的一个步骤，制片质量的优劣。除与材料的新鲜程度有关外，还取决于最初的固定是否适当和完全。保存：材料经过杀死、固定后，需要把组织或细胞的结构长久保存下来，不至于发生溶解等其他现象。,杀死和固定
15、的关系,杀死和固定两者之间的关系极为密切，是两个不同的步骤，但又是相互统一、相互作用的过程。常用的杀死剂，一般都兼作固定剂，常用的固定剂，一般都具有杀死的作用。我们常用的固定剂有的兼作保存作用，例如FAA，材料可长期保存于该溶液中几年或更长时间，也不会变坏。有的固定剂如苦味酸类，在固定作用完成之后必须更换保存液，否则材料变坏。通常所用的保存液为70的乙醇溶液，一般材料在其中可保存较长时间。,固定目的,迅速地杀死原生质，防止组织自溶和腐败；使细胞内的蛋白质、糖、脂肪等各种成分沉淀保存下来从而保存细胞的各种组成成分使其保持与生活时相近似的形态和结构；因沉淀及凝固的关系，使细胞内不同的成分产生不同的
16、折光率，增加细胞结构及其内含物的折光程度，造成光学上的差别使原来在生活情况下看不清楚的结构变得清晰易见，便于在显微镜下观察；凝固组织中某些部分，使材料适当硬化，便于切片；促进植物组织对一些染色剂的着色力。固定剂可使材料本身起一些物理上或者化学上的变化，这些变化会导致材料对某些染料亲和力的增强和对另一些染料亲和力的减弱，因此在选用固定剂时应事先考虑到以后用何种染料染色，尽量使固定剂和染色剂相互配合，取得良好的染色效果。,固定方法,取到新鲜的材料，应按材料的种类、大小、性质和制作要求，进行固定。固定有物理方法和化学方法两种。物理方法固定有干燥、高热和低温骡冷等。例如，血液涂片就是干燥固定；细菌涂片
17、可用加热法固定；许多组织化学反应的制片是以低温骡冷固定作冰冻切片的。化学方法固定就是用化学试剂配制成固定液使之固定。,固定时间,视材料的种类、大小、性质、固定液的种类与性质、渗透力的强弱等而定，可以从1-2h到十几或二十几小时，甚至可以长至几天。,固定作用的原理,物理作用：即沉淀作用。例如油类和脂肪等遇到饿酸即发生褐色沉淀。但应指出，某种沉淀发生后又能溶于水，这样就不能认为是固定。化学作用：根据作用机理的不同又可分为凝结作用、交联作用、络合(螯合)作用三种。,化学作用,凝结作用：例如细胞内的蛋白质，遇到酒精即凝结成块状，发生不可逆的的变化，以后所有的处理都不能使其变形或者溶解。交联作用：组成细
18、胞的许多高分子化合物，在一定条件下(一般为酸性)可和甲醛发生交联作用，即甲醛在这些高分子当中形成了共价结合，减少了分子间相对滑动引起的结构不可逆变形，使组织、细胞产生稳定的结构。络合(螯合)作用：许多固定液中含有能起络合(螯合)作用的金属离子，如铬等，可与组成细胞的高分子化合物上的羟基等发生络合(螯合)作用，使组织细胞的结构保持稳定，络合(螯合)作用一般是不可逆的。,较理想的固定剂应具备的条件（1）,有较强的渗透力，能够迅速、均匀地进入到材料当中杀死原生质，固定其细微结构，以后经药品处理也不会发生收缩或膨胀现象；不改变原生质原来的体积(膨胀或收缩)；增加细胞结构及其内含物的折光率，使各部分清晰
19、可见；,较为理想的固定剂应具备的条件（2）,增加材料的着色能力，起媒染作用；使组织适当变硬，适于切片，但又不使材料过于硬化而松脆；固定剂同时亦应是保存剂，可长久保存材料而不至于发生变化。,固定的注意事项（1）固定的材料越新鲜越好。因此，采集或割取后须立即投入预先准备好的固定液中进行固定，切勿耽误。一般固定液，都以新配为好，配好后应贮存在阴凉处，不宜放在日光下，以免引起化学变化，失去固定作用；有些混合固定液的成分之间会发生氧化还原作用，一定要在使用前才混合。如果混合太早，固定时就没有作用了；固定材料时，固定液必须充足，一般为材料的2030倍，有些水分多的材料，中间应更换12次新液；,固定的注意事
20、项（2）外有被膜，而内部站构又极易松散的器官，应将整个器官投入固定液22h后，再将其修成小块材料继续则定。含行粘液、污物或血液的材料需用生理盐水洗净后再行固定。不能沉入固定液的材料应进行抽气；藻类、菌类以及其它柔软的植物体可直接投入固定液中；材料投入固定液后须经常摇晃。材料固定完毕后，保存于严密紧塞或加盖的容器里，同时在容器外贴上标签，并随同材料在溶液中投入相应的标签，以免相互混淆。标签上注明固定液、材料来源、日期等。标签上的文字，应用黑色铅笔绘图黑墨水书写。,固定相,酸性固定相：即在酸性固定剂中可使细胞分裂间期的染色质、核仁、纺锤丝等保存下来，细胞质固定成索状海绵质，核质和线粒体被溶解掉。碱
21、性固定相：在碱性固定剂中和酸性作用相反，使分裂间期的染色质和纺锤丝被溶解，而核质和线粒体则保存下来，细胞质固定成透明状态，液泡也可保存。,常用固定剂简介,按是否可使蛋白质沉淀分为：凝固型固定液：使蛋白质沉淀；非凝固型固定液：使蛋白相互胶联；按固定液的组成可分为：单纯固定液：成分单一；混合固定液：两种或两种以上成分。一般而言：非凝固型固定剂优于凝固型，混合型优于单纯固定剂。,凝固型固定剂,酒精：渗透力很强，易引起组织收缩，固定用的适宜浓度为70。铬酸：易潮解，为强氧化剂；但渗透力弱，易使组织发生收缩；一般与其他成分混合；苦味酸：渗透力弱，易使组织发生收缩，易爆炸；一般与其它成分混合使用；一般用5
22、0%，70%酒精清洗；醋酸：渗透力强，可使组织产生膨胀作用；,非凝固型固定液,甲醛：气体，在水中的溶解度为38左右，很好的硬化剂，强还原剂；渗透力弱重铬酸钾：强氧化剂，强硬化剂，渗透力弱，常与其他固定剂配合使用；饿酸：强氧化剂，中性，渗透力极弱，电镜固定常用的固定剂，也是唯一能固定脂类分子的最好的化学固定剂。,多聚甲醛：白色固体，固定能力较弱，可以保持酶及蛋白的活性，免疫荧光定位常用，一般用缓冲液配制成40的固定液；戊二醛：能与蛋白质分子的氨基和肽键连接形成交连，是最常用的非凝固型固定剂，可以部分保持酶和蛋白质的活性，固定能力比甲醛强，常用于电镜制片的固定，用缓冲液配制。,混合型固定液,混合型
23、固定剂的混合原则：优缺点互补；膨胀与收缩相互平衡；强氧化剂与还原剂应分别配置。,酒精甲醛液 70酒精 100ml 甲醛 210ml特点：不易收缩，过去常用于固定花粉管甲醛醋酸酒精液(FAA)50%或70酒精 90ml 冰醋酸 5ml 甲醛 5ml特点：过去称”标准固定液“或”万能固定液“；是组织形态中常用的固定液；同时兼作保存液。是植物制片技术中较为良好的固定液和保存液。除单细胞和丝状藻类外，均可用此液固定也通用于昆虫和甲壳类的固定。,酒精醋酸液，其中常用的为卡诺氏固定液纯酒精 15ml冰醋酸 5ml特点：具强渗透力，作用迅速，常用于染色体压片法的固定。铬酸醋酸甲醛液，又名纳瓦兴氏液（Nawa
24、shin),1912年首创。常用为冷多夫（Randoph)改良液，分为甲乙两部分，用前等量混合。甲液：铬酸 15g 冰醋酸 10ml 蒸馏水 90ml乙液：甲醛 40ml 蒸馏水 60ml特点：渗透慢，不能长期保存，主要用于显示分裂相，一般用海氏苏木精或番红结晶紫桔红G三重染色。,苦味酸液（波茵氏液）甲液：1铬酸 50ml 10醋酸 20ml乙液：甲醛 25ml 苦味酸饱和水溶液 75ml是常用的良好固定液，广泛应用于一般动物组织、昆虫组织、无脊椎动物的卵和幼虫，以及胚胎学材料的固定。也适用于裸子植物的雌配子体和被子植物的胚囊的固定。此液穿透迅速而均匀，使组织收缩少，不使组织变硬变脆，着色良好
25、。一般动物组织固定1224h，小块组织数小时即可。固定后直接入70酒精中洗去黄色，但留一点黄色对染色并无妨碍。植物材料的固定时间为1248h。,固定液的发展过程：单纯凝固型固定液混合型固定液用缓冲液配制的非凝固型固定液固定方法的发展方向：非固定的活体观察法：如荧光探针显微注射法，绿色荧光蛋白标记法等，与Confocal配合使用。快速冷冻及冷冻置换方法（Rapid freeze/freeze substitution RF/FS),80年代新发展起来的物理固定方法。基本方法：先用快速低温处理材料，然后在低温下用饿酸、戊二醛等进行置换。优点：对细微结构尤其是膜结构的保存性好，首先在电镜制片中应用，
26、现在光学显微镜制片也有应用。,4、冲洗,冲洗目的：组织在固定后一定要把渗透到里面的固定液洗去，然后再进行下一步过程。为防止组织中留有较多的固定液而影响脱水剂，甚至可在组织中发生沉淀物或结晶而影响观察，特别是对陈旧标本更应流水冲洗，尽可能减少组织中的酸性程度和甲醛色素。对于混合性固定液，更应及时洗涤，有利于脱水直至切片和染色。冲洗时间：根据固定液的种类及材料的性质、大小而定，一般24小时足够,冲洗方法1,固定剂以水配制者 用流水冲洗，可使组织中的固定液随时溢出和随时洗去。常用的固定剂是甲醛液（10%甲醛水溶液），大组织冲洗时间为24h左右，小组织冲洗时间为210h。冲洗时间基本根据固定时间长短而
27、定。,冲洗方法2,固定剂含乙醇者 乙醇或乙醇混合液固定者，一般不要求冲洗，如需冲洗必须采用与固定剂中的乙醇浓度相近的乙醇冲洗，不可用水冲洗，也不应用浓度相差很大的乙醇冲洗。材料从固定液中取出后，可直接投入贮有适量乙醇的小瓶内。材料与乙醇的比例，应以1:10为准。洗涤次数与时间的长短依组织块的大小和性质、固定液的种类和固定的时间等条件而定。组织块较大而坚韧、固定时间较长的，则洗涤时间也较长。一般在开始换洗的前两次中，每次间隔时间可短些，约2030min，以后几次可延长到l2h，最后可在70%酒精中过夜。,几种常用固定剂的特殊洗涤法,1重铬酸钾 用重铬酸钾固定的组织可用流水冲洗1224h，或用亚硫
28、酸或1%含氯水溶液进行洗涤。2锇酸 流水洗涤1224h，组织必须洗干净，否则影响染色。3苦味酸 用50%或70%乙醇浸洗。一般不水洗。苦味酸所留的黄色，在70%乙醇中可自行脱去。即使不能完全脱去，在以后制片脱水中经各级乙醇也会渐渐消失，即使组织中留有少许黄色也无妨碍，并不影响染色。洗涤时也可在乙醇中滴入少量碳酸锂饱和水溶液，直至乙醇不变颜色为止。,4氯化汞 用氯化汞固定的组织内常有一种沉淀物生成，必须洗去即脱汞，否则会使组织发脆或染色不良。脱汞的方法是：用0.5%碘酒溶液（70%乙醇配制）逐渐反复加入70%乙醇中，直至乙醇中加入碘的黄色不褪去为止，此时表示组织内氯化汞已完全被洗去。最后用硫代硫
29、酸钠或70%乙醇洗去碘。,5、脱水,脱水的目的：完全除去材料中的水分，使其它药品如二甲苯、氯仿等易于渗到材料中去；使材料适当变硬，切片时不变形。脱水的药品必须具备两个特点：亲水力很强，能和水成任意比例混合，以取代材料中的水分；能和其它有机溶剂（如透明剂、包埋剂及封固剂等）相互混合、取代。,常用脱水剂,乙醇（ethyl alcohol）叔丁醇(tertiary buthyl alcohol)丙醇(acetone)氧化二乙烯(doxan)甘油(gnycerin),脱水的时间，可根据组织的类型，大小而定；脱水的过程：一般是35%乙醇50%乙醇70%乙醇80%90%100%100%；脱水应逐步而不应跨
30、越太大进行，否则将引起组织强烈的收缩或变形，在经无水乙醇处理时，应保证试剂的纯度；每级脱水时间，依照材料的大小、性质以及留在固定液中的时间长短和固定液的溶解性而定。一般植物材料每级脱水1-2h，甚至更长。动物组织每级1030min。注意：脱水应彻底，否则与二甲苯混合后混浊，必须倒回重脱水且效果不好；如需过夜，则停留在70%酒精中。,6、置换与置换剂,置换（透明）：是指材料在除尽水分后，还要经过一种既能与脱水剂又能与包埋剂相溶的溶剂来处理，以便于包埋剂的渗入，同时还可使材料透明干净，增加折光系数，便于观察。置换剂使用的根本原因：脱水剂与我们所用的包埋剂和封固剂多不相溶，因此必须用置换剂把脱水剂脱
31、尽后才能进行包埋或封固，透明往往只是其附带的作用。,置换注意事项：置换过程也是渐次由低浓度到高浓度；使用置换剂时，要随时盖紧盖子，以免空气中的水分进入；更换每级置换剂，动作要迅速，一方面为了不使材料快干涸，另一方面能避免吸收湿气；在透明过程中，如果材料周围出现白色雾状，说明材料中的水未被脱尽，应退回纯酒精中重新脱水，然后再置换。,常用的置换剂：二甲苯：传统石蜡制片常用，为无色透明液体，易挥发，。其折光率为1.497。能溶于醇及醚，不溶于水，透明能力强，是目前制片应用最广的一种，作用迅速，可溶解石蜡、加拿大树胶等，缺点是有毒，长期接触对呼吸道粘膜有刺激作用，易使材料发生收缩变脆，使用时材料必须彻
32、底脱尽水分，否则易发生乳状混浊。氯仿：一般火棉胶制片法常用，使材料收缩不太强烈，并易挥发除去，但渗透力较弱，透明慢，能破坏染料，因此不宜在染色后置换。,过程为：1/3二甲苯+2/3乙醇混合液1/2二甲苯+1/2乙醇混合液2/3二甲苯+1/3乙醇混合液二甲苯二甲苯脱水不净，用二甲苯透明后，将发生下列不良后果：（1）材料：材料内仍留有微量水分，二甲苯就进不去，因此石蜡也不能透入，切片后将在蜡片上出现空洞，影响结果。（2）切片：切片内留有微量水分，在封片以后，就会发生乳白色的云雾状，在显微镜下观察时，可见许多密集水珠把组织掩盖，切片就作废了。,二甲苯透明注意事项,二甲苯必须保持无水，无酸。若用一二滴
33、石蜡油滴入其中，立即出现云雾状，即表示其中已含水分，不能再用。二甲苯极易挥发，故在切片透明之后，从染色缸中取出封片，动作要敏捷，不宜在空气中久置，否则待二甲苯挥发完后，组织就变硬发白，即使再加树胶封藏，由于树胶不能浸入组织，封后也无用处。二甲苯极易吸收空气中的水分，故在湿度大的天气，贮有二甲苯的染色缸的盖子周缘可涂少许凡士林，以防止水分的渗入。在封片时也不宜将口鼻过分靠近切片，以免水气侵入切片，出现白色云雾状。,7、渗透和包埋,渗透的目的：以包埋剂彻底取代材料中的置换剂，以便进行下一步包埋。渗透的要点：是使包埋剂完全浸入细胞的每个部分，即使空泡内也要完全渗入；同时要使包埋剂紧密地贴在细胞壁的内
34、外，成为不可分离的状态，而便于切片渗透的原则：一般而言，从低温到高温，从低浓度到高浓度，逐渐进行。渗透的时间：根据不同组织类型及其大小而定，基本上与组织固定时间成正比。对细胞体小，密集，纤维成分少的组织，如肝、脾、骨髓应减少时间，含脂肪和纤维成分较多的组织需增加时间。,包埋及包埋剂,包埋：使包埋剂与材料固化为一体，以便于切片。包埋剂在制片过程中的重要作用：包埋剂往往决定了制片的其他试剂及过程，制片方法往往以包埋剂命名，如石蜡制片法，火胶棉制片法等。,常用的包埋剂：石蜡：具有不同熔点，通常在42C-60C之间。乙二醇甲基丙烯酸脂 GMA：水溶性塑料包埋剂，制片过程无须置换剂，可切0.5-2um的
35、半薄切片，清晰度高，无需去掉塑料即可染色，操作简便，可在低温下紫外照射聚合，可以进行组化定位。环氧树脂：常规电镜观察用包埋剂，可做超薄切片，也可做0.5-1um的半薄切片，在适当条件下（加热）也可做组化定位。,至此，一块组织已完成前处理过程，可以切片，前边的步骤看来既无高深的理论，又无复杂的技术，一切看似简单，但一步做不到都会造成整个制片的前功尽弃。我们可以看到：水和酒精可以相溶。酒精和二甲苯相溶。二甲苯和石蜡可以相溶。因为以上相邻步骤所使用的液体均可以互溶，所以保证每一步骤液体能置换完全。水和二甲苯不能相溶，乙醇和石蜡不能相溶，所以如果有一个步骤的处理不彻底，残留的液体带到下一个步骤将不能互
36、溶，最终带到渗蜡步骤中，成为细小的空洞，以至不能成为质地致密的石蜡块，也就切不成良好的切片。,包埋过程中易出现的问题及解决办法,问题：包埋后的石蜡块应为均匀半透明状，有时出现白色浑浊结晶（像雪花一样）部分，这样在切片时就有妨碍，不易切出薄的切片。原因：组织内部或石蜡中混有透明剂；脱水不干净；石蜡本身品质不良；组织块移入纸盒时动作太慢，周围的石蜡已成凝固状态；冷却用水温度不够低，石蜡凝固太慢。解决办法：属于前三个原因者应在包埋之前就须注意；属于后二个原因者，可将包埋块再投入蜡中熔化后重新包埋，但必须注意熔化包埋过的石蜡块的时间不宜过久。,8、修块和切片,修块削去表面的包埋剂，露出组织，然后在组织
37、的四周以和水平面成45度的角度削去包埋剂，修成金字塔形，顶面修成梯形或长方形，每边的长度为0.2mm0.3mm。,8、修块和切片,切片：用锋利的刀片，将包埋好的材料切成所需要的厚度的薄片，一般用专门的切片机和切片刀。切片的类型：厚切片：5um以上，如石蜡、滑走切片等；半薄切片：0.5-2um，如GMA切片等；超薄切片：40100nm，如电镜切片。一般而言，切片越薄，可能达到的分辨率越高，观察的效果越清晰。,切片刀的类型：根据切片刀的质地分为：金属刀（钢刀）：用于石蜡等厚切片；玻璃刀：用于塑料包埋的半薄及超薄切片；钻石刀：用于塑料包埋的半薄及超薄切片，但切片效率与效果好于玻璃刀；根据切片刀的两面
38、结构分为：双平面刀：刀的两面平直；平凹面刀：刀的一面平直，另一面内凹；双凹面刀：刀的两面内凹，刀口长而薄，一般切片机不常采用。,切片机的结构：控制切片厚薄的微动装置；供装切片刀的夹刀部分；供装置组织块的夹物部分。,切片机的类型根据功能分为：普通切片机：可以切厚切片与半薄切片；超薄切片机：可以切半薄切片和超薄切片；特殊用途切片机：如冷冻切片机、滑走切片机等。根据结构分为：滑行式切片机：夹刀部分是滑动的，而夹物部分是固定的，可上下升降；旋转式切片机：夹物部分式上下移动，前后推进，而夹刀部分则固定不变。,切片过程中出现问题的一般原因和补救办法：一、蜡带弯曲不直 原因：1.蜡块上下两边不平行，或与刀口
39、不平行；2.刀口锋利不一，局部产生差异；3.材料未居蜡块正中央。补救办法：1.取下台木，将蜡块两边修平，调节夹物部，使两者平行。2.移动刀片，改用新刀口。3.用刀片切去部分石蜡，使材料居中。二、切片分离，不能连成带状或卷起成圆筒状。原因：1.室温过低。2.石蜡过硬。3.材料边缘留蜡太少。4.刀的角度不合适。补救办法：1.在切片机上安一盏电灯加温。2.用手指在蜡块面上磨擦。3.重新包埋。4.矫正刀的角度。三、切片粘附于刀片上，皱褶在一起。原因：1.室温过高。2.石蜡过软。3.刀口上留有一层石蜡。4.刀口钝。补救办法：1.在早晚凉爽时切。2.将蜡块投入凉水中稍浸。3.用二甲苯拭去石蜡。4.磨刀或移
40、动刀口。,切片过程中出现问题的一般原因和补救办法：四、切片纵裂横波。厚薄不均匀。原因：1.刀口有缺口；2.石蜡块中有颗粒及杂质；3.刀口有细纤丝或碎屑；4.刀和台木未夹紧；5.组织块太硬。补救办 法：1.可移动刀片；2.将颗粒挑去；3.清洁刀口；4.旋紧螺旋；5.在水中浸泡。五、材料出现裂隙、破碎或脱落。原因：1.脱水不干净；2.透明剂残留；3.石蜡透入时温度过高；4.材料太硬或太粗。补救办法：1.无法补救；2.重新包埋；3.无法补救；如由于脱水剂，透明剂引起的可改用正丁醇，松油醇等进行脱水和透明；4.软化组织。,9、粘片与粘片剂,粘片：用粘片剂将切好的切片粘贴在载玻片上，使切片在以后的处理过
41、程中不会从载玻片上脱落。粘片剂：郝伯特(Haupt)粘贴剂：甲液：动物胶（明胶）1g 蒸馏水 100ml 甘油 15ml 石炭酸 2g乙液：甲醛 4ml 蒸馏水 100ml,蛋白粘贴剂：粘性不强新鲜蛋清：25ml 甘油 25ml 石炭酸 0.5ml火胶棉粘贴剂：一般用于厚切片的粘贴。,10、染色,染色是生物制片中最重要的环节之一，只有通过染色，细胞和组织才显得清楚，微小的细胞结构才得以分辨。染色的基本原理：有关染色的理论至今是一个并末完全清楚的很复杂的问题。目前一般还是从物理和化学的作用来解释各种组织或细胞的染色现象：细胞和组织的不同结构之所以能被染成各种不同的颜色，是由于染料对它们所起的物理
42、或化学的综合作用。,染色原理物理作用,渗透作用：染料渗透到多孔的组织中，与组织没有牢固的结合；吸收作用：又称溶解学说，组织吸收染料中的色素粒子，与之牢固结合，组织着色与染液的颜色相同，不一定与干燥染料的颜色相同。如品红在干燥时为绿色，而其溶液呈红色，组织在染色后也呈红色，即使组织干燥后，其红颜色不变；吸附作用：染液中分散的色素粒子进入被染物质的粒子间隙内，由于分子的引力作用，色素粒子被吸附而染色，也由于各种蛋白质或胶体有不同的吸附面，因此可以吸附不同的粒子，也就是说对粒子的吸附有选择性，即有的容易被某些物质吸附，有的则不容易吸附。,染色原理化学作用,化学作用的主要理论根据是染色剂的性质可分为酸
43、性、碱性和中性染色剂，而动、植物的细胞内般也可区分为酸性(阴离子)和碱性(阳离子)部分。当碱性染色剂溶液中的有色部分成为阳离子时，就能与细胞的阴离子(酸件部分)较牢固地结合，当酸性染色剂溶液中的有色部分成为阴离子时，就能与细胞内的阳离子(碱性部分)较牢固地结合。例如，细胞核，尤其是核内的染色质，主要由核酸组成，是酸性的组成成分故和碱性染色剂(苏木精)的亲和力很强，易于着色。细胞质含碱性物质，故和酸性染色剂(伊红、曙红)的亲和力很大，易于着色。,媒染及促染,媒染在染色中也起着重要的作用。对于一些染液来说，如果没有媒染的作用，就不能使细胞或细胞的某些细胞器着色，或者着色很浅。经过某种媒染处理，便能
44、非常清晰地显示出来。因此媒染的作用，主要是促进染料的染色能力。促染剂与媒染剂不同，它不参与染色反应，只是增强染色能力，如在美蓝中加适当量的氢氧化钠或在伊红内加少量的冰醋酸，则可增强染色能力。,所以，在苏木精伊红(HE)染色中，细胞核被碱性染色剂苏木精所染，细胞质被酸性染色剂曙红所染。这也就是细胞核是嗜碱性的，细胞质是嗜酸性的。除染色质外，粘液和软骨的基质等都是嗜碱性的，细胞质内含的某些颗粒也为嗜酸性。须注意的是嗜碱性和嗜酸性是相对而不是绝对的，若细胞在碱性染色剂溶液中停留过久，则细胞质也可染上碱性染色剂的颜色。某些细胞(如血细胞）具有特殊性质，能和中性染色剂发生亲和力而结合。由此可见，细胞各成
45、分的染色强弱是与细胞成分及染色剂的性质有密切关系：两者之间的亲和力强，染色就深；亲和力弱或无，染色也就浅或无。但是，染色的实际情况是极为复杂的，组织细胞的染色作用，还随所用溶液的pH值而变动。,上述两个主要的染色理论，若单独用一种学说来解释所有的染色现象都是有困难的，染色的机制非常复杂，目前，了解的不是很清楚。现在比较明确的认为：染色主要时由于物理作用和化学作用综合发生作用的结果。,常用染色剂分类,按染料的化学性质可分为：碱性染料、酸性染料、直接染料、媒染染料、中性染料；根据染料的来源可分为：天然染料（此类染色剂是从动、植物体中提取的，为天然产物，产量少。目前常用的有苏木精、洋红、地衣红和靛蓝
46、等）和合成染料（全是由芳香环或具有芳香性的杂环化合物所构成。最早是由煤焦油蒸馏产物合成而得的，所以又称为煤焦油染料）。根据染料的用途可分为：细胞核染色剂（用于细胞核的染色剂有天然染色剂的苏木精、洋红以及合成染色剂中的番红、结品紫、硫堇、甲苯胺蓝、甲基绿、美蓝、孔雀绿和焦油紫等）、细胞质染色剂（用于细胞质的染色剂有合成染色剂中的曙红、亮绿、橘黄G、酸性品红、苦味酸和水溶性苯胺蓝等）和脂质染色剂（用于显示脂质的染色剂有合成染色剂中的苏丹III、苏丹Iv、硫酸尼罗蓝及油红等）。,常用染色剂,苏木精（Haematoxyin）：源于苏木科植物苏木的心材，具有多色性，遇酸呈红色，遇碱呈蓝色。洋红（Carm
47、in）：取自胭脂虫雌虫体，为酸性染料，渗透力强，可将核及染色体染成深红色。地衣红(Orcein)：取自茶渍地衣。番红(Safranin)：植物组织学常用染料。碱性，常用于固绿、亮绿、苯胺蓝对染，或与结晶紫、桔红G进行三重染色，可将木质化细胞壁红色，角质化细胞壁粉红色，栓化细胞壁黄褐色，染色体、核仁、中心体染红色。,亮绿(light green)：酸性染料，可将细胞质核纤维素壁染成绿色。固绿(fast green)：酸性染料，特点与亮绿类似，色彩不如亮绿鲜艳，但不易褪色。结晶紫，又名龙胆紫(gentianviolot)：酸性染料，但着色快，核质、纺锤丝、鞭毛等染呈紫色。桔红（Orange G）：
48、酸性染料，多用于对染。苯胺蓝(aniline blue)：酸性染料，常与番红等进行二重染色。染纤维素、细胞壁、鞭毛等，同时也是一种荧光染料，紫外下发黄绿色荧光，常用于观察花粉管、筛板等。,染色方法分类,按所染材料是否是活体可分为：活体染色、死组织染色；根据材料是否完整可分为：整体染色、切片染色（累积染色法、回复染色法）；根据染色时用的染料数目可分为：单染色、二重及多重染色。,特殊染色法,特殊染色法如活体染色法和金属沉淀法。活体染色法：将无毒或毒性很低的染液注入动物体内使染料为细胞吸收而染色，或把染液加入培养动物细胞的培养液内而染色。金属沉淀法：用可溶性的重金属盐类，配成稀释液，使其与细胞组织的
49、某些结构接触，然后再利用有机酸类和甲酸、醋酸、草酸等进行还原，使金属盐类形成不溶性的金属或金属氯化物，沉积于结构的表面，使其呈现黑褐色的物影，因而显示其结构。最常用的“金属染料”为金、银、锇三种。,染色缸（立式、卧式）,二重及多重染色方法简介,番红-固绿二重染色法 海氏苏木精-番红二重染色法 代氏苏木精 番红二重染色法 番红苯胺蓝二重染色法 番红-结晶紫二重染色法 番红-结晶紫-桔红G三重染色法,染色时注意的几个问题,应根据材料的结构、性质、观察目的来选择染色方法；材料从溶液中取出放入染色液时，此两种溶液的浓度必须相同；作二重染色时，应先染碱性染 料，后染酸性染料；染色宁可深一点，不要浅一点；
50、作分色用的酸、碱溶液必须彻底洗净；制成的片子不要置于阳光下，以免褪色；灵活运用各种染色方法。,11、透明和封藏,透明的目的 除去材料中的脱水剂，便于封藏；增加组织的折光率，便于在显微镜下观察；使包埋剂容易渗入组织中，便于包埋及切片。,透明剂,二甲苯(xylol)氯仿(chloroform)苯（Benzene,同二甲苯）丁香油（Clove oil）香柏油（Cedor oil）冬青油（Winter-green oil）等,封藏,封藏的目的：使已经透明的植物组织，在适当的封藏剂中能够永久保存。封藏剂的条件：透明而又具有高的折射率，干燥后能够凝固。,常用的封藏剂,常用的封藏剂：加拿大树胶（Canada
