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1、第六章 生物检定法,主 要 内 容,第一节 概 述,第二节 生物检定质反应的直接测定法,第四节 生物检定法的应用,第三节 生物检定量反应的平行线测定法,第一节 概 述,五.生物检定的常用方法,二.生物检定的应用范围,三.标准品,四.生物检定中的基本概念,一.生物检定法简介,六.生物检定的步骤,七.生物统计知识,一 生物检定法简介1.什么是生物检定法？,待检药物,被测物的相对效力（效价或毒性）有效性 安全性,生物体,标准品,活性反应,动物 组织 细胞 微生物,利用药物对生物体的作用以测定其效价或生物活性的一种方法,相对快速、重复性好、不能反映药品的生物特异性和有效性,反映药品的生物特异性和有效性
2、 繁琐、误差大,2.生物检定采用的实验方法,体外测定(in vitro)离体器官、组织,微生物,酶和细胞,类 别,3.生物检定法特点,以药理学反应为基础(定量药理学剂量和反应的函数关系)以标准品对比校验为手段（在产生特定反应情况下，以供试品与标准品剂量比值推算供试品效价）以生物统计学方法为结果判断的依据,真正的活性测定，与理化分析、蛋白结合试验不同；但生物差异性大（实验误差大）、专业性强、实验周期长，人力、物力消耗大，计算较繁。,控制生物差异性的方法与措施:,生物来源、饲养或培养条件必须均一。采用特定的实验设计,对影响实验误差的条件和 因子进行限制,减少实验误差。用生物统计方法提高实验的可靠性
3、。,应用范围,3,4,2,微量生理活性物质测定,某些有害杂质限度检查,中药质量控制,二 生物检定法的应用范围,多组分生化药物制剂、激素类药物、生物制品:由结构类似、而生物活性不同、比例不定的多种成份组成，或其组分不明确、结构复杂，难用理化方法反映其生物活性；虽可用理化方法测定含量，但含量不能完全反映效价（生物检定是反映产品质量的重要指标，具有专属性。当前英国、美国及中国药典都有收载）,药物效价测定,肝素,天青A显色,比色法测定,（但变性的肝素同时显色，不能反应肝素活性）,所以:肝素,抗凝血活性,生化药物 肝素、胰岛素、缩宫素、绒促性素、硫酸鱼精蛋白、精蛋白锌胰岛素、卵泡刺激素、黄体生成素、降钙
4、素、生长激素、升压素等21个品种（约占我国生化药的10%）抗生素生物制品 菌苗、疫苗、抗毒素、类毒素等,药典生物药物效价测定品种:,应用范围,3,4,2,微量生理活性物质测定,某些有害杂质限度检查,中药质量控制,二 生物检定法的应用范围,无菌、微生物限度、热原、细菌内毒素、异常毒性、降压物质、过敏等 药典几百种,有害杂质限度检查,应用范围,3,4,2,微量生理活性物质测定,某些有害杂质限度检查,中药质量控制,二 生物检定法的应用范围,一些神经介质，激素等微量生理活性物质，由于其很强的生理活性，在体内的浓度很低，加上体液中各种物质的干扰，很难用理化方法测定。而不少活性物质的生物测定法由于灵敏度高
5、、专一性强，对供试品稍作处理即可直接测定。如乙酰胆碱，5-羟色胺等活性物质的测定。,微量生理活性物质测定,应用范围,3,4,2,微量生理活性物质测定,某些有害杂质限度检查,中药质量控制,二 生物检定法的应用范围,中药成份复杂，大部分中药的有效成份尚未搞清，难以用理化方法加以控制，但可用一些以其疗效为基础的生物测定方法来控制其质量。,中药质量控制,三 标准品(S)与供试品(T)及其表示,标准品（S）：系指用于生物检定中效价测定的标准物质，以效价单位(U)表示。PS表示S的效价国家标准品：系指用国际标准品标定的用于定量测定某一制品效价或毒性的标准物质，其生物活性以国际单位（IU）或以单位（U）表示
6、。,供试品（T）供试品(T)是供检定其效价的样品,它的活性成分应与标准品基本相同。,AT是T的标示量或估计效价 PT是经检定的T的效价,称“测得效价”,效价是表达药物效力强弱或活性物质含量的一种公认的剂量单位。效价单位（U）是衡量生物药物有效成分效力的具体尺度。效价:用每毫升或每毫克中含有某种生物药物的效价单位数表示药物效力或浓度单位 U/mg，U/mL 例如:青霉素钠的效价为 1670 U/mg 庆大霉素的效价为 590 U/mg 洋地黄的效价为 10 U/mL,效价单位(效应浓度单位),四.效价检定中的基本概念,（一）生物反应（生物检定的基础）（二）剂量与反应的关系（三）等反应对比检定,（
7、一）生物反应（生物检定的基础）,（二）剂量与反应的关系,生物反应类型质反应：给药后,观察某一反应的某一程度出现与否。如是否死亡、是否惊厥，是质的变化，称质反应。量反应：药物对生物体所引起的反应随着药物剂量的增加产生的量变可以测量者,称量反应。如血压、血凝时间、血糖等。,剂量与反应的关系,某降压药：剂量 降压作用 1g 15mmHg 2g 25mmHg 3g 30mmHg,剂量与反应间一般呈曲线关系,剂量与反应关系的直线化,剂量与反应间一般呈曲线关系,将剂量取对数(lgd)后可与反应(y)成直线关系,生物检定中的剂量常用对数表示,将药物的供试品（T）和已知效价的标准品（S）对生物体进行同时对比，
8、以对T的效价（或毒力）进行检定的方法。属于对比检定。,（三）等反应对比检定（相对效力的计算）,S dS（标准品剂量）；PS（标准品效价）T dT（供试品剂量）；PT（供试品效价）,对于量反应：S和T各自的对数剂量和反应应呈直线关系 S和T的两条直线应平行,等反应对比检定原理,lgdS=XS lgdT=XT M=lgdS-lgdT=XS-XT,S与T等反应时所对应剂量分别为：,等反应时:S和T中所含效价应相等，即：dTPT=dSPS（S和T中所含效价单位数）令：R=PT/PS=dS/dT（1）,PT=RPS（2）求出R就可以求出PT,（R为等反应效价的比值）,（1）式两边取对数，lgR=lgPT
9、/PS=lg(dS/dT)=lgdS-lgdT 令lgR=M,lgd=X,则 对数效价比值：lgR=M=lgdS-lgdT=XS-XT R=lg-1M=lg-1(XS-XT)PT=RPS=lg-1 MPS实际工作中S的剂量常按已知效价计算，而T的剂量按标示效价或估计效价（AT）来安排:PT=RAT,R=PT/PS=dS/dT（1）,五 生物检定的常用方法,(一)质反应的直接测定(二)量反应平行线测定法,六 生物检定的步骤,实验设计的选择反应指标的测定实验可靠性检验(方差分析)相对效力的计算及可信限的估计,七.生物统计知识（实验设计及方差分析）,（四）实验可靠性检验（方差分析),（一）实验设计的
10、目的,（二）试验设计重要三原則,（三）生物检定常用实验设计,1.实验设计的目的 最少的代价获得最多的信息可有效排除混杂变异对结果的影响便于采用简化计算(采用定型对称设计有利于有效性检验的简化)采用特殊实验设计(提高精度和灵敏度),标准曲线法与量反应平行线4.4法测定 LMWH产品抗FXa效价比较,标准曲线法结果误差大,重现性差,波动大,缺乏可比性；当采用量反应平行线原理的44实验设计,结合生物统计,其结果较平稳,误差小,重现性好。,2.试验设计重要三原則,重复随机对照,如：试验某种降压药物的降压作用：将20只雄性大鼠随机分成两组，每组10只，一组作为空白对照，一组给予待测药物。,完全随机化设计
11、 随机区组设计 交叉实验设计,3.生物检定常用实验设计,(1)完全随机化设计,动物号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10随机号 1 2 0 3 8 7 4 5 9 6组 别 甲 乙 乙 甲 乙 甲 乙 甲 甲 乙,将10个观察对象随机分为两组：,例：洋地黄效价测定鸽最小致死量(MLD)法,单号为甲组，双号为乙组,(2)随机区组设计,将分成8各区组（如来自8个窝的动物）的32个受试者随机分配到A,B,C,D四个处理组各区组中的受试者被随机分配接受的不同处理,例：催产素生物检定法大鼠子宫法,(3)交叉实验设计,S为标准品组，T为供试品组,平衡实验次序的影响。把不同因素不同水平均摊于受试对象，
12、去除试验时间次序和试验次序的影响,例:小鼠血糖法测定胰岛素效价,处理在同一受试对象上重复观察，由于处理是在同体上比较，从而避免了个体差异。,(4)方差分析(F检验),方差分析的概念 用于推断多个总体均数有无差异(差异显著性)的检验方法,如：观察四种降压药对大鼠的降压效果 或观察四个剂量的降压药对大鼠的降压效果,方差S2：是测量值在其总体均值周围分布状况的一种量度，方差表征随机变量分布的离散程度。,方差S2=,f=n-1,自由度,离均差,(yi-)2,f,SS,f,方差S2=,f=n-1,f,SS,f,方差S2=,差方和SS,f=n-1,f,SS,f,方差S2=,f=n-1,f,SS,f,方差S
13、2=,f=n-1,f,SS,f,方差S2=,f=n-1,f,SS,f,组间变异（处理效应）用组间方差表示；组内变异（随机误差）用组内方差表示。,方差分析原理,S2总=S2处理+S2误差,s2总=s2处理+s2误差,方差和F值计算方法,SS总=SS处理+SS误差,f总=f处理+f误差,SS误差=SS总SS处理,f误差=f总 f处理,s2总=SS总/f总；s2处理=SS处理/f处理,s2误差=SS误差/f误差,=,方差分析（F检验）:,以处理组方差(S2)与误差项方差（S2（误差）的比值（称F值）来确定处理效应差异的显著性程度。,查F值表，当F计算值大于P0.05或P0.01的查表值时，则P 0.
14、05或P0.01，即为在此概率水平下该项变异有显著意义。,方差分析(F检验)的步骤,建立检验假设：无效假设把处理间的方差12与误差的方差假设相等即：H0：12=22；备择假设 HA：1222计算各处理组的方差及组内的方差，求出相应的F值。计算所得的F值与F表中按一定自由度查得的F0.05或F0.01进行比较若处理组FF0.05（F0.01）则拒绝H0，接受HA，认为该处理所引起的差异有显著（极显著）意义。若处理组F F0.05则接受H0，认为该处理所引起的差异无显著意义。,主 要 内 容,第一节 概 述,第二节 生物检定质反应的直接测定法,第四节 生物检定法的应用,第三节 生物检定量反应的平行
15、线测定法,第二节 质反应的直接测定,一.测定程序 将实验对象随机分成两组，S组与T组，分别测定两组 的MED（最小效量）y值 计算出M、R和PT 估计实验误差（用可信限（FL）表示）,在较短时间内能准确测得各个动物对S和T的最小效量的方法。以产生质反应的最低有效量(MED)为反应指标（y）,按公式计算出M，再求算R和PT：R=lg-1M PT=RAT,二.M和PT的计算,R=PT/PS=dS/dT,误差项方差S2的计算,三.实验误差的估计（用可信限（FL）表示）,步骤：,标准误SM的计算,可信限（FL）的计算,1.误差项方差S2的计算,nS、nT为标准品和供试品的反应个数,2.标准误SM的计算
16、,是指平均数的标准差,即各均数之间差异的大小,用SM表示,SM越小差异也越小。,S 2为误差项方差nS、nT分别为标准品和供试品的反应个数用SM对总体均数进行评估，计算可信限。,标志检定(R和PT)结果的精确度 R的FL=lg-1(MtSM)PT的FL=ATlg-1(MtSM)t(f,0.05)：根据f和概率水平查表获得,3.可信限（FL）的计算,R或PT的FL%=100%,除药典另有规定外，可信限率不得大于5%。,4.示例:质反应直接测定法 洋地黄效价的测定鸽最小致死量（MLD）法,本法系比较洋地黄标准品(S)与供试品(T)对鸽的最小致死 量(MLD，U/kg)，以测定供试品的效价。,实验方
17、法：,标准品稀释液的配制,供试品溶液和稀释液的配制,检定法,按直接测定法计算效价(PT)及实验误差FL()本法的可信限率FL()不得大于15。,鸽(250400g),标准品组(6只),供试品组(6只),注射S至死亡,MLDS(UKg),MLDT(UKg),注射T至死亡,测定结果,(X)2 38.019 40.755 X2 6.342 6.811,效价的计算,M=1.028-1.064=-0.036 R=lg-1M=antilg M=antilg(-0.036)=0.9204 PT=RAT=0.920410 U/g=0.9204 U/g,已知：XS=1.028；XT=1.064；AT=10 U/
18、g,误差项S2及可信限计算,已知：XS2=6.342 XT2=6.811(XS)2=38.019(XT)2=40.755 nS=nT=6,0.02812,R的 FL=lg-1(MtSM)查t值表 t(10)0.05=2.23（P=0.95）lg-1(M+tSM)是R的高限;lg-1(M-tSM)是R的低限 PT的FL=AT lg-1(MtSM)ATlg-1(MtSM)是PT 的高限；ATlg-1(MtSM)是PT的低限 PT的FL=7.9710.6(U/g),PT的 FL%=,10.6-7.97,29.20,100%=14.3%,结果PT的 FL%15，实验结果可靠。,直接测定法的优点：可使用
19、较少量的动物，直接测得S和T的等反应剂量直接测定法常用的实验设计：随机设计 配对交叉设计,小 结,主 要 内 容,第一节 概 述,第二节 生物检定质反应的直接测定法,第四节 生物检定法的应用,第三节 生物检定量反应的平行线测定法,一.量反应的平行线关系,第三节 量反应平行线测定法,对于量反应：S和T各自的对数剂量和反应应呈直线关系S和T的两条直线应平行,药物对生物体所引起的反应随药物剂量的增加产生的量变可以测量者，称量反应,R=dS/dT；lgR=lgdS-lgdT=XS-XT=M R=lg-1M=lg-1（XS-XT）当供试品按标示量或估计效价进行试验时:PT=ATR 或 PT=ATlg-1
20、M,量反应的测定方法:常用(k.k)法，如(2.2法)和（3.3法）。或称4点法（S和T各用2个剂量组）和6点法（S和T各用3个剂量组）。,二.测定原理,等反应时(yS=yT):dTPT=dSPS 则：R=PT/PS=dS/dT 令：M=XS-XT,三.量反应平行线法常用的实验设计,随机设计随机区组设计交叉设计,四.测定步骤,按定型实验设计进行指标测定；将测得反应值(y)按剂量分组列成方阵表;方差计算和可靠性检验（采用定型公式的简算法）；进行效价及可信限计算（采用定型公式的简算法）。,计算软件：中国药典生物检定统计程序 BS 2000 ForWin-dows 9X,五.实例-缩宫素效价测定,S
21、为缩宫素标准品:dS1:0.0068u dS1:0.009u T为缩宫素注射液 标示量AT:10u/ml dT1:0.008u dT2:0.0106u r=1:0.75 I=lg r=lg(1/0.75)=0.125 反应(y):子宫收缩高度(mm),(随机区组设计(2.2)法),实验安排,给药顺序,将标准品和供试品高低2个剂量组S1，S2，T1，T2 分别用ABCD表示，作出5组收缩数据（5个区组）。给药顺序：ABCD BCDA CDAB DABC CBDA,随机区组设计(2.2)法，K=4，每组4个剂量为一个区组，m=5,将反应值(y)按S和T的剂量分组列成方阵表,可靠性检验,总差方和,剂
22、间,区组间,误差项差方和及自由度 计算剂间变异分析可靠性检验,主 要 内 容,第一节 概 述,第二节 生物检定质反应的直接测定法,第四节 生物检定法的应用,第三节 生物检定量反应的平行线测定法,第四节 生物检定法的应用,一 胰岛素生物检定法二 肝素生物检定法三 抗生素微生物检定法,一 胰岛素生物检定法,小鼠血糖测定法双交叉设计量反应平行线法,方法可靠性检验PT和FL计算,二 肝素生物检定法（随机或随机区组设计）,本法系比较肝素标准品(S)与供试品(T)延长新鲜兔血或兔、猪血浆凝结时间的作用,以测定供试品的效价。,（2.2）四点法或（3.3）六点法 家兔全血或血浆法,三.抗生素微生物检定法,以抗
23、生素的抗菌活力为指标来衡量抗生素效价的一种方法分类常用琼脂扩散法-管碟法浊度法（比浊法）稀释法其中前两种被列为抗生素微生物检定法的国际通用方法,量反应平行线(2,2)或(3,3)法,琼脂扩散法-管碟法,利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，采用量反应平行线原理的设计，比较标准品与供试品对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法,抗生素对数剂量与抑菌圈半径平方值成直线关系。抑菌圈的半径与抗生素总量、抗生素的扩散系数、扩散时间、培养基的厚度和最低抑菌浓度等因素有关。,浊度法,定义：利用抗生素在液体培养基中对试验菌生长的抑制作用，通过测定培养后细菌浊度值的大小，比较标准品与供试品对试验菌生长抑制的程度，测定供试品效价的一种方法原理：根据抗生素在一定范围内，其浓度或浓度的数学转换值与试验菌生长产生的浊度之间存在线性关系而设计，通过测定培养后细菌浊度值的大小，计算出供试品的效价,实例：红霉素效价的测定,总结：生物检定法的特点,思考题,1.什么是生物检定法？生物检定的常用方法有哪些？2.微生物检定法测定抗生素效价常用方法有哪些？原理是什么？3.管碟法测定抗生素效价的影响因素有哪些？4.生物检定法在生物药物分析中的应用有哪些方面？,
