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1、Advanced Enzyme Engineering,第九章 生物酶工程,Contents,一、生物酶工程的定义,二、生物酶工程的内容,三、生物酶工程的前景,Go,Go,Go,生物酶工程是酶学和以基因重组技术为主的现代分子生物学技术相结合的产物，亦称高级酶工程(Advanced Enzyme Engineering)。,一、生物酶工程,1.定义,二、生物酶工程的内容,（3）从蛋白质或基因水平上设计，合成酶杂合体或自然界不曾有的酶（杂合酶）。,生物酶工程主要包括：,（1）用基因工程技术大量生产酶（克隆酶）；,（2）修饰酶基因产生遗传修饰酶（突变酶）；,（4）抗体酶；,（5）核酶。,通过基因工程
2、手段，克隆各种天然酶的基因，将其克隆到表达载体中，然后将表达载体转化到适当的宿主中，得到表达特定酶的基因工程菌，通过基因工程菌的繁殖大量产生的酶称为克隆酶。,1.克隆酶,（1）克隆酶的定义：,克隆酶图例,基因工程菌,载体,宿主,生物体,发酵,克隆酶,酶基因,外源基因转入微生物宿主细胞内，与宿主细胞的遗传物质相结合，后代宿主的遗传物质中含有外源基因，这种带上人工赋予的新的遗传特性的宿主微生物，被称为基因工程菌。,2.基因工程菌的定义,（1）在宿主细胞内可以自主复制；,（2）克隆酶对载体的要求,（2）容易引入受体细胞；,（3）具有合适的筛选标记基因；,（4）具有少数限制性酶切位点。,（3）克隆酶对
3、宿主的要求,（1）安全可靠，非致病菌；,（3）有利于酶的分离和纯化；,（5）容易培养和管理。,（4）能利用廉价的原料，发酵周期短，产量高；,（2）外源基因在宿主内能够表达且不被分解；,（4）克隆酶基因的表达系统,原核生物的基因表达系统真核生物的基因表达系统 1.酵母表达系统 2.植物表达系统 3.动物表达系统 4.丝状真菌表达系统,纤维素酶基因工程菌的构建,（5）克隆酶实例,纤维素酶,纤维素酶在食品、饲料、造纸、纺织等行业具有广泛的用途。但由于天然纤维素酶产量低、来源有限而导致其大规模应用受到限制。,纤维素酶（cellulase）是能将纤维素水解为葡萄糖等简单糖类的一组酶的总称。,为此，通过基
4、因工程技术，克隆福寿螺体内的纤维素酶基因，构建含有cel的基因工程菌，以期通过液体培养或固体培养的方式得到大量的克隆纤维素酶。,afp基因,转化受体,低温筛选,技术路线1,A.bgpd,L.egpd,V.vgpd,+,表达载体,PEG介导转化,农杆菌介导转化,电激转化,分子鉴定,原生质体或菌丝球,建立转化体系,低温筛选体系建立,技术路线2,Cel基因工程菌株的筛选,液体发酵,分离纯化,定义：利用有控制地对天然酶基因进行剪切、修饰或突变，从而改变这些酶的催化特性、底物专一性或稳定性，使之更加符合人们的需要。,2.突变酶,遗传修饰改变酶的性能大致有：（1）提高酶的活性（2）提高酶的稳定性（3）改变
5、底物专一性（4）改变酶的最适pH值（5）改变酶对辅酶的要求（6）改变酶的别构调节能力,修饰酶基因的方法主要方法（i）定位突变（ii）体外定向进化,定位突变（site-directed mutagenesis）是根据酶的结构、功能和作用机制的信息，在基因水平上精确改变酶分子中的氨基酸残基，对酶的性质和其催化特性进行改造，产生符合特定需要的酶。,（i）定位突变,盒式诱变寡聚苷酸引物诱变PCR诱变,方法：,（1）盒式诱变,原理：利用一段人工合成的具有突变序列的寡聚核甘酸片段（寡核甘酸盒，Oligonucleotide Cassette），取代野生型基因中的相应序列。,HindIII,EcoRI,Hi
6、ndIII,EcoRI,+,（2）寡聚苷酸引物诱变,原理：用化学合成的含有突变碱基的寡核甘酸短片段作为引物，启动单链DNA分子进行复制，生产出来的新链中目的基因的特定位点具有已经发生突变的碱基序列。,A,转化,G,T,A,G,A,ATCGCTTCT,A,C,T,A,G,G,C,T,A,P标记筛选分离突变体,（3）PCR诱变,定点诱变法大引物诱变法,特点：可以在DNA区段的任何部位产生定点突变。,原理：在头两轮的PCR反应中，应用两个互补的并在相同部位具有相同碱基突变的内侧引物，扩增形成两条有一端可彼此重叠的双链DNA片段，两者在其重叠区段具有同样的突变。故此两条双链DNA片段经变性和退火处理，
7、形成两种不同形式的异源双链分子。然后选用两个外测寡核甘酸引物进行第三轮PCR扩增，可得到一种含有突变位点的突变体DNA。,5,3,5,3,靶DNA片段,5,5,3,3,混合、变性、退火,定点诱变法,5,3,5,3,大引物诱变法,5,5,3,3,大引物,PCR,PCR,PCR,多次循环PCR,一理论来源,利用基因工程原理可以在实验室中模拟生物进化过程 化学进化生物进化,（ii）体外定向进化,人为地创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制，在体外对基因进行随机突变，从一个或多个已经存在的亲本酶（天然的或者人为获得的）出发，经过基因的突变和重组，构建一个人工突变酶库，通过一定的筛选或选择方法最终获得预先
8、期望的具有某些特性的进化酶的分子进化技术称为体外定向进化。,体外定向进化,定向进化示意图,随机突变+定向选择目标突变体,Strategies for the development of effective enzymes,定向进化,属于蛋白质的非合理设计，它不需要事先了解酶的空间结构和催化机制，人为地创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制（随机突变、基因重组和自然选择），在体外改造酶基因，并定向选择（或筛选）出所需性质的突变酶。,定向进化随机突变选择,澄清一个事实：定向进化不是定点突变,定向进化：突变 筛选 突变位点是随机的，不确定的；突变位点的数目也是不确定的；突变的效应更是不可预知的；理论
9、上讲，凡是能够引起突变的因素（物理的，化学的，生物的）都可以应用于定向进化中突变体的产生。定点突变：突变位点是确定的，突变的个数也是预知的；突变的效应可能是已知的，也可能是未知的；定点突变的方法一般是以PCR技术为基础的。,易错PCR技术(error-prone PCR)DNA改组(DNA shuflling)：由美国Stemmer 于1994 年首次提出 一项体外重组技术随机引发重组(RPR)1998 年,Arnold 提出了一种有效的新方法交错延伸技术(StEP)：由Zhao 等 提出,是一种简化的DNA shuffling 技术,随机突变的策略,易错PCR,易错PCR：是一种简单、快速、
10、廉价的随机突变方法。原理：利用TaqDNA聚合酶不具备3-5校正功能的特点通过改变PCR的条件，通常降低一种dNTP 的量（降至5%-10%）使PCR易于出错，达到随机突变的目的。还可以加入dITP 来代替被减少的dNTP，又会使下一轮循环中出现更多的错误。在PCR 缓冲液中另加入Mn2+，亦有利于提高突变率。,DNA改组,DNA改组(DNA shuffling)又称有性PCR(sexual PCR)，原理如图所示。,PCR扩增,体外定向进化,成功实例,Lipase genes(lipB52,lipB68)isolated from Pseudomonas fluorescens B52、B6
11、8 Genbank Accssion number AY623009、AY694785,成功实例,Zhengbing Jiang,Yitao zheng,Yu Luo,Gang Wang,Hongping Wang,Yushu Ma and Dongzhi Wei*.Cloning and Expression of a Novel Lipase Gene From Pseudomonas fluorescens B52.Molecular Biotechnology.2005(31),095-102.,SDS-PAGE analysis of lipase on expression and
12、 purification,functional lipase secreted by Recombinants screened with BMMY plates,体外随机引发重组,体外随机引发重组(random priming in vitro recombination,RPR)以单链DNA为模板，配合一套随机序列引物，先产生大量互补于模板不同位点的短DNA片段，由于碱基的错配和错误引发，这些短DNA片段中也会有少量的点突变，在随后的PCR反应中，它们互为引物进行合成，伴随组合，再组装成完整的基因长度。,交错延伸(stagger extension process,StEP)在PCR反应
13、中把常规的退火和延伸合并为一步,缩短其反应时间，从而只能合成出非常短的新生链，经变性的新生链再作为引物与体系内同时存在的不同模板退火而继续延伸。此过程反复进行，直到产生完整的基因长度。,交错延伸,定向进化是一个由构建突变体库，突变体表达，表达后筛选三个步骤组成的循环递进过程，需要：(1)产生包含大量带有微量有利突变的突变体的文库;(2)突变体应能在适当的微生物(如大肠杆菌或酵母菌)体内进行功能的表达;(3)必须有一种灵敏的筛选方法,能反映出由一个氨基酸的置换而引起的预期性状的较小提高。,环境库和噬菌体展示库的构建,环境库的构建：（1）采集环境样品；（2）提取DNA，连接到合适的载体上；（3）转
14、入合适的宿主菌。,噬菌体展示库的构建,在噬菌体衣壳蛋白基因中插入外源基因，形成融合蛋白表达在噬菌体颗粒蛋白的表面，被展示的多肽或蛋白质可保持相对独立的空间结构和生物学活性。,噬菌体展示的基本原理：,利用靶分子，采用适当的淘洗方法（亲和洗脱扩增亲和的循环步骤），洗去非特异结合的噬菌体，最终从噬菌体文库中筛选出能结合靶分子的目的噬菌体；外源多肽或蛋白质表达在噬菌体的表面，而其编码基因作为病毒基因组中的一部分可通过噬菌体DNA 序列测序出来，使得表达蛋白（表现型）和编码基因（基因型）之间完美地结合起来。,噬菌体展示库的构建步骤：,可分为选择（selection）和筛选（screening）。选择：通
15、过添加或减少某种成分使目的菌株获得生长优势，而其它菌株的生长受到抑制，通过多次的筛选分离最终得到目的菌株。检测：通常是在培养基中加入某种试剂或化学药物，使培养后发生某种可以辨别的变化，如培养基的透明度的变化或菌落周围颜色的变化，由此区别不同类型或生理特性不同的微生物。（容易实现高通量筛选）,定向进化的筛选策略,琼脂板涂布法 在特殊条件下培养突变菌，通过宿主菌的生长情况、培养基颜色、特定反应的出现等判断是否具有目的基因。微孔板悬浮法 在含生色底物平板上培养，挑取具有活性的克隆接种到96孔板上检测吸光度。使用微流控芯片。微球细胞固定法 与数字成像系统结合，将单个细胞附着在单个固体珠上，突变体进行分
16、离和筛选。流式细胞计数法 细胞经荧光染色后，通过高速流动系统，排成单行，逐个通过流式细胞计数仪进行测定。,突变体分离,通过酶促反应的特征加入底物显色荧光共振能量转移同位素标记底物通过检测底物消耗或产物生成进行终点检测,酶检测,信号探测,分光光度计和荧光酶标仪气相色谱和高效液相色谱质谱和核磁,定向进化的应用,3.杂合酶,杂合酶是把来自不同酶分子中的结构单元或是整个酶分子进行组合和交换，以产生目的所需的优化酶杂合体。,杂合酶的构建策略：,（1）二级结构的互换；（2）功能域替换；（3）融合蛋白。,杂合酶的制备方法：,（1）同源扫描突变；（2）反-内蛋白子的应用；（3）DNA增长截短法；（4）同源基因
17、的改组SCRATCHY库。,同源扫描突变：几个同源酶PCR扩增，然后用内切核酸酶切割，不同的切割产物混合组合，Taq聚合酶扩增，含有几个同源蛋白质的基因片段组成新基因，即为杂合基因，进而克隆与表达，产生杂合酶。,反-内蛋白子的应用：反-内蛋白子能够融合任何两个多肽，适合产生杂合酶。,DNA增长截短法：应用DNA增长缩短法，定向控制DNA的消化，不要求任何DNA的同源性和酶的结构知识，理论上两个基因的所以组合都可能产生，通过选择或筛选，找到目标酶。,同源基因的改组SCRATCHY库：增长剪截与DNA随机重组相结合。,四、生物酶工程的前景,随着各种高新技术的广泛应用及酶工程研究工作的不断深入，生物酶工程研究必将取得更快、更大的发展。可以相信，将来人们可以，采用生物学方法在生物体外构造出性能优良的产酶工程菌为生产和生活服务，酶工程技术必将在工业、医药、农业、化学分析、环境保护、能源开发和生命科学理论研究等各个方面发挥越来越大的作用。,
