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1、电子显微镜及其技术在生物医学中的应用概 论,吴晓英 教授中南大学湘雅病理系,超微结构与超微病理学,电镜,一、基本技术平台1.仪器：电子显微镜(electron microscope,简称电镜或EM)及制样设备：透射电镜(Transmisson EM,TEM):内部结构 扫描电镜(Scanning EM,SEM):表面超微结构2.样品制备技术或电镜技术(electron microscopy)：超薄切片技术等 3.图像识别和处理技术：诊断医师及技术员,1.何为电镜？电镜是使用电子来展示物件的内部或表面结构的显微镜。观察对象：无机材料：材料、化工、采矿 有机材料：生物、医学、农学电镜：实质上是一类
2、工具，是显微镜的一种！但系大型、贵重、精密仪器,其原理、结构与光镜显著不同！,2.电镜基本原理 电子具有波粒二像性且其波长比可见光的波长短(1924年)，短波长能极大地提高分辨率（光镜受可见光的波长限制，其分辨率约200纳米)。高速运动的电子在电场或磁场的作用下，会发生折射，并且能被聚焦，聚焦即能成像。电子射束取代可见光成为可能1932年电镜诞生！,3.电子显微镜术的发展史a.电子显微镜学:仪器:elcctron microscope 电子显微镜制样技术:elcctron microscopy 电镜技术图象识别和分析、处理技术,3.电子显微镜术的发展史b.电子显微镜学的发展：1933-目前分三
3、个阶段实验阶段 应用阶段 普及阶段 提高完善发展阶段 30-50年代 50-60年代 60-70年代 70-目前,58年我国生产了第一台电镜（南京光学仪器厂）1979年我校电镜室成立，购买H600透射电镜,4.电镜种类 按使用目的分：透射电镜（波谱仪、能谱仪、三维重构等）扫描电镜（波谱仪、能谱仪）超高压电镜 分析电镜 扫描隧道显微镜 原子间力电子显微镜,按用途分：生物医学用电子显微镜 非生物医学用电子显微镜按电子束发射方式分：非场发射：电子枪 场发射：,5.电镜与光镜的比较,由于光的衍射，LM 放大倍数到一定程度时就图像模糊，而电镜用电子照明，可更清晰。分辨率是衡量电镜性能的重要指标。人眼分辨
4、率：约0.2毫米(mm),光镜分辨率：0.2 微米(m),电镜分辨率：0.2毫微米(nm)。光镜的计量单位是微米（m）,电镜的计量单位为毫微米（nm）和埃。如人体红细胞的直径约为7m；人体细胞膜的厚度约为710 nm。,5.主要电镜技术超薄切片技术；负染色技术；SEM电镜样品制备技术；冷冻超薄切片技术；电镜酶细胞化学技术；免疫电子显微镜技术；电镜放射自显影技术；核酸大分子电镜样品制备技术；电子探针；电镜原位杂交技术。,6.透射电镜基本构成,采图统:CCD,1979年湘雅电镜室成立，购买H600透射电镜,Hitachi HT7700 外观-2012年病理学新购,20,Features of HT
5、7700(Screen Camera),HT7700 New operation environment,21,不同级别操作权限,23,IDB(Image Data Base)功能,24,IDB(Image Data Base)功能,雪旺氏瘤A型：长间距胶原(Laso体)H-7650,方便的直接测量HT 7700,25,HT7700 Features and Benefits,26,Features of HT7700(Double-gap Obj.Lens双狭缝物镜，可以得到独有的低倍大视野、高对比度成像的特点),Double-gap objective lens,HC and HR in
6、One TEM,拍照,CCD相机的灵敏度约比通常的光学相机高40倍。具有更多的自动化功能，如自动聚焦、自动消像散、自动拍照等 标准就具有图像数据库功能，测长、图像过滤功能等 具有较强的扩展功能，如三维重构等由于CCD相机是和电镜是一体，因此可以通过手动控制板或PC机来控制CCD相机。在显示器上显示的图像,Features of HT7700(Double-gap Obj.Lens),80m dia,50m dia,20m dia,10m dia,28,Obj.lens aperture size and contrast,染色的影响,铀污染,铅污染,30,Features of HT7700(
7、Double-gap Obj.Lens),Digital image at the lowest HC mode magnification of x 200Specimen area 90m2(Bottom mounted camera 1k x 1k pixel),Specimen:Thin section of human kidneyDirect TEM Mag.:x 200,31,Features of HT7700(Double-gap Obj.Lens),Specimen:Human kidney,Acc.Volt.:80 kV,Applications:High contras
8、t viewing of unstained sections,Pharmaceuticals and Cosmetics,人皮肤 100kV,70,000X,鼠肠细胞刷状缘 100kV,52,000X,Applications,髓神经,Applications,Biofuels/Plant Science,玉米叶片叶绿体,100kV,27,000X,Applications,35,Features of HT7700(Double-gap Obj.Lens),36,Features of HT7700(Double-gap Obj.Lens),37,Tiling:Continuous ima
9、ge data acquisition,Auto Multi-Frame,Auto Panoramic Image,Feature of HT7700(Integration CCD Camera),Using both stage and image shift an 8K x8K image is seamlessly captured,Auto multi-frame&Auto panoramic image function,Highly accurate alignment is realized by cross correlation image processing and a
10、utomatic contrast correction,Montage constitutedby 64 images(8x8)Rat kidney Direct Mag.:700 xAcc.Volt.：80 kV,38,8k pixel,8k pixel,Auto Multi-frame panoramic image function,HT7700 Characteristics(Auto Panoramic Image),三、电镜及其技术在医学中的应用,基础医学 临床诊断 发展趋势、新应用（纳米材料检测、DNA构象),1、EM在医学中的应用,在基础医学方面,a.观察细胞的亚微结构：线粒
11、体、内质网、高尔基体、溶酶体等细胞器的接构及病理变化。b.观察药物的代谢机理及对亚微结构的影响。c.研究病毒的作用机理及作用靶。d.探讨分子病理学的发生机制。e.研究大分子在生理和病理条件下的作用方式。f.其它：如功能蛋白质组的亚细胞定位，纳米药物的研制等,概述：在基础医学方面：细胞生物学、组织学、病毒学、病理学、分子生物学的发展中作出了巨大贡献并在继续应用中,EM及其技术在临床诊断中的应用：,临床方面：已广泛应用于临床各种疑难病的诊断，如肿瘤cell来源的鉴别，血液病和肾脏病的分型诊断，病毒性疾病因诊断，支原体、衣原体的鉴别，神经系统疑难病和各种代谢性疾病的诊断。,三、EM及其技术在临床诊断
12、中的具体应用,1、电镜在肾脏疾病诊断及鉴别诊断中的应用 a、原发性肾小球肾炎的分型：毛细血管内增生性 系膜增身生性 膜性肾病 膜增生性 微小病变型、轻微病变型 b、继发性肾病：狼疮性肾炎 糖尿病性肾病 乙肝相关性肾炎 高血压肾病,c、遗传性肾病：薄基底膜病、Alport 综合症 Barter综合症d、鉴别诊断方面的应用：分型（原发性）、鉴别：肺出血综合症电镜观察最好每例2个以上不同病变的肾小球，还可以观察肾小管、内皮细胞、系膜细胞及上皮细胞的变化。,d.EM在肾活检诊断中的应用微小病变肾病、遗传性进行性肾炎（Alport Syndrom）、良性家族性血尿（薄基底膜病）纤维样肾小球病：纤维样or
13、微管样物质eEM在肝活检诊断中的应用：Wilson病抗胰蛋白酶缺乏症胆色素代谢障碍：G ilbeit S.Dubin-Johnson S,Rotor.S卟林代谢疾病,IgA肾病,BM,紫殿性肾炎,淀粉样变,Cap内增生性肾炎,2、电镜在肝脏疾病诊断方面的应用,a、肝脏代谢性疾病的诊断 电镜用于肝脏疾病诊断已有30年，某些肝 脏疾病的确诊必须依赖电镜。,糖原累积症鞘脂处积病：Farbry：L ysosomal storage disease Niemann-Pick Gaucher脂代谢性疾病铜代谢障碍：Wilson 病 肝淀粉样变性体质性黄胆：Gilbert Dubin-Johson ROto
14、r,b、病毒性肝炎的分类,3、电镜在神经、肌肉 疾病诊断方面的应用,1、中枢神经疾病：如 2、周围神经系统3、肌肉,2010年2-5肌肉活检：肖美云,4、电镜在血液系统 疾病诊断方面的应用,1、白血病:如毛细胞性白血病2、海蓝氏细胞增多症,5、电镜在病原微生物学中的应用,1、细菌、寄生虫2、病毒：SARS virus3、弓形体4、衣原体,a.EM在Virus性、细菌性疾病诊断中的应用：Virus是讫 今为止人类认识的最小生命形态。由于很小，只能 EM才能对他们进行直接 而病毒性疾病的诊断往往离不开EM。优点：很多病毒对长时间缺血和福尔马林固定的影响有较较强抵抗力。其结构可以不被破坏，故尸检取得
15、已石蜡包埋的材料，也可方便应用EM找Virus。,方法：活检和biopsy组织、培养cell等超薄切片观察。血液，体液EM负染色技术。可观察的内容：Virus大小、形状、排列、复制、成熟过程、芽生部位、病毒包含体的特征等。,粪便中的甲肝病毒,负染色,6、EM在肿瘤诊断中的应用,1、区别 癌与肉瘤：基板、细胞连接等2、区别连接复合体：Ca与间皮瘤鉴别3、区别大细胞肿瘤：鳞Ca、腺Ca、神经内分必 Ca、恶性黑色素瘤、组织细胞增生X症：Birbck body,lysosomal storage disease:淀粉样变性 糖原累积病：肌肉 酶缺乏,7、EM在代谢性疾病诊断中的应用,8、其它新应用,1、医用纳米材料的检测2、DNA、蛋白质生物大分子的观察 3、细胞鉴定,当前形态学已由cell和亚cell水平发展为分子水平，电子显微学已向更细微结构生物分子和原子水平发展。EM正成为分子生物学，基因分子遗传学的重要研究工具。电镜应用于细胞生物学、分子生物学的分子结构与功能关系。蛋白质及DNA的定位已成为当前总趋势。举例：人类后基因组计划。研究Pro，EM可用来定位，观察。纳米时代：纳米材料检测、鉴别。,四、发展趋势：,76,谢谢！,
