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1、第四章 核酸分子的酶切、连接和修饰,第一节 DNA分子的酶切,一、限制性核酸内切酶（Restriction endonuclease）1、限制性核酸内切酶的发现 限制修饰系统（Restriction modification system）是存在于细菌等一些原核生物体内，可保护自身免于外来DNA（如噬菌体）侵入的一个系统，包括限制和修饰两个方面的作用。,限制(Restriction)是指细菌的限制性核酸酶对入侵DNA的降解作用，这就限制了外源DNA侵入所造成的危害。修饰(Modification)是指细菌的修饰酶对于自身DNA碱基分子的甲基化等化学修饰作用，经修饰酶修饰后的DNA分子可免遭细菌
2、限制酶的降解作用。,2、限制性内切酶的类型和命名 型和型酶在基因工程研究中的应用价值不大，通常所说的限制性内切酶都是型酶。,表4-1 三种限制性内切酶的特点比较,使用限制性内切酶寄主菌的种属名称，来命名限制性内切酶 限制酶 来源 剪切方式 EcoR I Escherichia coli RY 13 GAATTC Hind Haemophilus influenzae Rd AAGCTT,3、型限制性内切酶的作用方式（1）识别并切割特异核苷酸序列（2）识别序列都是回文序列（3）切割后形成各种粘性末端或平整末端,图4-1 几种型限制性内切酶的识别和切割序列,图4-2杂交位点的形成及其切割,二、限制
3、性内切酶切割DNA的方法,（一）单酶切割DNA样品,图4-3 单酶切割的DNA通过互补末端载体DNA的连接,图4-4 质粒的图谱及其酶切检测结果,（二）双酶或多酶切割DNA样品,图4-5 双酶切割的DNA通过互补末端载体DNA的连接,（三）DNA样品的部分酶切,图4-6 DNA样品的部分消化（A）基因组DNA电泳；（B）基因组DNA部分酶切结果,三、影响限制性内切酶活性的因素1.DNA样品纯度2.DNA甲基化程度3.缓冲液条件4.酶切反应温度5.DNA分子结构,四、D酶切的应用,图4-7重组质粒构建实例,第二节 DNA分子的连接,一、连接酶 连接酶(Ligase）是一类能将两个核酸片段连接起来
4、的酶。目前已研究发现多种不同来源或作用于不同底物的连接酶类，这里主要介绍：E.coli DNA连接酶、T4 DNA连接酶、热稳定DNA连接酶和T4 RNA 连接酶。,二、粘性末端DNA片段的连接（一）相同粘性末端的连接（二）不同粘性末端的连接,三、平末端DNA片段的连接（一）平末端DNA片段的直接连接（二）同聚物加尾法（三）接头连接四、影响连接反应的因素,图4-8 同聚物加尾连接示意图,图4-9 利用接头分子的连接示意图,第三节 DNA分子的修饰,一、DNA修饰酶1、末端转移酶2、T4多聚核苷酸激酶3、碱性磷酸酶,二、T4多聚核苷酸激酶对DNA的修饰作用1、5-OH末端磷酸化2、核酸分子5-端的标记三、碱性磷酸酶对DNA的修饰作用,思考题,1、什么是DNA限制性内切酶；基因工程中常用的是哪种类型，如何命名？2、型限制性内切酶有哪三个主要的作用特性？3、请以表格比较并说明常用DNA聚合酶及其性质。4、利用逆转录酶和mRNA模板合成cDNA的主要步骤是什么？5、请总结出DNA单酶切分析的一般实验方法。6、为什么通过碱性磷酸酶处理可以防止质粒载体DNA自连的作用？,
