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1、第六章 目的基因导入受体细胞及重组子的筛选,第一节 受体细胞,受体细胞（receptor cell）：又称宿主细胞或寄主细胞（host cell），从实验技术上讲是能摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞；从实验目的上讲是有应用价值和理论研究价值的细胞。随着基因工程的发展，从低等的原核细胞，到简单的真核细胞，进一步到结构复杂的高等动、植物细胞都可以作为基因工程的受体细胞。,1.受体细胞的概念,2.受体细胞选择所应遵循的原则,便于重组DNA分子导入。能使重组DNA分子稳定存在于细胞中。（如：限制性内切酶缺陷型，避免其对重组DNA分子的降解破坏作用。）便于重组体的筛选。（选择与载体所含的选择标记相匹配
2、的受体细胞基因型）遗传稳定性高，易于扩大培养或发酵生长。安全性高，无致病性，不会对外界环境造成生物污染。选用内源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低的细胞，利于外源基因蛋白表达产物在胞内的积累，或促进外源基因的高效分泌表达。,受体细胞在遗传密码的应用上无明显的偏倚性。具有较好的转译后加工机制，便于真核目的基因的高效表达。在理论研究和生产实践上有较高的应用价值。,3.各种类型受体细胞的优缺点,（1）原核细胞优点大部分原核细胞没有纤维素组成的坚硬细胞壁，便于外源DNA的进入。没有核膜，染色体DNA没有固定结合的蛋白质，这为外源DNA与裸露的染色体DNA重组减少了麻烦。基因组简单，不含线粒体和叶绿体基因
3、组，便于对引入的外源基因进行遗传分析。原核生物多数为单细胞生物，容易获得一致性的的实验材料，并且培养简单，繁殖迅速，实验周期短，重复实验快。,缺点 由于原核细胞缺乏真核生物具有的RNA转录后加工、修饰系统、蛋白质翻译后加工、修饰、折叠复性系统，使某些真核细胞中编码蛋白的基因不能够在原核细胞中表达，甚至即使获得了表达，也不具有正常的生物学活性。常用作受体细胞的原核生物：大肠杆菌、枯草杆菌、蓝藻等。大肠杆菌：基因背景清楚，繁殖迅速，培养简单。细胞膜间隙中含有大量的内毒素，可导致人体热原 反映。目前已实现商品化的基因工程产品中，大部分是由大肠杆菌工程菌生产的。枯草杆菌：基因背景清楚，繁殖迅速，培养简
4、单。能将基因,表达产物分泌到培养基中，不产生内毒素，具有芽孢行成能力，易于保存和培养。蓝藻：是一种自养生物，培养简便易行；可成为植物基因表达的宿主。（2）真菌细胞 真菌是低等的真核生物，基因结构简单，基因表达调控机制以及蛋白质的加工与分泌都有真核生物的特征，因此可用于表达真核生物的基因。常用的真菌细胞有酵母等。（3）植物细胞优点：植物细胞具有全能性，一个细胞就能分化成一株完整的植株，这就意味着一个获得外源基因的植物细胞就能培养成稳定遗传的转基因植物。,缺点：具有坚硬的细胞壁，外源基因无法直接导入。方法：（a）经纤维素酶处理去掉细胞壁后获得原生质体。（b）不必去掉细胞壁，采用农杆菌介导或基因枪等
5、。（4）动物细胞优点：动物细胞具有RNA的转录后的剪接、加工机制，蛋白质翻译后的加工、修饰机制，蛋白产物的生物学活性及免疫原性好。易被重组质粒DNA转染，具有遗传稳定性和可重复性。可将表达产物分泌到培养基中，便于分离、纯化。缺点：不能通过一个细胞的培养获得转基因动物。在获得转基因细胞后，需采用体细胞核移植技术获得转基因动物。,第二节 重组DNA分子导入受体细胞,1.重组DNA分子导入原核细胞,（1）重组质粒DNA分子转化大肠杆菌转化（transformation)：重组质粒DNA分子通过与膜蛋白结合进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程称之为转化。转化的方法制备感受态细胞法感受态细胞
6、：处于能吸收周围环境中DNA分子的生理状态的细胞。制备感受态大肠杆菌一般利用CaCl2处理。,电穿孔转化法 其基本原理是利用电穿孔仪的高压电脉冲作用，在大肠杆菌细胞膜上进行电穿孔，形成可逆的瞬间的通道，从而促进外源DNA的有效吸收。转化效率受电场强度、脉冲时间和外源DNA浓度的影响。三亲本杂交接合转化大肠杆菌原理：是基于可迁移质粒的迁移作用（mobilization）而建立的一种DNA转化方式。首先将具有接合转化功能的辅助质粒转移至含有重组质粒的供体细胞中，然后将这种供体细胞与受体细胞进行混合，促使两者发生接合转化作用，将重组质粒导入受体细胞。整个接合转化过程涉及到3种有关的细菌菌株，即待转化
7、的受体菌、含有要转化的重组质粒DNA的供体菌和含有广泛宿主的辅助质粒的辅助菌，故称三亲本杂交接合转化法。,转化率的计算及其影响因素转化率：DNA分子转化受体菌获得转化子的效率。转化率=转化子数/DNA分子数（10-5表示105个DNA分子获 得一个转化子）或 转化子数/DNA质量（106/g表示1 g DNA分子得106个转化子）,辅助菌（含有结合型辅助质粒）,供体菌（含有目的质粒）,受体菌,含有目的基因的非结合型重组质粒迁移,辅助质粒转移,影响转化率的因素a：重组DNA分子的大小、构型、浓度、纯度及载体与受体细胞的亲和性。b：菌株类型c：转化方法：电穿孔法最高，CaCl2诱导法居中，三亲本杂
8、交接合法最低。（2）重组嗜菌体DNA分子转导大肠杆菌转染（transfection）及转导（transduction）转染：将重组噬菌体DNA分子直接导入受体细胞中的过程称为转染。转导：通过噬菌体颗粒感染宿主细胞的途径把外源DNA分子转移到受体细胞内的过程。,采用噬菌体DNA直接转染大肠杆菌的效率很低，所以需对重组的噬菌体DNA进行体外包装后，再通过转导的方法感染大肠杆菌。体外包装体外包装：在体外模拟噬菌体DNA分子在受体细胞内发生的一系列特殊的包装反应过程，将重组噬菌体DNA分子包装成成熟的具有感染能力的噬菌体颗粒的技术。原理：根据噬菌体DNA分子体内包装的途径，分别获得缺失D包装蛋白的噬菌
9、体突变株和缺失E包装蛋白的噬菌体突变株。由于两种突变株均不具有完整的包装蛋白，都不能单独的包装噬菌体DNA。但将两种突变株分别感染大肠杆菌后，从中提取缺失D蛋白的包装物（含E蛋白）和缺失E蛋白的包装物（含D蛋白），两者混合后就能包装噬菌体DNA。,2.重组DNA分子转入真核细胞 由于真核生物的细胞结构、基因组成和基因表达较为复杂，适用于原核生物的转基因方法大多难以有效的用于真核生物。但近年来经过摸索，建立了一系列适用于真核生物的转基因方法，并用这些方法有效的获得了转基因真核生物。（1）重组DNA分子导入植物细胞农杆菌介导的Ti质粒载体转化法 农杆菌能侵入植物伤口处细胞中，其所具有的内源质粒-T
10、i质粒的T-DNA能转移至细胞内部。因此，将外源基因与Ti质粒重组构建载体，通过农杆菌介导可将外源基因导入植物细胞中。,Fig.4-16 T-DNA can integrated into the genome of plant cell,多聚物介导法 一些多聚物（聚乙二醇、多聚赖氨酸、多聚鸟氨酸等）和二价阳离子（Ca2+、Mg2+、Mn2+等）于DNA混合，能在原生质体表面形成沉淀颗粒，通过原生质体的内吞噬作用而被吸收进入细胞内。电穿孔法 同原核细胞的电穿孔法。激光微束穿孔转化法 利用直径很小，能量很高的激光微束在细胞膜上造成可逆性微孔，处于细胞周围的DNA分子随之进入细胞。超声波介导转化
11、超声波处理原生质体，使其细胞膜上形成可逆性微孔，使外源DNA进入细胞。,基因枪法 利用高速运行的金属颗粒轰击细胞时能进入细胞，将包裹在金属颗粒表面的外源DNA分子随之带入细胞。,脂质体介导法 脂质体（liposome）是由人工构建的磷脂双分子层组成的膜状结构，可以将DNA包在其中，并通过脂质体与原生质体的融合或由于原生质体的吞噬过程，把外源DNA转运到细胞内。显微注射法 显微注射法是一种利用显微操作仪，通过机械的方法把外源DNA直接注入细胞质或细胞核的基因转移方法。早期该技术主要用于动物细胞的基因转化等方面，现在逐步应用到植物细胞的转化操作中，成为一种重要的植物转基因手段。花粉管通道法 此法是
12、将外源DNA涂于授粉的枝头上，使DNA沿花粉管通道或传递组织通过珠心进入胚囊，转化还不具正常细胞壁的卵、合子及早期的胚胎细胞。,3.重组DNA分子导入哺乳动物细胞,哺乳动物的细胞很难捕获外源DNA，这明显影响了哺乳动物基因工程的发展。近年来通过探索已建立了几种能有效地将外源DNA导入哺乳动物细胞的方法。病毒颗粒转导法磷酸钙转染法 哺乳动物的细胞能捕获黏附在细胞表面的DNA-磷酸钙沉淀物，使DNA转入细胞。DEAE-葡聚糖转染法 二乙胺乙基葡聚糖是一种高分子质量的多聚阳离子试剂，能促进哺乳动物细胞捕获外源DNA，实现短时间的有效表达。,聚阳离子-DMSO转染法 此方法采用聚阳离子poly-bre
13、ne处理哺乳动物细胞，增加细胞表面对DNA的吸附能力，然后再用25%-30%DMSO短暂处理细胞，增加膜的通透性，提高对DNA的捕获量。显微注射转基因技术电穿孔DNA转移技术脂质体介导法,活化菌种，扩大培养，使其处于对数生长后期（OD600=0.4）,3-4 ml菌液冰水浴中10分钟，4 离心集菌,菌体悬浮于含CaCl2的预冷缓冲液中，冰水浴15min，4 离心集菌，弃上清，沉淀物重悬于CaCl2的预冷缓冲液中，4 下放置12-14 h,0.2 ml新制备好的感受细胞中加入缓冲液溶解的重组DNA，置于冰水浴中1 h以上，期间轻摇几次,转入42 水浴上2 min，使感受态细胞吸收重组DNA。,转
14、入37 水浴上5 min，加入1 ml不含选择性药物的LB培养基,筛选转化子,37 震荡培养30-60 min,铺板培养,图6.1 感受态细胞的制备及转化,图6.2 电穿孔仪及电击杯,图6.2 噬菌体的体外包装,图6.3 脂质体转染法,1、传代细胞准备：细胞在转染前24传代,待细胞密度达50%60%满底时即可进行转染。加入沉淀前34h，用9ml完全培养液培养细胞。2、DNA沉淀液的准备：首先将质粒DNA用乙醇沉淀（1050g/10cm平板），空气中晾干沉淀，将DNA沉淀重悬于5L无菌水中，加50L 2.5mol/L CaCl2。3、用巴斯德吸管在500L2HeBS中逐滴加入DNA-CaCl2溶
15、液，同时用另一吸管吹打溶液，直至DNA-CaCl2溶液滴完，整个过程需缓慢进行，至少需持续12min。4、室温静置30min,出现细小颗粒沉淀。5、将沉淀逐滴均匀加入10cm平板中，轻轻晃动。6、在标准生长条件下培养细胞416h。除去培养液，用5ml1HeBS洗细胞2次，加入10ml完全培养液培养细胞。7 收集细胞或分入培养皿中选择培养。,第三节 重组子的筛选,在重组DNA分子的转化、转染或转导过程中，并非所有的受体细胞都能被导入重组DNA分子，一般仅有少数重组DNA分子能进入受体细胞。再者，在这些被转化的受体细胞中，除部分含有我们期待的DNA分子外，另外一些还可能是由于载体自身或一个载体与多
16、个外源DNA片段形成的非期待重组DNA分子导入所致。因此，需要采取必要的方法将重组子从大量的受体细胞中筛选出来。转化子：导入外源DNA分子后能稳定存在的受体细胞称为转化子。重组子：含有重组DNA分子的转化子称为重组子。,阳性克隆子（期望重组子）：含有外源目的基因的重组子称为阳性克隆子或期望重组子。筛选（选择）：经过各种方法将外源DNA分子导入受体细胞后，获得所需阳性克隆子的过程称为克隆子的筛选或选择。,1.遗传表型直接筛选法,在构建基因工程载体时，载体DNA分子上通常携带了一定的选择性遗传标记基因，转化或转染宿主细胞后可以使后者呈现出特殊的表型或遗传学特征，据此可进行转化子或重组子的初步筛选。
17、一般的做法是将转化处理后的菌液（包括对照处理）适量涂布在选择培养基上，在最适生长温度条件下培养一段时间，观察菌落生长情况，即可挑选出转化子。,抗药性筛选 氨苄青霉素（Amp）、氯霉素（Cmp）、卡那霉素（Kan）、四环素（Tet）、链霉素（Str）主要用于重组质粒DNA分子的转化子的筛选。在含相应抗生素的培养基上，含重组质粒的受体菌能存活，不含重组质粒的受体菌不能存活。插入失活筛选法 外源DNA的插入特定载体后导致遗传标记基因失活，借此筛选重组子。插入表达筛选法 与插入失活策略向相反，插入表达法是利用外源DNA插入特定载体后导致遗传标记基因表达，借此筛选重组子。,显色互补筛选法 LacZ基因的
18、蓝白斑筛选形成嗜菌斑筛选法 对于DNA载体系统，只有在外源DNA插入载体后，重组的DNA分子大小在野生型DNA分子的78%-105%范围内时，才能在体外包装成具有感染能力的噬菌体颗粒。后者在转导受体菌后，转化子在培养基上被裂解形成嗜菌斑，而非转化子能正常生长，两者很容易区分。,2.DNA电泳检测法,直接电泳检测法 重组的质粒DNA分子由于有外源DNA的插入，比未插入外源DNA的质粒载体大，通过凝胶电泳就可将重组子筛选出来。,酶切电泳筛选法 通过直接电泳检测法筛选出来的重组子，插入的外源DNA不一定是目的DNA片段。通过将重组子中的质粒进行酶切，然后再进行电泳，就可将阳性克隆子筛选出来。PCR检
19、测法 外源DNA的两侧序列多为已知序列，通过PCR扩增外源DNA，然后对扩增产物进行电泳，就可筛选出阳性克隆子。,3.核酸分子杂交检测法,4.免疫化学检测法,基本过程与核酸分子杂交检测法相似，不同的是该法使用抗体探针，而非DNA探针来鉴定目的基因表达产物。因而其前提,条件是克隆基因可在宿主细胞内表达，并且有目的蛋白的抗体。放射性抗体检测法免疫沉淀检测法酶联免疫检测法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）采用非放射性标记物（辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等）偶合第二抗体，然后与目的蛋白抗原-抗体复合物结合，通过检测非放射性标记物从而检测到相应的蛋白抗原。,
20、5.转译筛选法,转译筛选法是通过体外转译的手段鉴定阳性克隆的方法，可分为杂交抑制转译和杂交选择转译两种检测方法。,杂交抑制转译要求：被研究的目的基因编码有丰富的mRNA。原理：,DNA,蛋白质,mRNA,蛋白质,杂交,转化菌落,提取重组DNA,与总mRNA杂交,形成DNA-RNA杂种分子,将总mRNA（包括DNA-RNA分子）提取出来,体外转译,蛋白电泳放射自显影,总mRNA,体外转译,蛋白电泳放射自显影,经对比，（1）比（2）中少了一种蛋白质,找到一种转译作用被抑制了的mRNA,筛选出重组菌落（或噬菌斑）,步骤：,（1）,（2）,（3）,杂交选择转译,重组体库,提取DNA,固定在NC膜上,与
21、mRNA或总RNA杂交,目的基因与对应的mRNA杂交，mRNA固定在NC膜上,将分离的mRNA进行体外转译,凝胶电泳或生物活性检测,找出单菌落重组体,6.DNA-蛋白质相互作用筛选法,原理：,外源DNA,蛋白质,能与某一特定DNA序列结合,作为探针与克隆群体杂交,翻译,克隆载体+外源DNA,受体细胞,导入,转化子,非转化子,含有克隆载体或外源DNA,不含有克隆载体或外源DNA,重组子,非重组子,仅含有克隆载体,含有克隆载体+外源DNA,阳性克隆子,含有外源目的DNA,非阳性克隆子,含有外源其他DNA,图6.4 转染（转化、转导）后不同类型的宿主细胞,滤膜（固定抗体）,+,图6.5 放射性抗体检测法,图6.6 放射性抗体检测法,加入目的基因产物的标记抗体,转化菌落,不含有目的基因,含有目的基因,涂板培养,抗原-抗体反应，菌落周围出现沉淀素,图6.7 免疫沉淀检测法,
