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1、第10章 高效液相色谱10.1 概述10.2 HPLC 仪器 包括：高压输液装置;进样系统;分离系统;检测系统;辅助系统10.3 流动相和固定相简介10.4 高效液相色谱方法简述 分配色谱、吸附色谱、离子交换色谱、尺寸排阻色谱和亲和色谱,2023/1/16,2,10.1 概述 高效液相色谱（High performance liquid chromatography,HPLC）是以溶剂液体为流动相的色谱方法。按照固定相不同可分为：液-液分配色谱；吸附色谱（液-固色谱）；离子交换色谱；尺寸排阻色谱（凝胶渗透色谱）亲和色谱 平板色谱（薄层色谱）等。,2023/1/16,3,早期液相色谱，包括Tsw
2、ett的工作，都是在直径15cm,长50500cm的玻璃柱中进行的。为保证有一定的柱流速，填充的固定相颗粒直径多在150200m范围内。即使这样，流速仍然很低（1mL/min），分析时间仍然很长！解决分析时间及柱效问题的方法:加压：增加流速（真空或空气泵）时，分析时间减少，却柱塔板高度H也相应增加，柱效下降。H=A+B/u+Cu 解决分析时间及柱效问题的方法：减小填充物的粒径（310 m）！,2023/1/16,4,Martin 和Synge在1941年就提出高效相色谱的设想，但直到60年代，高效固定相以及高灵敏检测器的出现及发展，才彻底解决了分析时间及柱效的问题。这种色谱技术曾被称为：高速液
3、相色谱（High Speed Liquid Chromatography）高压液相色谱（High Pressure Liquid Chromatography）目前使用最多的名称为：高效液相色谱（High Performance Liauid Chromatography,HPLC）,2023/1/16,5,1.高效液相色谱与经典液相色谱方法的比较 高速：HPLC采用高压输液设备，流速大大增加，分析速度极快，只需数分钟；而经典方法靠重力加料，完成一次分析需时数小时。高效：填充物颗粒极细且规则，固定相涂渍均匀、传质阻力小，因而柱效很高。可以在数分钟内完成数百种物质的分离。高灵敏度：检测器灵敏度极
4、高：UV10-9g,荧光检测器10-11g。,2023/1/16,6,2.HPLC与GC的比较分析对象及范围：GC：气体和低沸点的稳定化合物，占有机物20%；HPLC：高沸点、高分子量的稳定或不稳定化合物，占有机物80%。流动相的选择：GC：流动相为有限的几种“惰性”气体，只起运载作用，对组分作用小；HPLC：流动相为液体或各种液体的混合，除了起运载作用外，还可与组分作用，并与固 定相对组分的作用产生竞争。操作温度：GC 需高温；HPLC 通常在室温下进行。,2023/1/16,7,各种HPLC方法的应用范围及对象,2023/1/16,8,10.2 HPLC 仪器 高压输液装置;进样系统;分离
5、系统;检测系统;此外还配有梯度淋洗、自动进样、脱气装置和数据处理装置。,HPLC工作过程示意图,2023/1/16,9,2023/1/16,10,2023/1/16,11,2023/1/16,12,1.高压输液系统（150350105 Pa）1）贮液器：1-2L的玻璃瓶，配有溶剂过滤器（镍合金），其孔径约2m，可防止颗粒物进入泵内。2）脱气：超声波脱气或真空加热脱气。溶剂通过脱气器中的脱气膜，相对分子量小的气体透过膜从溶剂中除去。,2023/1/16,13,3）高压泵：输液泵的要求：密封性好、输液流量稳定无脉动、可调范围宽、耐腐蚀。输液泵种类：恒压型和恒流型。恒压泵（类似于风箱）采用适当的气动
6、装置，使高压惰性气体直接加压于流动相，输出无脉动的液流。常称为气动泵。这种泵简单价廉，但流速不如恒流泵精确稳定，故只适用于对流速精度要求不高的场合，或作为装填色谱柱用泵。,2023/1/16,14,恒流型 溶剂流量恒定，与柱填充情况无关，使用较多。有机械注射式和机械往复式两种。应用最多的是机械往复式恒流泵，适于梯度洗脱。每分钟往复25100次，因此脉动小。对流量变化敏感的检测器也会有噪声干扰，此时可连接一脉动阻尼器。,2023/1/16,15,4）梯度淋洗装置：在分离过程中逐渐改变流动相组成或极性，从而改变分配比k 值。一个泵：可采用低压混合设计（将两种或以上的溶剂按一定比例混合，再由高压泵输
7、出）；两个或以上泵：调节各自的流量，在高压下混合。,2023/1/16,16,2.进样系统 与GC 相比，HPLC 柱要短得多，由于柱本身所产生的峰形展宽相对要小些。HPLC 的展宽因素：进样系统 连接管道 检测器的死体积,2023/1/16,17,进样装置包括两种：1）隔膜注射进样：微量注射器-装置简单、死体积小。但进样量小且重现性差。2）高压进样阀：常用的为六通阀-进样量可控制，进样准确，重复性好。,2023/1/16,18,进样前,进样中,进样后,六通阀示意图,2023/1/16,19,3.色谱柱1）色谱柱的要求：内壁光滑的优质不锈钢柱，柱接头的死体积小。柱长多为1030cm，内径为45
8、mm（制备色谱柱除外）；,2023/1/16,20,2）填充：主要采用匀浆法。根据使用匀浆试剂的性质不同可分为：平衡密度法：使溶剂密度和填充颗粒密度相近，此时颗粒沉降速度趋于0。常用的匀浆试剂有四氯乙烯、四溴乙烷和二碘甲烷等；非平衡密度法：采用粘度较大的试剂，如CCl4，CH3OH,丙酮等。填充方法：填充时，按上述方法制作匀浆液，用流动相充满色谱柱及其延长管中，然后将匀浆液倒入匀浆填充器，在较高压力下迅速将其注入色谱柱内。要求填充速度快（防凝聚、沉降或结块）、且无空气进入（影响填充均匀性）。,2023/1/16,21,4.检测器 包括紫外吸收、荧光发射、示差折光和安培检测器等。,2023/1/
9、16,22,1）紫外检测器 其检测原理和UV-Vis方法一样。此时所采用的吸收池为微量吸收池，通常其光程为2-10mm,体积约为110 L。在选择测量波长时注意：溶剂必须能让所选择的光透过，即所选波长不能小于溶剂的最低使用波长。,2023/1/16,23,二极管阵列（PDA）检测器,2023/1/16,24,2023/1/16,25,Chromatograms of 3H-CYX(A)and CYX reference standard(B)scaned by DAD,Chromatograms of 3H-CYX(A)and CYX reference standard(B),吸收度,波长,
10、时间,2023/1/16,26,2023/1/16,27,4）安培检测器 由恒电位仪和薄层反应池（体积为15L）组成。该检测器是利用待测物流入反应池时在工作电极表面发生氧化或还原反应，两电极间就有电流通过，此电流大小与待测物浓度成正比。,采用安培检测器时，流动相必须含有电解质，且呈化学隋性。它最适于与反相色谱匹配。只能检测具有电活性的物质。,2023/1/16,28,5）电导检测器 主要用于离子色谱的检测。原理：基于待测物在一些介质中电离后所产生的电导（电阻的倒数）变化来测量电离物质的含量。主要部件是电导池。其响应受温度影响较大，将电导池置于恒温箱（当pH7时，该检测器不够灵敏）。其它检测器还
11、包括：MS、IR、Evaporative light scattering detector（光散射）、极谱等。,2023/1/16,29,10.3 HPLC 流动相和固定相简介一、流动相 与GC 流动相不同，HPLC 流动相为溶剂，它既有运载作用，又和固定相一样，参予对组分的竞争，因此溶剂的选择对分离十分重要。理想的溶剂应有下列特性：1）对待测物具一定极性和选择性；2）使用UV检测器时，溶剂截止波长要小于测量波长（为什么？）；使用折光率检测器，溶剂的折光率要与待测物的折光率有较大差别；3）高纯度。否则基线不稳或产生杂峰，同时可使截止波长增加；4）化学稳定性好；5）适宜的粘度。粘度过高，柱压增
12、加；过低，产生气泡。,2023/1/16,30,二、固定相载体 由于各种HPLC 分离方法的流动相均为液体，因此，HPLC 通常是按照固定相载体或固定液的不同来分类的。1.按承受压力分刚性固体：二氧化硅为基质 耐压为7.01081.0109 Pa 主要用于吸附、分配和键合色谱；硬 胶：以聚合物为基质（苯乙烯与二乙烯苯交联而成）耐压上限为3.5 108 Pa 主要用于离子交换和尺寸排阻色谱。,2023/1/16,31,2.按孔隙深度分表面多孔型：以实心玻璃珠为基体，在基体表面覆盖一层多孔活性材料（如硅胶、氧化铝、离子交换剂、分子筛、聚酰胺等）。表面多孔型固定相的颗粒大（易装柱）、多孔层厚度小且孔
13、浅（渗透性好，出峰快）；但交换容量小。适于常规分离分析。全多孔型：全部由硅胶或氧化铝微粒聚集而成，因颗粒极细，因而孔径小、传质快、柱效高。特别适于复杂混合物的分离。3.按分离原理分：分配色谱、吸附色谱、离子交换色谱、尺寸排阻色谱和亲和色谱等,2023/1/16,32,10.4 高效液相色谱方法各论一、分配色谱 原理：根据各待测物在互不相溶的两溶液中的溶解度不同，因而具有不同的分配系数。在色谱柱中，随着流动相的移动，这种分配平衡需进行多次，造成各待测物的迁移速率不同，从而实现分离的过程。,2023/1/16,33,2.流动相:为防止固定相的流失，流动相与固定液应尽量不互溶，或者说二者的极性相差越
14、大越好。流动相与固定相极性的差别程度液液色谱分为：正相分配色谱：流动相极性小于固定相极性，极性小的先流出，适于极性组分分离；反相分配色谱：流动相极性大于固定相极性，极性大的先流出，适于非极性组分分离。,2023/1/16,34,3.固定相：原则上，用于GC 的固定相也可用于HPLC 作固定相。但HPLC 固定液易流失，因此常用的只有几种-按极性由高到低为：,-氧二丙腈(ODPN)、聚乙二醇(PEM)、十八烷(C18)、角鲨烷(SQ)。涂渍方法的不同分为：机械涂渍型和化学键合型，后者应用更为广泛。,2023/1/16,35,1）机械涂渍固定相：将固定液通过机械混合的方法涂渍到表面多孔型（0.5-
15、1.5%涂布量）或全多孔型载体（5-10%涂布量）上形成的液液色谱固定相。最大的不足是：固定液易流失、分离稳定性及重现性差，不适合梯度淋洗。为减少固定液的流失，通常在柱前加一根很短的前置柱，该柱涂有与分析柱相同但有更高含量的固定液，使流动相进入分析柱之前，预先被固定液饱和。,2023/1/16,36,2）化学键合固定相：通过化学反应将有机分子键合在载体表面所形成。具有稳定、流失小、适于梯度淋洗等特点。分离机理：吸附和液液分配二者兼而有之。化学键合的表面覆盖度决定哪种机理起主要作用。,2023/1/16,37,通常，化学键合相的载体主要是硅胶（表面有硅醇基）：Si-O-R：对热不稳定、遇水、乙醇
16、等强极性会水解，使酯链断裂，因 此只适于以不含水或醇的流动相。Si-R(或Si-N)：不水解，热稳定性比硅酸脂好。但所用的格氏反应不方 便。使用水溶液作流动相时，其pH应在4-8之间。Si-O-Si-R：不水解，热稳定性好，在pH2-8范围内对水稳定。,2023/1/16,38,2023/1/16,39,正相色谱：低极性流动相C先流出,反相色谱：高极性流动相A先流出,中等极性流动相,中等极性流动相,时间,时间,时间,时间,正、反相色谱中极性和保留时间的关系,待测物极性：ABC,2023/1/16,40,2023/1/16,41,2023/1/16,42,二、离子交换色谱 此法是利用离子交换原理
17、和液相色谱技术相结合，测定各类阴、阳离子的分离分析方法。它既适于无机离子，也适于有机物分离，如蛋白质、氨基酸、核酸等。1.原理：利用不同待测离子对固定相的亲和能力（或离子交换能力）的差别来实现分离的。待测离子与离子交换树脂固定相上带电荷基团或游离的离子发生可逆交换反应：对阳离子，滞留时间从大到小的顺序为：Fe3+,Ba2+,Pb2+,Sr2+,Ca2+,Ni2+,Cd2+,Cu2+,Co2+,Zn2+,Mg2+,UO22+,Tl+,Ag+,Cs+,Rb+,K+,NH4+,Na+,H+,Li+对阴离子，滞留时间从大到小的顺序为：柠檬酸根,SO42-,C2O42-,I-,HSO4-,NO3-,Cr
18、O42-,Br-,SCN-,Cl-,HCOO-,CH3COO-,OH-,F-,2023/1/16,43,2.固定相 按离子交换剂类型分四种：按固定相制作方法可分为：多孔型离子交换树脂（包括微孔型和大孔型）；表面多孔型（包括薄膜型）离子交换树脂；离子交换键合型。,2023/1/16,44,1）多孔型：聚苯乙烯+二乙烯苯交联，分微孔型和大孔型。交换基团多交换容量大，稳定。但易溶胀，传质慢、柱效低、分析速度慢。2）表面多孔型：薄膜型=惰性核+树脂薄层(1-2m)多孔型=惰性核+树脂薄层+硅胶微球。克服了多孔型离子交换树脂的不足，但交换容量低，柱子易超负荷。3）离子交换键合相：利用化学反应将离子交换基
19、团键合到惰性载体表面。载体可以是薄壳玻珠，也可以是多孔硅胶微粒。使用后者为载体，可得到性能稳定、耐压、高柱效的柱子。,2023/1/16,45,3.流动相 离子交换色谱流动相为盐类缓冲溶液（有一定pH和离子强度），通过改变pH、缓冲剂类型、离子强度、加入有机试剂和配位剂等条件来控制分配比k，从而改变交换剂的选择性、影响样品中待测物的分离。pH值：影响酸或碱的离解平衡，控制组分离子形式所占的分数。当组分以分子形式存在时，则不被保留；离子分数越高，保留值越大。常用的有柠檬酸盐、磷酸盐、甲酸盐、乙酸盐和氨水等。离子强度I：对保留值的影响比pH 更大。组分保留值受流动相中盐类总浓度控制。增加外加阴或阳
20、离子将增加它们对R+或R-的竞争能力，使组分保留值减小。通过加入不同种类的盐，可影响柱的选择性，因为不同物质对交换剂的亲和能力不同。有机溶剂：外加有机溶剂通常减小组分的保留值。其极性越小，保留值越小。常用的有机溶剂有甲醇、乙醇、乙腈和二氧杂环已烷等。配离子L：当大量 L 和组分 X 随流动相进入柱后，发生配位剂交换：RM-L+X RM-X+L该法用于分离各种氨基酸或碱类。思考：离子交换色谱法中，流动相常以无机盐的缓冲液为流动相。请问缓冲液的pH值及离子强度对分离各有何影响？离子交换色谱通常以什么为检测器？,2023/1/16,46,三、离子色谱法 离子色谱（IC）是70年代发展的新方法。其分离
21、原理与离子交换色谱原理一样，只是流出的各种离子用电导检测器检测。但由于流动相都是强电解质，其电导率比待测离子约高2个数量级，这种强背景电导会完全掩盖待测离子信号。为解决此问题，1975年Small 提出，在离子交换柱之后，再串结一根抑制柱。该柱装填与分离柱电荷完全相反的高容量的离子交换树脂。通过分离柱后的“样品和流动相”再经过抑制柱，使具有高背景电导的流动相转变为低背景电导的流动相，从而可用电导检测器检测各种离子的含量。例如：分析阳离子时，以无机酸为流动相，分离柱则采用阳离子交换剂，抑制柱为高容量的强碱性阴离子交换树脂，则发生下列反应：R+OH+HCl(流动相)R+Cl-+H2O R+OH+M
22、Cl(待测物)R+Cl+M+OH-可见，不仅大量酸转化为低电导的水，而且待测离子转化为具有更大淌度的碱。同样，若样品为阴离子，以无机碱为流动相，分离柱则采用阴离子交换剂，抑制柱为高容量强酸性阳离子交换剂。,2023/1/16,47,该法的不足之处在于：抑制柱要定期再生、谱峰在经过抑制柱后会展宽，降低分离度。因此有人提出了使用电导率很低的溶液（如苯甲酸盐稀溶液）作流动相。思考：IC分离中，何为抑制柱？分析阴离子时，抑制柱中应填充何种离子交换树脂？采用抑制柱的优缺点是什么？,阴离子分析:双柱；薄壳型阴离子交换树脂分离柱(325 cm)流动相：0.003 M NaHCO3+0.0024 M Na2C
23、O3，流量2.3 mL/min。七种阴离子在20min内基本上得到完全分离，各组分含量在350 ppm。,2023/1/16,48,四、离子对色谱法（IPC）离子对色谱主要用来分离强极性有机酸或有机碱。基本原理：将与待测物离子A电荷相反的离子B（称为对离子或反离子）加入到流动相（多为有机相）中，使待测离子A与对离子B形成离子对AB，该AB离子对的性质与A离子或B离子的性质不同，即间接改变了待测离子的保留特性。例如：固定相为非极性键合相，流动相为水溶液，于流动相中加入与待测离子A-有相反电荷的离子B+：由于离子对AB具有疏水性，因而被非极性固定相提取。其它待测离子A1，A2，A3.因与B离子间的
24、成对能力不同，而形成不同疏水性的离子对，使得各待测物在柱内的保留值不同，从而达到分离的目的。,2023/1/16,49,阴离子分离：常采用烷基铵类，如氢氧化四丁基铵或氢氧化十六烷基三甲铵作为对离子；阳离子分离：常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作为对离子；反相离子对色谱：非极性的疏水固定相(C-18柱)，含有对离子Y+的甲醇-水或乙腈-水作为流动相，试样离子X-进入流动相后，生成疏水性离子对Y+X-后；在两相间分配。思考：有一强极性有机酸混合物，若用离子对色谱法分离，请问在流动相中应加入阴离子还是阳离子来形成离子对？,2023/1/16,50,五、尺寸排阻色谱法 尺寸排阻色谱又称凝胶色谱，主要用于
25、大分子的分子分离。它是基于待测物分子的尺寸和形状不同来实现分离的。包括凝胶过滤色谱（GFC，以水为流动相）和凝胶渗透色谱（GPC，以有机溶剂为流动相）1.分离原理：固定相为化学惰性的多孔凝胶，它类似于分子筛，但孔径更大。凝胶内有一定大小的空穴，分子体积大的待测物不能渗入孔穴中而被排阻，较早地被淋洗出来，中等的部分渗透，小分子则完全渗透，最后流出色谱柱。即待测物分子按分子大小(分子量大小)先后从柱中流出。2.固定相3.流动相的要求：能溶解样品且与凝胶相似(润湿凝胶)、粘度小(增加扩散速度)。,2023/1/16,51,六、亲合色谱 主要用于生物大分子与固定相之间的特异亲合力进行选择性分离及纯化的
26、方法。分离原理：于载体表面先键合具有一般反应性能的环氧或联氨（称为间隔臂），然后再连接上配基，如酶、抗原或激素。当含有复杂混合试样的流动相流经这种经固定化的配基时，其中具有,亲合力特性的生物大分子与配基相互作用而被保留，无此作用的则被洗出；随后，改变流动相pH或组成，再将被保留的大分子组分以纯品的形式洗脱出来。特点：选择性过滤、纯化效果好。,2023/1/16,52,七、色谱分离方法的选择,2023/1/16,53,2023/1/16,54,液相色谱的柱子通常分为正相柱和反相柱。正相柱：大多以硅胶为柱，或是在硅胶表面键合-CN,-NH3等官能团的键合相硅胶柱；反相柱：填料主要以硅胶为基质，在其
27、表面键合非极性的十八烷基官能团（ODS）称为C18柱，其它常用的反相柱还有C8,C4,C2和苯基柱等。另外还有离子交换柱，GPC柱，聚合物填料柱等。,液相色谱柱的选择、使用、维护和常见故障及排除,2023/1/16,55,一、反相色谱柱的选择 1柱子的pH值使用范围 反相柱优点是固定相稳定，应用广泛，可使用多种溶剂。但硅胶为基质的填料，使用时一定要注意流动相的PH范围。一般的C18柱PH值范围都在2-8，流动相的pH值小于2时，会导致键合相的水解；当pH值大于7时硅胶易溶解；经常使用缓冲液固定相要降解。一旦发生上述情况，色谱柱人口处会塌陷。同样填料各种不同牌号的色谱柱不尽相同。如果流动相pH较
28、高或经常使用缓冲液时，建议选择pH范围大的柱子，例如戴安公司的Acclaim柱pH 2-9或Zorbax的pH 2-11.5的柱子。2填料的端基封尾（或称封口）把填料的残余硅羟基采用封口技术进行端基封尾，可改善对极性化合物的吸附或拖尾；含碳量增高了，有利于不易保留化合物的分离；填料稳定性好了，组分的保留时间重现性就好。如果待分析的样品属酸性或碱性的化合物，最好选用填料经端基封尾的色谱柱。,2023/1/16,56,二、液相色谱柱的使用 色谱柱在使用前，最好进行柱的性能测试，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变化的参考。在做柱性能测试时要按照色谱柱出厂报告中的条件进行（出厂测试所使用的条件是最
29、佳条件），只有这样，测得的结果才有可比性。注意：柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同。1、样品的前处理：a）最好使用流动相溶解样品；b）使用预处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质c）使用0.45m的过滤膜过滤除去微粒杂质。,2023/1/16,57,2、流动相的配制：液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的，因此要求流动相具备许多特点：a）流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱中（或长时间保留在柱中）；b）流动相与样品不产生化学反应；,2023/1/16,58,c）流动相的黏度要尽量小，以便得到好的分离效果；降
30、低柱压降，延长泵的使用寿命（可运用提高温度的方法降低流动相的黏度）；d）流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。如使用UV检测器，最好使用对紫外吸收较低的溶剂配制；e）流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡，导致实验无法进行；f）在流动相配制好后，一定要进行脱气。除去溶解在流动相中的微量气体既有利于检测，还可以防止流动相中的微量氧与样品发生作用。,2023/1/16,59,3、流动相流速的选择：因柱效是柱中流动相线性流速的函数，使用不同的流速可得到不同的柱效。对于一根特定的色谱柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。内径为4.6mm的色谱柱，流速一般选择1mlmin 内径为4.0mm柱，流速0.8
31、mlmin为佳。当选用最佳流速时，分析时间可能延长。可采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分析时间（如使用反相柱时，可适当增加甲醇或乙腈的含量）。,2023/1/16,60,注意：a）含水流动相最好在临实验前配制，尤其是夏天使用缓冲溶液作为流动相不过夜。最好加入叠氮化钠，防止细菌生长。b）流动相要求使用0.45 m滤膜过滤，除去微粒杂质。c）使用HPLC级溶剂配制流动相，使用合适的流动相可延长色谱柱的使用寿命，提高柱性能。,2023/1/16,61,三 色谱柱的维护1、色谱柱的平衡 反相色谱柱由工厂测试后是保存在乙腈/水中的。新柱应先使用10-20倍柱体积的甲醇或乙腈冲洗色谱柱。请一定确保你分
32、析样品所使用的流动相和乙腈/水互溶。操作步骤：a）平衡开始时将流速缓慢地提高，用流动相平衡色谱柱直到获得稳定的基线（缓冲盐或离子对试剂流速如果较低，则需要较长的时间来平衡）b）如果使用的流动相中含有缓冲盐，应注意用纯水“过渡”即每天分析开始前必须先用纯水冲洗30分钟以上再用缓冲盐流动相平衡；分析结束后必须先用纯水冲洗30分钟以上除去缓冲盐之后再用甲醇冲洗30分钟保护柱子。,2023/1/16,62,2、色谱柱的再生 长期使用的色谱柱，往往柱效会下降（柱子的理论塔板数减低）。可以对色谱柱进行再生，在有条件的实验室应使用一个廉价的泵进行柱子的再生。建议用来冲洗柱子的溶剂体积如下：色谱柱尺寸 柱体积
33、 所用溶剂的体积 1254 mmi.d.1.6ml 30 ml 2504 mm i.d.3.2ml 60 ml 25010 mm i.d.20ml 400 ml 选择再生方法：极性固定相（如Si，NH2*，DIOL基色谱填料）的再生：正庚烷氯仿乙酸乙酯丙酮乙醇水*；非极性固定相（如反相色谱填料RP18，RP8，CN等）的再生：水乙腈氯仿（或异丙醇）乙腈水注意：*在对NH2改性的色谱柱进行再生时，由于NH2可能以铵根离子的形式存在，因此应该在水洗后用0.1M的氨水冲洗，然后再用水冲洗至碱溶液完全流出；*0.05M稀硫酸可以用来清洗已污染的色谱柱，如果简单的用有机溶剂/水的处理不能够完全洗去硅胶表面吸附的杂质，在水洗后加用0.05M稀硫酸冲洗非常有效。,2023/1/16,63,3.色谱柱的维护a使用预柱保护分析柱（硅胶在极性流动相/离子性流动相中有一定的溶解度）b大多数反相色谱柱的pH稳定范围是2-7.5，尽量不超过该色谱柱的pH范围c避免流动相组成及极性的剧烈变化d流动相使用前必须经脱气和过滤处理e如果使用极性或离子性的缓冲溶液作流动相，应在实验完毕柱子冲洗干净，并保存于甲醇或乙腈中f氯化物的溶剂对其有一定的腐蚀性，故使用时要注意，柱及连接管内不能长时间存留此类溶剂，以避免腐蚀。,2023/1/16,64,Thanks for your attention!,
