生物化学与分子生物学 第三篇 遗传信息的传递课件.pptx

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1、,作者:,单位：,第十一章,真核基因与基因组,目录,第一节真核基因的结构与功能,第二节真核基因组的结构与功能,重点难点,熟悉,了解,掌握,基因、基因组的概念真核基因的基本结构、真核基因组的结构特点顺式作用元件的类型及特点,人基因组中重复序列的类型及特点多基因家族与假基因的概念,线粒体DNA结构人基因在染色体上的分布特征,真 核 基 因 的 结 构 与 功 能Structure and Function of Eukaryotic Genes,第一节,真核基因包含编码蛋白质或RNA的编码序列及其与之相关的非编码序列。真核基因结构最突出的特点是其不连续性。高等真核生物绝大部分编码蛋白质的基因都有内

2、含子，但组蛋白编码基因例外。编码rRNA和一些tRNA的基因也都有内含子。外显子与内含子接头处有一段高度保守的序列，即内含子5末端大多数以GT开始，3末端大多数以AG 结束，这一共有序列是真核基因中RNA剪接的识别信号。人们约定将一个基因的5端称为上游，3端称为下游；将基因序列中开始RNA链合成的第一个核苷酸所 对应的碱基记为+1，向5端依次为-1、-2等，向3端依次为+2、+3等。,一、真核基因的基本结构,真核生物断裂基因及两侧序列,基因结构,基因编码区中的DNA碱基序列决定一个特定的成熟RNA分子的序列。有的基因仅编码一些有特定功能的RNA，如rRNA、tRNA及其他小分子RNA等；大多数

3、基因通过mRNA进一步编码蛋白质多肽链。编码序列中一个碱基的改变或突变，可能使基因丧失原有功能或获得新功能。有些相同的DNA序列由于其起始位点的变化或mRNA不同的剪接产物可以编码不同的蛋白质多肽链。,二、基因编码区编码多肽链和特定的RNA分子,位于基因转录区前后并与其紧邻的DNA序列通常是基因的调控区，又称为旁侧序列（flanking sequence）。这些调控序列又被称为顺式作用元件（cis-acting element），包括启动子、上游调 控元件、增强子、绝缘子、加尾信号和一些细胞信号反应元件等。,三、调控序列参与真核基因表达调控,真核基因及调控序列的一般结构,1.启动子提供转录起始

4、信号启动子是DNA分子上能够介导RNA聚合酶结合并形成转录起始复合体的序列。大部分真核细胞基因的启动子 位于基因转录起点的上游，启动子本身通常不被转录；但有一些启动子（如编码tRNA基因的启动子）位于转 录起始点的下游，这些DNA序列可以被转录。真核生物主要有3类启动子（1）类启动子富含GC碱基对：具有类启动子的基因主要是编码rRNA的基因。类启动子包括核心启动 子（core promoter）和上游启动子元件（upstream promoter element，UPE）两部分。（2）类启动子具有TATA盒特征结构：具有类启动子的基因主要是能转录出mRNA且编码蛋白质的基因 和一些snRNA基

5、因。类启动子通常是由TATA盒、上游调控元件组成。有的类启动子在TATA盒的上游还 可存在CAAT盒、GC盒等特征序列。（3）类启动子包括A盒、B盒和C盒：具有类启动子的基因包括5S rRNA、tRNA、U6 snRNA等RNA分 子的编码基因。,真核基因三类启动子,2.增强子增强邻近基因的转录增强子是可以增强真核基因启动子工作效率的顺式作用元件，是真核基因中最重要的调控序列。（1）其能够在相对于启动子的任何方向和任何位置（上游或者下游）上发挥增强作用。（2）增强子序列距离所调控基因距离近者几十个碱基对，远的可达几千个碱基对。（3）通常数个增强子序列形成一簇，（4）有时增强子序列也可位于内含子

6、之中。（5）不同的增强子序列结合不同的调节蛋白。,沉默子是负调节元件沉默子（silencer）是可抑制基因转录的特定DNA序列，当其结合一些反式作用因子时对基因的转录起阻 遏作用，使基因沉默。绝缘子阻碍增强子的作用绝缘子（insulator）是基因组上对转录调控起重要作用的一种元件，可以阻碍增强子对启动子的作用，或者保护基因不受附近染色质环境（如异染色质）的影响。绝缘子阻碍增强子对启动子的作用可能通过影 响染色质的三维结构如DNA发生弯曲或形成环状结构。,真 核 基 因 组 的 结 构 与 功 能Structure and Function of Eukaryotic Genome,第二节,细

7、胞或生物体的一套完整单倍体遗传物质的总和称为基因组。病毒、原核生物以及 真核生物所贮存的遗传信息量有着巨大的差别，其基因组的结构与组织形式上也各 有特点，包括基因组中基因的组织排列方式以及基因的种类、数目和分布等。人类基因组包含了细胞核染色体DNA（常染色体和性染色体）及线粒体DNA所携带 的所有遗传物质。,人的基因组构成,真核基因组中基因的编码序列所占比例远小于非编码序列。高等真核生物基因组含有大量的重复序列。真核基因组中存在多基因家族和假基因。大多基因转录后发生可变剪接，80%的可变剪接会使蛋白质的序列发生改变。真核基因组DNA与蛋白质结合形成染色体，储存于细胞核内，除配子细胞外，体细胞的

8、 基因组为二倍体（diploid）。,一、真核基因组具有独特的结构,不同生物体基因组的比较,*指单倍体细胞内的染色体数目,人染色体上基因分布的特征基因在染色体上并不是均匀分布。基因密度最大的是第19号染色体，密度最小的是第13 号和Y染色体。染色体上存在着无基因的“沙漠区”，即在500kb区域内，没有任何基因的编码序列。,人的染色体大小示意图,真核细胞基因组存在着大量重复序列。人基因组中，重复序列占基因组长度的50以上。重复序列的长度不等，短的仅含两个碱基，长的多达数百、乃至上千个碱基。重复序列的 重复频率也不尽相同。高度重复序列（highly repetitive sequence）中度重复

9、序列（moderately repetitive sequence）单拷贝序列（single copy sequence）或(低度重复序列),二、真核基因组中存在大量重复序列,1.高度重复序列,高度重复序列是真核基因组中存在的、重复频率可达106次以上的短核苷酸重复序列，不编码蛋白质 或RNA。（1）高度重复序列按其结构特点分为2类。反向重复序列（inverted repeat sequence）：由两个相同顺序的互补拷贝在同一DNA链上反向 排列而成，反向重复的单位长度约为300bp或略短，其总长度约占人基因组的5，多数是散在，而 非群集于基因组中。卫星DNA（satellite DNA）：

10、卫星DNA的重复单位一般由210bp组成，成串排列，主要存在于 染色体的着丝粒区域，在人基因组中约占5%6%。,1.高度重复序列,（2）主要功能参与复制水平的调节。反向重复序列常存在于DNA复制起点区的附近，是一些蛋白质（包括酶）的结合位点。参与基因表达的调控。高度重复序列可以转录到核内不均一RNA分子中，而有些反向 重复序列可以形成发夹结构，有助于稳定RNA分子；参与染色体配对。如卫星DNA成簇样分布在染色体着丝粒附近，可能与染色体减数 分裂时染色体配对有关。,2.中度重复序列,中度重复序列指在真核基因组中重复数十至数千次的核苷酸序列，通常占整个单倍体基因组的1%30%。少数在基因组中成串排

11、列在一个区域，大多数与单拷贝基因间隔排列。依据重复序列的长度，中度重复序列分为两种类型。（1）短分散重复片段（short interspersed repeat segment，SINES）：平均长度约为300500bp，与平均长度约为1000bp的单拷贝序列间隔排列。拷贝数可达数十万。如Alu 家族，Kpn 家族和Hinf 家族等属于这种类型的中度重复序列。（2）长分散重复片段（long interspersed repeat segment，LINES）：平均长度为3 500bp5 000bp，与平均长度为13 000bp（个别可达到数万个碱基）的单拷贝序列间隔排列。,Alu 家族,哺乳类

12、动物包括人基因组中含量最丰富的一种短分散片段，平均每6kb DNA有一个Alu序列在单倍体人基因组中重复达3050万次，约占人基因组的3%6%每个单位长度中有一个限制性内切酶Alu的切点（AGCT），将其切成长130bp和170bp的两段 Kpn家族中度重复序列中仅次于Alu 家族的第二大家族重复序列中含有限制性内切酶Kpn的位点呈散在分布，拷贝数约为30004800个 Hinf 家族以319bp长度的串联重复存在于人基因组中重复序列中含有限制性内切酶Hinf 的位点,真核生物基因组中的rRNA基因也属于中度重复序列各重复单位中的rRNA基因都是相同的rRNA基因通常集中成簇存在，而不是分散于

13、基因组中，这样的区域称为rDNA区人类的rRNA基因位于13、14、15、21和22号染色体的核仁组织区，每个核仁组织区 平均含有50个rRNA基因的重复单位5S rRNA基因似乎全部位于1号染色体，每个单倍体基因组约有1000个5S rRNA基因。,3.单拷贝序列（低度重复序列）,单拷贝序列在单倍体基因组中只出现一次或数次，大多数编码蛋白质的基因属于这一类。在基因组中，单拷贝序列的两侧往往为散在分布的重复序列。单拷贝序列编码的蛋白质在很大程度上体现了生物的 各种功能。,1.多基因家族（multigene family）指由某一祖先基因经过重复和变异所产生的一组在结构上相似、功能相关的基因。（

14、1）基因家族成簇地分布在某一条染色体上，它们可同时发挥作用，合成某些蛋白质，如组蛋白 基因家族就成簇地集中在第7号染色体长臂3区2带到3区6带区域内。（2）一个基因家族的不同成员成簇地分布于不同染色体上，编码一组功能上紧密相关的蛋白质，如人类珠蛋白基因家族分为珠蛋白和珠蛋白两个基因簇，分别位于第16号和第11号染色体。,三、真核基因组中存在大量的多基因家族和假基因,基因超家族（superfamily gene）,一些DNA序列相似，但功能不一定相关的若干个单拷贝基因或若干组基因家族总称，例如免疫 球蛋白基因超家族、ras基因超家族。亚家族（subfamily）一个多基因家族中可有多个基因，根据

15、结构与功能的不同又可以分为亚家族。例如G蛋白中属ras 超家族约有50多个成员，根据其序列同源性程度又可进一步分为Ras、Rho和Rab三个主要 的亚家族。,4.假基因（pseudogene）基因组中存在的一段与正常基因非常相似但一般不能表达的DNA序列，以来表示。假基因根据其来源分为经过加工的假基因和未经过加工的假基因2种类型（1）经过加工的假基因：这类基因可能曾经有过功能，但在进化中获得一个或几个突变，造成了 序列上的细微改变阻碍了正常的转录和翻译功能，使它们不能再编码RNA和蛋白质产物；经过加工 的假基因通常缺少正常基因表达所需的调节序列、没有内含子、可能有poly(A)尾。（2）未经过

16、加工的假基因：来源于多拷贝或单拷贝基因的突变或者基因的不完全复制。人基因组中大约有2万个假基因，其中约2000个为核糖体蛋白的假基因。近些年发现，假基因也表 达有功能的ncRNAs。,线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）是细胞内的一种重要细胞器，是生物氧化的场 所，一个细胞可拥有数百至上千个线粒体。可以独立编码线粒体中的一些蛋白质，是核外遗传物质。mtDNA的结构与原核生物的DNA类似，是环状分子。人的线粒体基因组全长16 569bp，共编码37个基因，包括13个编码构成呼吸链多酶体系的一些多 肽的基因、22个编码mt-tRNA的基因、2个编码mt-rRNA（16S和

17、12S）的基因。,四、线粒体DNA的结构,人的线粒体基因组,通过基因组测序，人们对数种生物的基因组大小和所含有的基因数量有所了解。总体上来讲，在进化过程中随着生物个体复杂性的增加，基因组的总趋势是由小变大、基因数 也是由少变多。决定生物复杂性的因素：基因组大小、基因数、基因密度（gene density）等。人的基因组最大，复杂程度也最高，但所含的基因数量并不是最多。人的基因数目为2万个左右，仅比果蝇基因数量的1.5倍稍多，与线虫基因数量大致相当；人具 有而鼠没有的基因只有300个。人类基因组基因密度较低，因为基因组中转座子、内含子和调控序列较多，这些序列在进化过 程对遗传多样性的产生至关重要

18、。,五、人基因组约有两万个蛋白质编码基因,本章小结,基因是能够编码蛋白质或RNA等具有特定功能产物的、负载遗传信息的基本单位，除了 某些以RNA为基因组的RNA病毒外，通常是指染色体或基因组的一段DNA序列。基因的基本结构包含编码蛋白质或RNA的编码序列及其与之相关的非编码序列。基因组是指一个生物体内所有遗传信息的总和。真核基因组具有基因编码序列在基因组 中所占比例小于非编码序列、高等真核生物基因组含有大量的重复序列、存在多基因家族 和假基因、具有可变剪接，以及真核基因组DNA与蛋白质结合形成染色体，储存于细胞核 内等特点。线粒体DNA是核外遗传物质，可以独立编码线粒体中的一些蛋白质。人基因组

19、中约有两万个基因，分布在22条常染色体及2条性染色体，但并不是均匀分布。,本章知识点框架图：,真核基因与基因组,真核基因的结构与功能,真核基因组的结构与功能,基本结构：断裂基因,真核基因组 的结构特点,重复序列,多基因家族 与假基因,编码多肽链和特定 的RNA分子,调控序列,启动子,增强子,沉默子,绝缘子,线粒体DNA结构,人基因组结构及基因 在染色体上分布特征,高度重复序列 中度重复序列单拷贝序列（低度重复序列）,谢 谢 观 看,作者:,单位:,第十二章,DNA合成,目录,第一节DNA复制的基本规律,第二节 DNA复制的酶学和拓扑学第三节 原核生物DNA复制过程 第四节 真核生物DNA复制过

20、程 第五节 逆转录,重点难点,熟悉,了解,掌握,掌握DNA复制体系的组成、半保留复制的特点及其意义；掌 握DNA复制的基本规律，DNA聚合酶的类型及功能特点,DNA复制的过程，原核DNA复制与真核DNA复制的主要区 别；真核生物DNA端粒及端粒酶,非染色体DNA复制的其他形式；了解逆转录的发现发展了中 心法则,DNA复制的基本规律,The basic law of DNA replication,第一节,DNA复制的主要特征:,半保留复制(semi-conservative replication)双向复制(bidirectional replication)半不连续复制(semi-disco

21、ntinuous replication),一、DNA以半保留方式进行复制,半保留复制的概念:在复制时，亲代双链DNA解开为两股单链，各自作为模板，依据碱基配对规律，合成序列互补的子链DNA双链,子链继承母链遗传信息的几种可能方式:,全保留式,半保留式,混合式,密度梯度实验:,含15N-DNA的细菌培养于普 通培养液第一代继续培养于 普通培养液第二代,半保留复制的意义:依据半保留复制的方式，子代DNA中保留了亲代的全部遗 传信息，亲代与子代DNA之间碱基序列的高度一致遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的,G G T G A C C,A T G C G C T AA T C G T

22、 A G C C G C G A T C G T A G C G C,C C A C T G G,A T G C G C T AA T C G T A G C C G C G A T C G T A G C G C,A T G C G C T A A T C G T A G C C G C G A T C G T A G C G C,+,母链DNA,复制过程中形成 的复制叉,子代DNA,二、DNA复制从起始点双向进行,原核生物基因组是环状DNA，只有一个复制起点（origin）。复制从起点开始，向两个方向进行解链，进 行的是单点起始双向复制,复制中的放射自显影图象,ori,ter,AB环状双链

23、DNA及复制起始点复制中的两个复制叉复制接近终止点(termination,ter),C,真核生物每个染色体又有多个起点，呈多起点双向复制特 征。每个起点产生两个移动方向相反的复制叉，复制完成 时，复制叉相遇并汇合连接。从一个DNA复制起点起始 的DNA复制区域称为复制子（replicon）。复制子是含 有一个复制起点的独立完成复制的功能单位,53,ori,ori,ori,ori,35,53,ori,ori,ori,ori,35,5,5,3,3,5,5,3,复制,3,三、DNA复制以半不连续方式进行,5,3,53,解链方向,领头链(leading strand),后随链(lagging str

24、and),沿着解链方向生成的子链DNA的合成是连续进行的，这股链称为前导链（leading strand）另一股链因为复制方向与解链方向相反，不能连续延长，只能随着模板链的解开，逐段地从53生成引物并复制子链。模板被打开一段，起始合成一段子链；再打开一段，再起始合 成另一段子链，这一不连续复制的链称为后随链（lagging strand）沿着后随链的模板链合成的新DNA片段被命名为冈崎片段（Okazaki fragment）,四、DNA复制具有高保真性,“半保留复制”确保亲代和子代DNA分子之间信息传递 的绝对保真性高保真度DNA聚合酶利用严格的碱基配对原则是保证复 制保真性的机制之一；体内复

25、制叉的复杂结构提高了复制 的准确性；DNA聚合酶的核酸外切酶活性和校读功能以 及复制后修复系统对错配加以纠正,DNA复制的酶学和拓扑学,Enzymology and topology of DNA replication,第二节,参与DNA复制的物质:,底物(substrate):dATP,dGTP,dCTP,dTTP聚合酶(polymerase):依赖DNA的DNA聚合酶，简写为 DNA-pol模板(template):解开成单链的DNA母链引物(primer):提供3-OH末端使dNTP可以依次聚合其他的酶和蛋白质因子,(dNMP)n+dNTP(dNMP)n+1+PPi,一、DNA聚合酶催

26、化脱氧核苷酸间的聚合,全称：依赖DNA的DNA聚合酶(DNA-dependent DNA polymerase)简称：DNA-pol活性：53的聚合活性核酸外切酶活性,核酸外切酶活性:,5A GCTTCAGGATA,3,3TCGA AGTCCTAGCGAC,5,|?,35外切酶活性:能辨认错配的碱基对，并将其水解53外切酶活性:能切除突变的 DNA片段,（一）原核生物有3种DNA聚合酶DNA-polDNA-polDNA-pol,原核生物的DNA聚合酶,全酶结构包括：个核心酶1个-复合物（、6种亚 基）1对-亚基（可滑动 的DNA夹子）,DNA聚合酶全酶结构:,核心酶由、和亚基组成：亚基（130

27、 000）主要功能是合成DNA亚基具有35外切酶活性（复制保真性 所必需）亚基可增强其活性亚基可能起组装作用两侧的亚基发挥夹稳DNA模板链，并使酶沿模 板滑动的作用,-复合物由6种亚基组成：、2个-亚基分别和1个核心酶相互作用，其柔性连接区可以确保在复制叉1个全酶分子 的2个核心酶能够相对独立运动，分别负责合 成前导链和后随链功能：有促进全酶组装至模板上及增强核心酶 活性的作用,功能：对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空 隙进行填补,DNA-pol（109kD）:,小片段323个氨基酸5 核酸外切酶活性,大片段/Klenow 片段604个氨基酸DNA聚合酶活性 5 核酸外切酶活性,N

28、 端,C 端,木瓜蛋白酶,DNA-pol,Klenow片段是实验室合成DNA，进行 分子生物学研究中常用的工具酶,DNA-pol（120kD）:,DNA-pol II基因发生突变，细菌依然能存活DNA-pol 对模板的特异性不高，即使在已发生损伤的DNA模 板上，它也能催化核苷酸聚合。因此认为，它参与DNA损伤的应 急状态修复,（一）常见的真核细胞DNA聚合酶有5种,DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol,起始引发，有引物酶活性 参与低保真度的复制在线粒体DNA复制中起催化作用 合成后随链合成前导链,真核生物和原核生物DNA聚合酶的比较,真核生物的DNA

29、聚合酶,二、DNA聚合酶的碱基选择和校对功能,DNA复制的保真性至少要依赖三种机制:遵守严格的碱基配对规律聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能复制出错时有即时校对功能,（一）复制的保真性依赖正确的碱基选择,利用“错配”实验发现，DNA pol 对核苷酸的参入（incorporation）具有选择功能DNA pol 对不同构型糖苷键表现不同亲和力，因此实 现其选择功能,（二）聚合酶中的核酸外切酶活性在复制中 辨认切除错配碱基并加以校正,核酸外切酶(exonuclease)是指能从核酸链的末端把核苷酸依次水解出来的 酶，外切酶是有方向性的,A：DNA-pol的外切酶活性切除 错配碱基；并用其聚合活性

30、掺 入正确配对的底物B：碱基配对正确，DNA-pol不 表现活性,DNA pol 的校 读功能,三、复制中DNA 分子拓扑学变化,DNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把DNA解成单链，它才能起模板作用。,原核生物复制中参与DNA解链的相关蛋白质,（一）多种酶参与DNA解链和稳定单链状态,解螺旋酶(helicase)利用ATP供能，作用于氢键，使DNA双链解开成为 两条单链引物酶(primase)复制起始时催化生成RNA引物的酶单链DNA结合蛋白(single stranded DNA binding protein,SSB)在复 制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整,解链过程中正超螺旋的形

31、成,复制过程正超螺旋的形成：,AB,C,DNA只固定一端,DNA两端固定,解开10个碱基对（一个螺旋）,DNA将会 旋转一圈,DNA形成 一个超螺旋,解开10个碱基对（一个螺旋）,蛋白分子,DNA,负超螺旋 开口易化,正超螺旋 开口受阻,拓扑异构酶作用特点:既能水解、又能连接磷酸二酯键拓扑异构酶分类及作用机制：拓扑异构酶：切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结；适当 时候封闭切口，DNA变为松弛状态。反应不需ATP拓扑异构酶：切断DNA分子两股链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛 利用ATP供能，连接断端，DNA分子进入负超螺旋状态,拓扑酶的作用方式：,四、DNA连接酶连接复制中产生的单

32、链缺口,DNA连接酶(DNA ligase)作用方式：连接DNA链3-OH末端和相邻DNA链5-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段 相邻的DNA链连接成一条完整的链,DNA连接酶的作用：,功能:DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用也是基因工程的重要工具酶之一,DNA聚合酶，拓扑酶和连接酶催化3,5-磷酸二酯键生成的比较,原核生物DNA复制过程,DNA replication in prokaryotes,第三节,起始是复制中较为复杂的环节，在此过程中，各种酶和蛋白因子在复制起始点处装配引发体，形成复制叉并合成RNA引物需要解决两个问题：DNA

33、解开成单链，提供模板形成引发体，合成引物，提供3-OH末端,一、复制的起始,原核生物的复制起始部位及解链,（此图有误需修改）（此图错误部分包括文 字和少了一个9bp重复 序列已在图中标注，请 编辑帮忙修改）,Dna A,Dna B、Dna C,DNA拓扑异构酶,SSB,53,3,5,（二）引物合成和起始复合物形成,含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为起始复合物,解旋酶DnaB 5-3,SSB 单链结合蛋白（60/复制叉）,DnaG 引物酶催化RNA引物生成,DNA复制的启动需要多种酶参与，包括解旋酶、单链结合蛋白和引物酶。,起始复合物和复制叉的生成,53,3,5

34、引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子,引物,二、DNA链的延长,复制的延长指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成,5,dATP,dGTP,dTTP,dCTP,dTTP,dGTP,dATP,dCTP,OH 3,DNA-pol,领头链的合成：,领头链的子链沿着53方向可以连续地延长,后随链的合成,在复制叉同时合成前导链和后随链,单链结合蛋白、,DNA 聚合酶且l,一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一：II,II,l 一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一

35、一一一一一一一一：,ori,ter,E.coli,82,32,原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片 段在复制的终止点(ter)处汇合ori,ter,SV40,50,0,三、复制的终止,5,5,5,DNA-pol,OH,P,5,DNA-pol,dNTP,5,5,P,ATP,ADP+Pi,5,5,DNA连接酶,子链中的RNA引物被取代,冈崎片段,5 3,IR NA 引物,D NA 聚合酶 I,ID NA 连接酶,D NA 连接酶,:-,II,I I,:-I,真核生物DNA复制过程,Eukaryotic DNA replication process,第四节,真核生物与原核生物DNA复制的差异

36、：真核生物复制子多、冈崎片段短、复制叉前进速度慢等DNA复制从引发进入延伸阶段发生DNA聚合酶转换切除冈崎片段RNA引物的是核酸酶RNAse H和FEN1等,哺乳动物的 细胞周期,DNA合成期,G2,S,M,G1细胞能否分裂，决定于进入S期及M期这两个关 键点。G1S及G2M的调节，与蛋白激酶活 性有关蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子 而实施调控作用,真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制 子复制。复制有时序性，即复制子以分组方式 激活而不是同步启动复制的起始需要DNA-pol（引物酶活性）、pol 和pol 参与。还需解螺旋酶活性、拓扑 酶和复制因子(replication fac

37、tor,RF),一、真核生物复制的起始与原核基本相似,酵母染色体含有多个复制起点。酵母复制起点为自主复制序列（autonomously replicating sequences，ARS）：元件A(富含A/T的共有序列)：结合一个特异的蛋白 质复合物复制起点识别复合物(ORC)3个序列(B1、B2和B3)可以增加复制起点的效率，其中B2的9个碱基与上述ARS共有序列相同,酵母复制起始点,真核DNA复制叉主要蛋白质的功能,现在认为pol 主要催化合成引物，然后迅速被具 有连续合成能力的DNA pol 和DNA pol 所替 换，这一过程称为聚合酶转换。DNA pol 负责 合成后随链，DNA p

38、ol 负责合成前导链。,二、真核生物复制的延长发生DNA聚合酶转换,前导链：出现在引发后期后随链：发生于每个冈崎片段合成之际发生DNA聚合酶转换的原因是Pol 不具备 持续合成能力DNA聚合酶转换的关键蛋白是RFC,DNA聚合酶/转换,真核DNA聚 合酶转换和 后随链合成,35,前导链,35,3,5,亲代DNA,后随链35,引物,核小体,三、真核生物DNA合成后立即组装成核小体,染色体DNA呈线状，复制在末端停止复制中冈崎片段的连接，复制子之间的连接染色体两端DNA子链上最后复制的RNA引物，去除后留下空隙,四、端粒酶参与解决染色体末端复制问题,切除引物的两种机制,线性DNA复制一次端粒缩短,

39、5,3,53,5,3,35,+,5,3,3,3,3,5,5,端粒（telomeres）由富含TG的重复序列组成人的端粒重复序列为5-(TnGn)x-3这些重复序列多为双链，但每个染色体的3 端比5端长，形成单链ssDNA。这一特殊结构 可解决染色体末端复制问题,组成：端粒酶RNA(human telomerase RNA,hTR)端粒酶协同蛋白(human telomerase associated protein 1,hTP1)端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTRT),端粒酶(telomerase),端粒酶（telomerase

40、）是一种核糖核蛋白（RNP），由RNA和蛋白质组成端粒酶以自己的RNA组分作为模板，以染色体的3端ssDNA（后随链模板）为引物，将端粒序列添加于染色体 的3 端。这些新合成的DNA为单链,端粒酶催化作用的爬行和端粒的延长过程,真核所有染色体DNA复制仅仅出现在细胞 周期的S期，而且只能复制一次,五、真核生物染色体DNA在每个细胞周 期中只能复制一次,前复制复合物在G1期形成而在S期被激活,复制基因（replicator）是指DNA复制起始 所必需的全部DNA序列真核细胞DNA复制的起始分两步进行，即复 制基因的选择和复制起点的激活,ORC至少募集两种解旋酶加载 蛋白Cdc6和Cdt1,复制起

41、点识别复合物（origin recognition complex，ORC）识别并结合复制基因,三种蛋白质一起募集真核细胞解旋酶Mcm2-7,前复制复合物（pre-RC）的形成,pre-RC的激活 和组装真核DNA复制叉,CDK控制pre-RC的形成和激活,真核细胞通过依赖细胞周期蛋白的蛋白激 酶（cyclin-dependent kinases，CDK）严格 控制pre-RC的形成和激活Cdk功能：激活pre-RC，以起始DNA复制抑制形成新的pre-RC,六、真核生物线粒体DNA按D环方式复 制D-环复制（D-loop replication）是线粒 体DNA的复制形式,DNA-pol d

42、NTP,逆转录reversetranscription,第五节,逆转录(reversetranscription)逆转录酶(reverse transcriptase),逆转录酶,一、逆转录病毒的基因组RNA以逆 转录机制复制,RNA,DNA,逆转录病毒细胞内的逆转录现象:,RNA 模板,逆转录酶,RNA酶,DNA-RNA杂化双链单链DNA,逆转录酶,双链DNA,RNA病毒在细胞内复制成双链DNA的前病毒(provirus)。前 病毒保留了RNA病毒全部遗传信息，并可在细胞内独立繁殖。在 某 些 情 况 下，前 病 毒 基 因 组 通 过 基 因 重 组(recombination)，参加到细

43、胞基因组内，并随宿主基因一 起复制和表达。这种重组方式称为整合(integration)。前病 毒独立繁殖或整合，都可成为致病的原因,逆转录酶催化的cDNA合成,试管内合成cDNA:,cDNA complementary DNA以mRNA为模板，经逆转 录合成的与mRNA碱基序列互 补的DNA链分子生物学研究可应用逆 转录酶，作为获取基因工程目 的基因的重要方法之一，此法 称为cDNA法,逆转录酶,A AA A T T T T,AAAA,SI核酸酶,DNA聚合酶,碱水解T T T T,逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中的重大发现逆转录现象说明：至少在某些生物，RNA同样兼有遗传 信息传代

44、与表达功能对逆转录病毒的研究，拓宽了20世纪初已注意到的病毒 致癌理论,二、逆转录的发现发展了中心法则,本章小结,1、DNA复制的基本特点2、原核生物的复制过程包括起始、延长和终止（1）起始是将DNA双链解开形成复制叉（2）复制的延长由引物或延长中的子链提供3-OH，供dNTP掺入生成磷酸二酯键，延 长中的子链有前导链和后随链之分，复制产生的不连续片段称为冈崎片段（3）复制的终止需要去除RNA引物、填补留下的空隙并连接片段之间的缺口使成为连续 的子链,本章小结,3、真核生物复制发生于细胞周期的S期，其过程与原核生物相似，但更为复杂和精致。复 制的延长和核小体组蛋白的分离和重新组装有关。复制的终

45、止需要端粒酶延伸端粒DNA4、非染色体基因组采用特殊的方式进行复制,本章知识点框架图：,DNA复制,真核生物复制,起始：与原核生物基本相似延长：DNA聚合酶转换；核小体组蛋 白的分离和重新组装终止：需要端粒酶延伸端粒DNA,谢 谢 观 看,作者:,单位:,第13章,DNA损伤和损伤修复,目录,第一节DNA损伤,第二节DNA损伤修复第三节DNA损伤及其修复的意义,重点难点,熟悉,了解,掌握,直接修复、切除修复、重组修复和跨越损伤修复等DNA损伤 修复途径。,不仅DNA损伤，DNA损伤修复障碍同样与肿瘤、衰老以及免 疫性疾病等多种疾病的发生密切关联,1）DNA损伤的类型；2）究竟有哪些因素可引发D

46、NA损伤；3）体外因素是通过体内因素引发DNA损伤的。,DNA损伤,第一节,目录,一.多种因素通过不同机制导致DNA损伤,二.DNA损伤有多种类型,一.多种因素通过不同机制导致DNA损伤,DNA损伤的定义,各种体内外因素所导致的DNA组成与结构的变化称为DNA 损伤（DNA damage）,DNA损伤诱发因素,体内因素,体外因素,DNA短重复序列（复制打滑）,DNA本身的热不稳定性,环境辐射,化学毒物,药物,病毒感染,其他生物代谢物,碱基异构互变,4种dNTP浓度不平衡,机体自身代谢物,物理和化学因素 引发DNA的损伤,X,低波长紫外线照射致使胸腺嘧啶二聚体形成,二.DNA损伤有多种类型,DN

47、A损伤的类型,DNA断裂DNA交联,碱基错配,碱基损伤糖基破坏,碱基损伤化学毒性分子通过对碱基的某些基团进行修饰，改变碱基的 理化性质，破坏碱基的结构。比如，亚硝酸等可导致碱基 脱氨；在羟自由基的攻击下，嘧啶碱基易发生加成、抽氢 等反应，导致碱基环破裂；具有氧化活性的物质可造成DNA中嘌呤或嘧啶碱基的氧化修饰，形成8-羟基脱氧鸟苷或 6-甲基尿嘧啶等氧化代谢产物。,脱氧鸟苷的氧化,糖基破坏DNA分子中的戊糖基的碳原子和羟基上的氢可能与自由 基反应，由此戊糖基的正常结构被破坏。,碱基错配碱基类似物的掺入、碱基修饰剂的作用可改变碱基的性质，导致DNA序列中的错误配对。在正常的DNA复制过程中，存在

48、着一定比例的自发的碱基 错配发生，最常见的是组成RNA的尿嘧啶替代胸腺嘧啶掺 入到DNA分子中。,DNA断裂DNA断裂包括DNA单链断裂和DNA双链断裂。DNA链断裂是电离辐射致DNA损伤的主要形式。某些化学毒剂也可导致DNA链断裂。碱基损伤和戊糖基破坏均是引起DNA断裂的原因。,DNA交联DNA损伤中有多种DNA交联形式。DNA分子中同一条链中的两个碱基以共价键结合，称为DNA 链内交联（DNA intrastrand cross-linking）。低波长紫外线照 射后形成的嘧啶二聚体就是DNA链内交联的最典型的例子。DNA分子一条链上的碱基与另一条链上的碱基以共价键结合，称为链间交联（DN

49、A interstrand cross-linking）。DNA分子还可与蛋白质以共价键结合，称为DNA-蛋白质交联（DNA protein cross-linking）。,DNA损伤修复,第二节,目录,一.直接修复,二.切除修复一.重组修复二.跨越损伤修复,400nm光子次甲四氢叶酸FADH2T-TT+T,嘧啶二聚体的直接修复,甲基化碱基的直接修复,突变的结果,DNA复制,DNA复制,6-O-甲基鸟嘌呤,修复的结果,带有活性SH基团的甲基转移 酶结合在甲基化的碱基部位,甲基转移酶将甲基结合 在自身SH上，完成修复,甲基化后失活 的甲基转移酶,DNA连接酶,5,3,5,3,单链断裂切口的直接修

50、复,二.切除修复,碱 基 切 除 修 复,DNA糖苷酶特 异性识别并水 解受损碱基，产生AP位点,AP位 点 的 形 成 机 制,核苷酸切除修复,着色性干皮病（xeroderma pigmentosum，XP）,Autosomal recessive,着色性干皮病相关基因，XPA、XPC、XPD、XPF和XPG编码蛋白参与核苷 酸切除修复系统。,人类XP相关的DNA损伤核苷酸切除修复系统缺陷基因,转录偶联修复核苷酸切除修复不仅能够修复整个基因组中的损伤，而且还能够 修复那些正在转录的基因的模板链上的损伤，后者又称为转录偶 联修复。在转录偶联修复中，由RNA聚合酶承担起识别损伤部位的任务。,三.