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1、,荧光原位杂交（FISH）技术血液肿瘤诊疗中的应用,一、技术 二、质控 三、临床应用四、多技术结合应用案例,技术理论,1950-1960,1960-1970,1970-1980,1980-1990,显带时期,非显带时期,1888提出 染色 体,1914染色体 畸变导 致肿瘤,1956确定 染色 体46 条,1958应用 于血 液学,1960发现Ph 染色体 CML,显带技 术高速 发展 G/R,多种血 液病相 关异常 核型被 发现,FISH中期/间期,多色 FISH,微阵列技术 aCGH、aSNP,CGH技术,分子遗传,细胞遗传学发展简史,FISH技术的发展1990年FISH1992年CGH1
2、996年24色FISH（SKY、M-FISH、RX-FISH）2001年array CGH,技术原理,A,G,G,C,T,A,T,T,C,C,G,A,T,A,COVALENT BOND,F,F,Specimen DNA,FISH Probe DNA,操作步骤,FISH样本的制备（染色体制备、细胞滴片制备）探针制备（体系：杂交缓冲液、蒸馏水、探针）探针标记杂交（76变性10min、37杂交10h）洗脱DAPI复染荧光显微镜检测结果分析,FISH技术的特点,操作简便，稳定，人员培训较快 方法敏感，特异性好，检测效率高，能迅速得到 结果，24小时就可以完成检测 标本来源丰富，细胞不需培养，间期细胞，
3、分裂 中期细胞、分化或未分化细胞及死亡或存活的细 胞皆可以被检测 可与多种技术结合（细胞形态学、免疫学、流式 细胞术），可回顾性分析,可确定恶性细胞的克隆 起源或鉴别良恶性细胞,FISH技术的局限性,异常检测取决于能否获得相应探针 三体检测敏感性高于单体或缺失 骨髓、外周血标本较实体瘤、石蜡切片好处理 不能检测全基因组异常（间期FISH）,FISH主要仪器,FISH分析工作站（荧光显微镜、分析照相软件）荧光原位杂交仪 恒温水浴槽 高速离心机 培养箱 微量加样器pH仪,FISH技术比较,FISH探针种类,着丝粒探针,位点探针,涂染探针,双色单融合探针,额外信号探针,双色双融合探针,正常,异 常,
4、双色分离探针,数量、位点探针,人类细胞遗传学命名,nuc ish(CEP82)400nuc ish(BCR,ABL)2400nuc ish(BCR,ABL)3,(BCR con ABL2)380/400nuc ish(MLL2)400 nuc ish(MLL2)(5MLL sep 3MLL1)100/200 nuc ish(CEPX2)2/(CEPX,CEPY)1398,A:nuc ish(ABL,BCR)2B:nuc ish(ABL 2,BCR 3),ABL,BCR,A,ABL,BCR,B,A:nuc ish(ABL,BCR)3(ABL con BCR2)B:nuc ish(ABL,BCR)
5、4(ABL con BCR3)C:nuc ish(ABL 3,BCR 2)(ABL con BCR1),ABL,BCR,B,BCR,ABL,A,C,ABL,BCR,TEL,AML1,A:nuc ish(TEL2,AML13)(TEL con AML11)B:nuc ish(TEL1,AML14)(TEL con AML11)C:nuc ish(TEL2,AML15),AML1,TEL/AML1,A,AML1,TEL,B,C,A,B,C,D5S721,D5S721,D5S721,EGR1EGR1,EGR1,A:nuc ish(D5S23/D5S7211,EGR11)B:nuc ish(D5S23
6、/D5S7212,EGR11)C:nuc ish(D5S23/D5S7213,EGR11),质量控制,质量管理内容,商品探针、自配试剂验证 标准化流程及规范化操作（前处理、实验操作）规范判读标准 建立本实验室判读阈值 建立临床生物参考区间,FISH操作流程,样本制备：细胞、骨髓、外周血、组织等制片：细胞悬液滴片或石蜡组织切片预处理：2SSC，固定液，NaSCN酶消化：胃蛋白酶，蛋白酶K变性：温度杂交：互补结合，温度洗涤：无附离子溶液，PH，温度复染：DAPI II,读片：,荧光显微镜，滤镜,FISH技术要点,样本浓度、切片厚度、细胞状态 充分低渗与固定 制片环境温度与湿度 探针充分混匀 变性液
7、pH与温度 橡皮泥严密封片 洗脱液温度 抗衰变剂,规范判读,规范正常和异常信号杂交成功率75%计数数量、方法：单人，分别于不同区域各连续计数200个细胞双人，每人于不同区域各计数200个细胞,计数规范,信号判读误差,分离信号误判,石蜡切片误差,建立阈值,选取正常样本10-20份建立针对探针的假阳性率 统计方法x+3SD 分布（95%可信区间）结合临床逐步建立生物参考区间,结果及报告,临床应用,FISH临床应用,检测染色体数目与结构异常疗效分析鉴定标记染色体检测早期复发鉴定移植后早期复发鉴定肿瘤细胞的细胞系列基因定位、病灶组织定位,FISH常用探针的组合应用,结语精准方法，细致分析新技术及多学科技术联合探讨特征性染色体异常分子机制疗效判断预后评估，指导靶向和个体化治疗,
