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1、实验13 DNA片段的PCR扩增,1、用PCR技术对DNA进行扩增2、用琼脂糖凝胶电泳技术对扩增后的DNA进行检测,1,实验步骤,2,DNA在体内复制的条件是什么？,模板：酶：原料、能量：,解旋酶、DNA聚合酶等。,DNA分子的每条链,dATP、dGTP、dCTP、dTTP,引物：,温和的反应条件,3,DNA分子的结构,4,合成DNA分子的原料脱氧核苷三磷酸,5,合成DNA分子的原料脱氧核苷三磷酸,dATP dGTP dCTP dTTP,6,聚合反应机理：,7,DNA聚合酶,8,不同细胞的细胞周期,PCR技术可在几小时内，将特定核酸序列扩增百万倍!,9,PCR的概念,PCR（Polymeras
2、e Chain Reaction,聚合酶链反应）是指在体外，通过特异DNA引物扩增核酸分子中某个特定区域的技术。,10,PCR的反应体系DNA模板原料：dNTP(dATP、dGTP、dCTP、TTP)；酶：Taq聚合酶（嗜热细菌中分离得到）引物：（单链DNA片段）Mg2+（维持酶活性所必需）PCR缓冲液：维持pH，保护Taq酶,11,PCR技术原理,12,PCR三步曲,13,PCR仪,14,用于PCR的预混液（500L 体系）：ddH2O 310 L10butter 50 LMgCl2 40 LdNTP混合液 20L引物1 25L引物2 25L模板DNA 25L Taq DNA聚合酶 5L,标
3、记一个微量离心管，用取样器取20 L的预混液加入到该管中。,15,反应试剂 用量PCR SuperMix 10L引物（浓度10M）1L引物（浓度10M）1L模板DNA 5LddH2O 3L总体积 20L,16,微量可调移液器（一档吸、二档排）,17,PCR反应参数：,变性 94 30 s,退火 52 30 s,延伸 72 60 s,预变性 94 300 s,保温 72 600 s,循环次数 35,18,1、基本概念 以琼脂糖凝胶作为介质,DNA在外加电场的作用下泳动的技术。2、实验原理 琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。,琼脂糖凝胶电泳,
4、19,琼脂糖凝胶电泳基本原理,20,21,琼脂糖凝胶电泳的过程,22,将凝胶倒入制胶器的槽中（60oC）,将琼脂糖加入电泳缓冲液,在微波炉中加热溶解至透明。,制 胶,23,将梳子从制胶槽中拔出,24,取出凝胶板放入电泳槽中,向电泳槽中加入电泳缓冲液至没过凝胶,25,琼脂糖凝胶电泳中缓冲液的作用1、增加电导率；2、维持电泳过程中的合适的pH。,26,吸取PCR反应产物10L。注意吸头要插入到管底，才能取到PCR产物。,将PCR产物与加样缓冲液充分混合（吸排几次）,混 样,27,常用的上样缓冲液配方及各成分的作用,蔗糖,使样品呈色，便于上样，形成可见指示带，预测电泳进程。,溴酚蓝,增加样品密度，保证DNA均匀沉入加样孔内。,核酸荧光染料,可嵌合入DNA分子，在特定激发光源的激发下可发出荧光，荧光强度与DNA含量成正比。,（需要与加样缓冲液混合）,28,加 样,29,进行电泳10-20分钟,电 泳,30,实验用的核酸荧光染料与DNA嵌合后，在DNA图谱观察仪的可见光下发射黄绿色荧光。,电泳结果的观察在DNA电泳图谱观察仪中观察核酸条带并拍照。,31,PCR的应用,PCR具有省时、操作简便、特异性强、灵敏度高、效率高、应用范围广等特点。PCR技术在分子生物学、医学和案件侦破等领域得到广泛应用。,32,
