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1、,The Rotor-Gene Q应用培训,5 种型号，满足不同的需要Rotor-Gene Q 2Plex Rotor-Gene Q 2Plex HRM Rotor-Gene Q 5Plex Rotor-Gene Q 5Plex HRM Rotor-Gene Q 6Plex,产品概况,工作过程,旋转模式,仪器运行时转盘速度 400 RPM(加热和冷却)高速数据收集 样品旋转一次，数据收集一次(0.15 sec)重力作用让试剂都在管底 除去气泡和浓缩 组分不会形成沉淀持续运动保证无差异 孔与孔间的温度和光学,离心式鼓风机混匀腔体内的空气,腔体门关上，密封腔体内的空气,转盘上的孔能让空气自由通过,
2、升温,加热开,空气进,离心式鼓风机把空气吸入腔体内,腔体门打开，排出热空气,加热关,转盘上的孔能让空气自由通过,降温,离心式鼓风机混匀腔体内的空气,光学通路,光学通路,激发光,发射光,PCR 转子和PCR管类型 1,36 孔转子-适用 0.2 ml 平盖 PCR 管推荐反应体积20 50 L,72 孔转子-适用 0.1 ml PCR连管推荐反应体积10 50 L,#981005；#981008,#981103；#981106,转盘 72-72 个样品Rotor-Disc 72，管容积50 L 推荐反应体积20 25 L 需要密封膜和加热器,转盘 100-100个样品Rotor-Disc 100
3、，管容积30 L推荐反应体积15 25 L 需要密封膜和加热器,加热器，#9019725,Rotor-Disc 72，#981301,Rotor-Disc 100，#981311,密封膜，#981601,PCR 转子和PCR管类型 2,加热器,用来密封 Rotor-Disc密封后不能取下工作流程预热取下膜中间的封纸把膜放在 Rotor-Disc正上方放进入加热器中，拉下压杆等警报音响，从加热器中取出注意 至少放置10秒冷却把膜多余的部分撕走小心地从加热板上取下Rotor-Disck,开始,点击此图标,运行设置,运行设置-Quick Start 模式,选择模板,运行设置-Quick Start
4、模式,选择转子,运行设置-Quick Start 模式,确定步骤之Hold,运行设置-Quick Start 模式,确定步骤之Cycling,运行设置-Quick Start 模式,确定步骤之Cycling,关于 Acquiring,运行设置-Quick Start 模式,确定步骤之Cycling,关于 Acquiring,运行设置-Quick Start 模式,确定步骤之Melt选做,运行设置-Advanced 模式,选择模板,运行设置-Advanced 模式,选择转子,运行设置-Advanced 模式,输入信息,运行设置-Advanced 模式,步骤和检测设置,运行设置-Advanced
5、模式,步骤和检测设置之确定步骤,与Quick Start模式的确定步骤同,运行设置-Advanced 模式,步骤和检测设置之Gain Optimisation,运行设置-Advanced 模式,步骤和检测设置之Gain Optimisation,运行设置-Advanced 模式,Channel 设置需要的数据收集通道，如果设置了多个通道，确定后有后续的相应通道的对话框弹出。Tube Position 保证所选的位置是能够反应并发荧光的(一般是标准品)。,Target Sample Range 与所用的检测化合物有关：嵌入式染料(Intercalating dyes)应设置为1-3Fl单位；探针
6、染料(Probes)一般应设置为 5-10Fl 单位；Quenched FRET 检测 应设置为70-80 Fl 单位，因为随着反应进行其荧光值将降低。Acceptable Gain Range 应为默认的-10 to+10,步骤和检测设置之Gain Optimisation,运行设置-Advanced 模式,步骤和检测设置之Gain Optimisation,运行设置-Advanced 模式,设置完成,关于Long range:在到达设置的循环数后，每一循环该步骤（一般设置变性阶段）都增加1秒。,关于Touchdown:在到达设置的循环数后，每一循环的该步骤（一般设置退火阶段）都降低1。,M
7、elt:从一个较低温度升到一个较高温度，溶剂的特性，与核酸的特有属性。,HRM:High Resolution Melt，高分辨率的熔解曲线，只有在装了HRM硬件的仪器上才能运用。,运行设置-额外设置 1,关于Optical Denaturation Cycling:用荧光强度来判断变性是否完成,运行设置-额外设置 2,运行设置补充说明-Data Acquisition,设置运行程序时要设置数据采集点,数据采集点可以在任何的一个步骤的终结时，并以蓝色的点作标记。,可以通过点击“Acquiring”作数据收集的设置。,从列表中选择需要的数据收集通道，可以选择多通道。,点击“Dye Chart”可
8、观测数据收集通道的信息，包括激发光和发射光波长，可以应用的染料或显色剂。,在程序的任何或所有步骤都能设数据收集点。,当数据曲线饱和，会在纵坐标100处形成横线。,设置和调整Gain 值 1,设置Gain值，让所有收集到的数据都在检测器(PMT)能检测的范围内 如果Gain值：过低 信号会因埋没在在本底噪声内而漏掉；过高 信号会超出范围(饱和).,如果熔解曲线中，开始的一段时间纵坐标100处形成横线，熔解曲线应用较低的Gain设置来收集数据，但无需再重复做扩增反应。,实际数据的不会因Gain值设置而改变，Gain值设置改变了也能反映实际的数据变化趋势。,每个数据采集通道的Gain值范围是-10
9、10：-10为最低的敏感度；+10 最高敏感度。,Gain值设置每增加1，对PMT的输入电压约能增加2倍，这样对荧光检测的敏感度能增加2倍。,Gain值的设置不可能每次都适用，最好能在hold阶段根据实验的奔底而做出改变。使用 Auto-Gain设置能自动检测反应初始时的荧光强度，设定出合适的Gain值。,当使用Auto-Gain 设置时，在运行初始会出现该界面。,设置和调整Gain 值 2,编辑样品,1.命名样品,2.选择样品的“Type”：Unknown None NTC Standard Positive control Negative control Calibrator,4.Gro
10、ups 用作统计分析,5.Given Conc.只有type是”Standard”时可编辑，用于制作标准曲线。,3.是否选择 Selected,6.Color用于颜色区分图表中不同的样品。,综述:Absolute Quantification of mRNA using real time reverse transcription polymerase chain reaction assaysSA BustinJ.Mol.Endo 2000 25,169-193,标准曲线通过已知浓度的cDNA/RNA建立 关键因素:-DNA/RNA 片段要纯，单一片段-移液准确-标准样品稀释准确，平行性好
11、,绝对定量,绝对定量,标准曲线由5个或以上已知浓度样品而确定。一般每个浓度的样品做3个重复。如果每个梯度相差10倍，最理想的状态是，PCR的效率足够高到达2，预期Ct值能相差3.162。3.162是10的平方根。未知浓度的目标样品，其浓度和荧光值的变化规律与标准曲线一致。,CT,amount,1.曲线上的Ct与浓度的log关系2.标准曲线,3.根据标准曲线计算反应效率反应效率与斜率(m)相关E=10(-1/m)1,E=1=100%.,4.判定系数(R2)表示假设值与真实值的相关性，越接近1相关性越好。,绝对定量与反应效率,绝对定量,绝对定量Absolute Quantitation,绝对定量,
12、绝对定量的准确性完全决定于标准样品的准确性,绝对定量,参考文献:Absolute Quantification of mRNA using real time reverse transcription polymerase chain reaction assaysSA BustinJ.Mol.Endo 2000 25,169-193,标准曲线由已知浓度的cDNA/RNA构建关键因素:-DNA/RNA 一定是纯的，只有一种片段的-移液准确-稀释准确平行性好-未知浓度的样品的点能落在标准曲线上,绝对定量,相对定量,Analysis Quantitation Cycling A Green Sh
13、ow OK Threshold 手动调阈值，得出 Ct值,熔解的特性是不同核酸的固有特性,一般是用嵌入式染料分析PCR产物，加热熔解从双链到单链不同的片段（如碱基序列不同，GC含量不同）有不同的熔解特性HRM十分敏感，能够区分一个碱基改变而引起的差别(e.g.SNPs)HRM 比较熔解曲线的型状和温度来区分不同样品的特性,HRM原理,双链产物,单链产物,HRM 试剂,嵌入式染料的荧光随着双链的解开而降低，其荧光强度与解链的特性相关高精度的温度控制和 光学数据收集，能得到十分详细和分辨率高的数据。,HRM工作流程,扩增设置正常的PCR步骤和HRM步骤，用嵌入式染料(e.g SYTO 9)每个基因
14、型都应设置Control(eg.已确定的wild-type,heterozygote,variant样品)检测扩增曲线和扩增效率(扩增不好，HRM的结果也不好)HRM 分析运行HRM 分析指定controls观测结果,HRM运行设置,HRM分析,HRM分析,仪器的维护保养,1.光学检测镜头定期清洁，棉签蘸酒精擦拭光学检测镜头。2.保持实验台清洁防止杂物进入，保证降温效果，应保持仪器附近区域的清洁，特别是仪器底部纸屑、毛发等杂物。3.常保持仪器盖关闭4.腔体污染后的清洁先用物屑纸巾蘸0.1%的次氯酸钠溶液擦拭腔体，然后用PCR级的水清洁干净。,问题解决,Online Help文件：HelpContents(或在New Run对话框中点击“Help”)出现Online Help文件。包含了RGQ软件和硬件的详细信息（例如，如何装载样品，设置实验，进行特殊的分析等），可以据关键词搜索。,“Send Support Email”：Help Send Support Email在“Send Support Email”对话框中选择需要发送的文件点击“E-mail”图标填写收件人，主题(注意附件是需要答疑的文件的压缩包*.zip)发送；或“Save”保存成*.zip文件，然后email或拷贝给相关人员。,
