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1、第六章 个别细胞和组织的培养,类型：正常细胞培养肿瘤细胞培养,第一节 正常细胞培养,正常细胞，在体外培养时都不易生长，建立细胞系更难。正常细胞难培养的原因是它们是分化的细胞，对体外生存条件要求严格.但只要一切条件适当仍有培养成功可能。,一、上皮细胞类培养,上皮细胞可来源于外、内、中三个胚层；培养中只有源于外和内胚层的细胞能反映出上皮细胞的特征，细胞呈膜状生长的特点。,上皮细胞培养有三个难点：需求特殊底物，如在底物上涂有胶原底层则利于细胞生长；需求特殊培养基；与上皮细胞相邻的成纤维细胞常与上皮细胞同时混杂生长，并常压过上皮细胞。纯化和延长上皮细胞生存期是上皮细胞培养的关键之一。,(一)表皮细胞培
2、养1特点：在有胶原的底物上易生长；把人或小鼠表皮细胞培养在以3T3 细胞为饲养层(用射线照射后)上时，细胞易生长并可发生一定程度的分化现象。降低pH、Ca2+的含量和温度等，均利于表皮细胞生长。向培养基中加氢化可的松(10 g/m1)、10-6M的异丙基肾上腺素(Isoproterenol)和10 ng/m1 促表皮生长因子(EGF)能促表皮细胞生长。,【饲细胞】饲细胞(Feeder Cells)也称滋养细胞，是一层经过射线照射或丝裂霉素伤害处理的、用作克隆细胞附着底物的细胞层。饲细胞作用：有同化营养液的能力。饲细胞能促克隆细胞的生长，利于克隆的形成。克隆形成后饲细胞渐死亡，换液时清除。,饲细
3、胞的制备：(1)取原代培养的人或动物胚胎成纤维细胞，90%汇合时制成细胞悬液，再按103 细胞/毫升重新接种培养；(2)在细胞半汇合时，准备0.25g/ml 的丝裂霉素，按2ug/105 细胞的量加入到培养瓶中过夜；或用射线单次照射，剂量3050 戈瑞(Gy)；(3)细胞经上述处理后，Hanks 液漂洗两次、更换培养液、再培养24 小时，胰蛋白酶消化细胞制成悬液，按5104/ml接种入新培养基中；(4)48 小时后，即可用于细胞克隆之用。,2表皮细胞培养程序：(1)取材：取外科植皮或手术残余皮肤小块，以角化层薄者为佳，早产流产儿皮肤更好，切成0.5 1cm2小块；(2)EDTA 处理：先置入0
4、.02 EDTA 中室温置5 分钟。(3)冷消化：换入0.25%胰蛋白酶中，置4过夜；(4)分离：取出皮块，用血管钳或镊子把表皮与真皮层分开；,(5)温消化：取出表皮单独处理；用剪刀剪成更小的块后，置入新的0.25胰蛋白酶中，37再消化30 60 分钟；(6)制细胞悬液：用吸管轻轻反复吹打，使成细胞悬液；(7)加培养液：通过80 目不锈钢纱网滤过后，低速离心，吸上清，直接加入Eagle 液和20小牛血清.(8)培养：接种入碟皿中，CO2 温箱培养。,注意事项：冷消化目的在于使表皮和真皮结合松散；如冷消化后分离下来的表皮膜自身也已松散，此时亦可直接置入PBS 中用吸管吹打制备细胞悬液；不再经过第
5、二次消化。,(二)胃上皮细胞培养,适于胃上皮细胞生长的条件是：胶原酶和透明质酸酶消化法并用消化细胞；应用胶原底物培养；制备含有特定成分的培养基；,培养程序：(1)取材：取胃溃疡或胃癌手术切除胃标本远端非病变区粘膜少许；(2)清洗：用含庆大霉素(400g/m1)和两性霉素(2g/m1 的Hanks)液漂洗后，用钝器剥离下粘膜，剪成1mm大小；(3)消化：在I 型胶原酶和透明质酸酶中，于37中消化80 分钟；(4)离心：收集细胞悬液，800 转/分离心后，Hanks 液漂洗两次；,(5)接种：末次离心后加入含有1 2胎牛血清的完全培养基，接种入不同孔数的培养板中；接种量依不同实验目的而定。细胞接种
6、后一般在16 小时内贴壁，细胞呈多角形，成岛状或片状生长，以后逐渐联接成片。初代培养可维持2 3 周，第一周末达高峰，最后逐渐衰退剥落。,(三)肝细胞培养,肝脏具有取材方便和易于生长的优点，能获得典型上皮细胞培养。1初代组织块培养：肝组织做组织块培养效果很好。取新鲜肝脏，先剥除被膜和血管等纤维成分，用刀或剪刀把肝剪成1mm3 左右的小块，采用贴壁培养法。肝组织易于贴壁，生长力好，一般次日即可出现生长晕。,2初代消化法培养：(1)把肝组织切成2 4 立方毫米的小块，用不合钙镁的BSS 液洗两次；(2)移入1:1 的0.1胰蛋白酶和0.1胶原酶(都用无钙镁BSS 配制)中，4冷消化10 12 小时
7、后，通过250 微米和64 微米尼龙网或不锈钢纱网滤过(用纱布滤过亦可)；(3)收集细胞、BSS 液洗1 2 次、计数、接种培养；,3肝脏灌流法：需用全肝，以较小动物如小鼠和大鼠为好。(1)无菌解剖动物，取出肝脏，先用BSS 洗除血污；(2)取5ml 注射器一支，吸取消化液后，把注射器头轻轻插入肝管中，用线绳结扎牢固，以防消化液漏出，轻轻把消化液注入胆管系统，并不时轻柔压肝脏，以便消化液进入肝小叶中；消化液在肝内停留20 30 分后，在吸出消化液的同时并轻柔压肝脏，以使肝细胞脱落和消化液吸出；,(3)待吸净消化液后，注入离心管中，低速离心分离，用RPMI 1640 培养基培养(较其它培养基为好
8、)，能获得较纯的肝上皮细胞和获较好的效果。,(四)内皮细胞培养,应用材料：人脐带脐静脉、动物大动脉等，用灌流消化法获取细胞最为简便。,(1)取产后的新鲜脐带；如不立即培养可保存于4中，但不宜超过12 小时；无菌剪取长10 15 厘米一段。其它如胚胎和幼体动物的大血管，亦可用于培养；(2)先用三通注射器吸温PBS 液注入脐带的脐静脉中，洗除残血；注入口处宜用线绳结扎，以防液体返流；,(3)用血管钳夹紧脐带一端，从另端向脐静脉中徐徐注入最终浓度为0.1的胶原酶，待末端出现液体后结扎之，令充满血管，注入口亦应结扎，以防液体返流，消化3 10 分钟；(4)吸出含有内皮细胞的消化液，注入离心管中；为获取
9、更多细胞，可再注入温PBS 冲洗2 3 次彻底清除干净残余细胞，一并注入离心管中离心；(5)吸除上清，加1640 培养液，制成细胞悬液，接种入瓶皿中培养，顺利时2 3 天内细胞即可长成单层。,人脐带易于获得，培养效果好；细胞生长后，一般传6 7 代后即衰退，难以长期维持。用兔血管内皮细胞培养较好，可传10 30 代；不同部位血管内皮细胞生物学性状不同，对各种作用因素反应亦有很大差别。,(五)毛细血管内皮细胞培养,毛细血管细小，结构简单，内皮细胞外有较多的结缔组织，进行分离培养有很大困难。近年毛细血管培养已获成功；利用人的小儿包皮、人脾脏、牛肾上腺、癌组织(如卵巢癌)等均可；,1材料：肿瘤条件培
10、养基制备(1)取C3H 小鼠的S-180 实体肉瘤组织；(2)胰蛋白酶消化，Dulbecco 改良Eagle 氏培养液15m1(含10小牛血清)种到培养瓶中培养；,(3)在细胞生长接近完全汇合时，收集培养液制成条件培养基；再用含10小牛血清的新培养液后，也每隔两天收集一次，可获多量条件培养基；(4)4000 转分离心后，再通过0.22m 微孔滤膜滤过，-20冻存备用(临用前融解)。凝胶底层制备(1)取60 mm Falcon 产培养皿，加1%Difco 产明胶(用不合钙和镁的Hanks 液配制)，铺盖瓶底，形成薄层；(2)置4过夜；用前再用少许培养液冲洗一次。,2初代培养(1)取材：取新鲜牛肾
11、上腺数个，先用Hanks 液洗除血污；(2)消化：剥除被膜，分离出皮质，切成l mm3 小块，加0.5胶原酶室温中消化1 小时；每隔10 分钟用吸管吹打悬液令消化充分；(3)过滤：通过不锈钢纱网滤过，网眼要求只允许能通过小于110 微米长的毛细血管小段；(4)离心：650 rpm，4，离心7 分钟后，弃掉上清胶原酶；,(5)再离心：沉淀物用培养液重悬并离心，再重悬，再离心，共两次；(6)制细胞悬液：末次沉淀物仍用含10小牛血清的Dulbecco 改良Eag1e 氏培养液重悬后，稍吹打；(7)接种：接种入铺有明胶底层的培养皿中，37培养；在培养头1 3 小时中，毛细血管小段和内皮细胞最先贴附于底
12、物上，而肾上腺细胞和成纤维细胞却仍在培养液中漂浮；(8)换液：吸除培养液，再加入肿瘤条件培养液；每两天换液一次。毛细血管小段一般成自1 4 个内皮细胞，以后每个小段在底物上慢慢展成特殊形态的细胞岛，能持续2 5 天。,3毛细血管内皮细胞分离培养：(1)初代培养2 3 天后，镜下确认几个毛细血管内皮细胞岛，在培养皿背面，用不脱色笔划圈圈起；(2)镜下检查，如圈内残有非内皮细胞时，可用显微细针在倒置显微镜下挑除；用细胞解剖器也可，宜在净化台无菌气流中、打开培养皿盖进行，但时间不宜过长(15 20 分钟)；圈外非内皮细胞可用无菌胶刮刮除；,(3)用培养液漂洗两次，以去除漂浮细胞；(4)剩余内皮细胞岛
13、如小(5 20 个细胞)而少时，生长增殖常变得缓慢或完全不生长，此时需加入3T3等饲细胞；饲细胞接种量为4000 细胞cm2；(5)当内皮细胞充满所有饲细胞空间后，用胰蛋白酶消化、离心、加入肿瘤条件培养基；(6)接种入明胶底物皿中继续培养(饲细胞死亡被淘汰)，细胞增殖生长汇合后，按1:5 传代。,二、结缔组织类细胞培养,(一)成纤维细胞培养包括人在内的各种成纤维细胞都很容易培养，也是其它组织培养时的副产物，极易获得。用人或动物胚体为好；动物可用小鼠或鸡胚，去头和内脏，剪成小碎块后，用胰蛋白酶消化法培养；如为人胚，可取皮肤培养。幼儿包皮是培养成纤维细胞的很好对象。,小鼠成纤维细胞培养条件,12.
14、514.5d胎龄的小鼠胎儿分离效果最好；最佳培养基为DMEM添加15%小牛血清；第3代细胞增殖最旺盛；室温条件下，0.125%胰蛋白酶消化时间以810min为宜。在培养ES细胞时，应选择第35代的小鼠成纤维细胞作为饲养层细胞。,小鼠成纤维细胞；细胞来源：swiss小鼠胚胎,(二)巨噬细胞培养巨噬细胞属免疫细胞，有多种功能，是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。巨噬细胞容易获得，便于培养，并可进行纯化。但属不繁殖型细胞群，难以长期生存，好的条件下仅能生活2 3周，因之多用作初代培养。巨噬细胞也能建成无限细胞系；大多来自小鼠，如P388D-1、J774A1、RAW309、Cr.1 等。,
15、1培养技术要点：来源和取材 巨噬细胞可来源于人胸水、腹水、血和透析液等材料。实验多从动物血液、肺、脾和胸腹腔获取，其中以从动物腹腔取材最常用。用40g 的PHA 注入腹腔中，能产生6 8106 个细胞，而且无刺激性，效果较好。,2培养方法：培养巨噬细胞可用各种方法和各种来源获取细胞，其中以小鼠腹腔取材法最为实用。人的材料除来源不同外，培养方法大同小异。程序(1)实验前三天，向每只小鼠腹腔内注入无菌硫基乙酸肉汤1ml(勿注入肠内)；(2)引颈杀死动物；手提鼠尾将全鼠浸入70酒精中3 5 秒；(3)置动物于解剖台上，用针头固定四肢，双手持镊撕开皮肤拉向两侧，暴露出腹膜，但勿伤及腹膜壁；(4)再用7
16、0酒精擦洗腹膜壁后，用注射器吸10ml Eag1e 液注入腹腔中，同时从两侧用手指揉压腹膜壁，令液体在腹腔内充分流动；,(5)用针头轻轻挑起腹壁，使动物体微倾向一侧，使腹腔中液体集于针头下吸取入针管内；(6)小心拔出针头，把液体注入离心管中，(4)离心10 分钟后，去上清，加10 ml Eagle 培养基；(7)计数细胞，每只小鼠可产生20 30106 细胞，其中90为巨噬细胞；(8)为获取3105 个贴附细胞平方厘米，需接种2.5106m1；(9)为纯化培养细胞，去除其它白细胞，接种数小时后，去除培养液，用Eagle 液冲洗1 2 次后，再加新Eagle 培养液置37 CO2 温箱中培养。,
17、三、肌组织细胞培养,以心肌和骨骼肌培养较为实用。(一)骨骼肌细胞培养动物胚或幼体的大腿肌组织为最好的培养材料。取材常用生后1 2 天的乳鼠(Wistar 大鼠更好)。(1)取材：杀死动物，无菌取大腿肌组织，切成0.3 0.5 厘米小块；(2)消化：用不含钙镁离子的Hanks 液配的0.25胰蛋白酶消化，无菌纱网或纱布滤过，合成培养基加10小牛(或马)血清培养，为促进分化可加1 的胎汁；,(3)接种：细胞接种量为2106/皿；接种在胶原或明胶的底物上能促进细胞分化。明胶制备比较简单，常用Hanks 液配的0.01明胶。生长特点：细胞生长开始呈纺锤形，培养50 52 小时后将出现融合形成肌细胞状多
18、核纤维。数日后融合停止，此时能观察到横纹。一般在融合后二三天内能见到收缩现象；因收缩运动有时可导致细胞从底物脱离。,(二)心肌细胞培养,最常用材料：鸡胚心肌、小鼠、大鼠以及人胎儿心肌等都可应用。心肌是比较容易培养和生长的组织，可应用多种方法进行培养，如悬滴培养、组织块培养和消化培养法等，主要取心室肌培养，均能获得良好的生长效果。,程序(1)选新鲜受精鸡卵，置温箱中孵育(温箱中放有水槽，以维持箱内湿度)；每日翻动一次(180 度)，孵育9 12 天；(2)取鸡胎；(3)用眼科剪剪开胸腔，剥出心脏，置入皿中用Hanks 液漂洗1 2 次；(4)小心剪除大的动静脉，保留心室肌；用组织块或消化培养法均
19、可。初代培养的鸡胚心肌呈纺锤形，纯化及生长特点：常杂有成纤维细胞和内皮细胞；心肌细胞亦较其它成分贴壁慢，可反复贴壁法排除其它细胞成分。在培养成功时，相差显微镜下可观察到横纹；一周后便可出现节律性收缩现象。,乳鼠心肌细胞原代培养,四、神经组织细胞培养神经组织主要由两种神经细胞(神经元和神经胶质细胞）组成。神经元为高度分化的细胞，在组织发生晚期已失掉增殖能力，对生存条件要求高，只有在适宜情况下，如接种在胶原底层上，或在加入神经生长因子(NGF)和胶质细胞因子时，才能生存，并可能出现一定程度的分化现象，如长出突起等，但却难使之增殖；即使培养胚胎组织情况也是如此。,神经胶质细胞为较易培养成分，它分少突
20、、星形和小胶质三种。神经胶质细胞与神经元有共存关系。,人脑胶质瘤细胞,大鼠c6胶质细胞,(一)初代培养 神经元能发生一定分化现象，如生长突起，但因无增殖能力，最后衰退死亡；但神经胶质尤以星形细胞能继续生存和分裂增殖。(二)传代培养 神经胶质细胞是神经组织中比较容易培养的成分。不仅能获得生长的胶质细胞并可形成能传代的二倍体细胞系。,(三)培养方法人脑组织可用于神经胶质细胞培养，培养组织来自手术室无菌取脑髓灰质或白质均可用于培养，1程序：(1)细胞悬液制备：获取脑组织后，先仔细剥除脑膜和血管等纤维成分，置入Hanks 液中漂洗1 2 次后，置于30 50倍的Hanks 液中；脑组织比较柔软，反复吹
21、打即可制备成细胞悬液；(2)排除脂肪成分和其它碎块：把悬液注入离心管中，在室温直立5 10 分钟后，细胞或细胞团块自然下沉，脂肪等杂物易漂浮于悬液表层，吸除上清，如此反复二三次可获较多的细胞成分；,(3)滤过、计数、接种：向末次沉降物中加入适量营养液，通过纱网或纱布滤过，计数细胞并调整好细胞密度，接种入培养瓶或皿中，置5C02 温箱中培养；(4)传代：细胞生长汇合后，可用0.25胰蛋白酶消化法做传代处理。,2生长特点：接种后初期，细胞可能出现飘浮不贴壁现象，贴壁后在短期内也可能不见细胞分裂现象；细胞适应环境过程较长，然而一旦生长后，即能进入较旺盛的增殖状态。生长开始常杂有巨噬细胞、成纤维细胞和
22、上皮细胞等，传二、三代后，这些成分即消失，逐渐形成均一的星形胶质细胞，一般形成连接不甚紧密的单层细胞,第二节 肿瘤细胞培养,肿瘤细胞在组织培养中占有核心的位置，首先癌细胞是比较容易培养的细胞，当前建立的细胞系中癌细胞系是最多的。肿瘤细胞培养是研究癌变机理、抗癌药检测、癌分子生物学极其重要的手段。,培养方法肿瘤细胞培养成功关键在于：取材、成纤维细胞的排除、选用适宜的培养液和培养底物等几个方面。初代培养应用组织块和消化培养法均可。一、要点1取材：人肿瘤细胞来自外科手术或活检瘤组织。取材时尽量避免用退变组织，要挑选活力较好的部位。癌性转移淋巴结或胸腹水是好的培养材料。,2培养基：肿瘤细胞对培养基的要
23、求不如正常细胞严格，一般常用的RPMI l640、DMEM、Mc-Coy5A 等培养基等皆可用于肿瘤细胞培养。肿瘤细胞对血清的需求比正常细胞低，正常细胞培养不加血清不能生长，肿瘤细胞在低血清培养基中也能生长。肿瘤细胞对培养环境适应性较大。培养肿瘤细胞仍需加血清和相关生长因子培养更易成功。,3成纤维细胞的排除：成纤维细胞常与肿瘤细胞同时混杂生长，致难以纯化肿瘤细胞。而且成纤维细胞常比肿瘤细胞生长得快，最终能压制肿瘤细胞的生长。因此排除成纤维细胞成为肿瘤细胞培养中的关键。,成纤维细胞排除法,1机械刮除法：是用不锈钢丝末端插有橡胶刮头(用胶塞剪成三角形插以不锈钢丝)，或裹少许脱脂棉制成，装入试管中高
24、压灭菌后备用(也可用特制电热烧灼器刮除)。刮除程序为：(1)标记：镜下观察，用不脱色笔在培养瓶皿的背面圈下生长肿瘤细胞的部位；(2)刮除：弃掉培养液，把无菌胶刮伸入瓶皿中，肉眼或显微镜窥视下，刮除无标记空间；(3)用Hanks 液冲洗一两次，洗除被刮掉的细胞；(5)注入培养液继续培养，如发现仍有成纤维细胞残留，可重复刮除至完全除掉为止。,2反复贴壁法：根据肿瘤细胞比成纤维细胞贴壁速度慢的特点，并结合使用不加血清的营养液，(1)细胞生长达一定数量后，倒出旧培养液，用胰酶消化后，Hanks 冲洗2 次，加入不含血清的培养液，吹打制成细胞悬液；(2)编号为A、B、C 三个培养瓶；首先把悬液接种入A
25、培养瓶中，置温箱中静止培养520 分钟后，轻轻倾斜培养瓶，让液体集中瓶角后慢慢吸出全部培养液，再接种入B 培养瓶中后；向A 瓶中补充少许完全培养液置温箱中继续培养；(3)B瓶中细胞520 分钟后，按处理A 的方法，把培养液注入C 培养瓶中；再向B 瓶中补加完全培养基。,当三个瓶内都含有培养液后，均在温箱中继续培养。如操作成功，次日观察可见A 瓶主要为成纤维细胞，B 瓶两类细胞相杂，C 瓶可能主要为癌细胞。必要时可反复处理多次，直至癌细胞纯化为止。,3消化排除法：(1)先是用0.5胰蛋白酶和0.02EDTA(1:1)混合液漂洗培养细胞一次，然后再换成新的混合液继续消化，并在倒置显微镜下窥视和不时
26、摇动培养瓶，到半数细胞脱落下来后，便立即停止消化；(2)把消化液吸入离心管中，离心去上清，吸入另瓶中，加培养液置温箱中培养；向原瓶内也补加新的培养液继续培养。用此法处理后，成纤维细胞比肿瘤细胞易先脱落，经过几次反复处理，可能把成纤维细胞除净。,4胶原酶消化法：本法是利用成纤维细胞对胶原酶较为敏感的特点，通过消化进行选择。(1)可用05mgml 的胶原酶消化处理，边消化边在倒置显微镜下窥视，当发现成纤维细胞被除掉后，即终止消化；(2)用Hanks 洗涤处理一次后，更换新培养液，继续培养，可获纯净肿瘤细胞。如成纤维细胞末被除净，可再次重复。,5其它方法：有人发现聚丙烯酰胺有抑制成纤维细胞生长的作用
27、；也有人用聚蔗糖制备成比重1.025 1.085 的密度梯度离心液，加入细胞悬液后，在23中800g 离心10 分钟。在比重1.025 1.050 层为成纤维细胞，在比重1.065 1.085 层为上皮细胞，再经过分离进行培养。最近也有人应用特殊化学物如SOD 抑制成纤维细胞生长的方法。选用上述任何一种方法，都需进行试验，取得必要经验，找出适合的条件，才能获得好的效果。,二、提高肿瘤细胞培养存活率和生长率措施1适宜底物：如：把经过纯化的细胞接种在不同的底物上，如鼠尾胶原底层、饲细胞层等。2生长因子：应用促细胞生长因子，向培养液中增加一种或几种促细胞生长因子。根据细胞种类不同选用不同的促生长物，常用有胰岛素、氢化可的松、雌激素以及其它生长因子。3动物体媒介培养：为提高肿瘤细胞对体外培养环境的适应力和增加有活力癌细胞(干细胞)的数量，可采用动物体转嫁接种成瘤后，再从动物体内取出进行培养，能提高体外培养的成功率。受体动物以裸鼠最好。,Hela细胞,肝癌细胞,人乳腺癌细胞株MCF-7,
