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1、第二章 工具酶,限制性内切酶,限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）：识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。单位定义在指明pH与37，在0.05mL反应混合物中，1小时消化1g的DNA的酶量为1单位。命名：限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。,第1个字母取自产生该酶的细菌属名，大写第2，3二个字母取自它来源细菌的种名的头2个字母，小写第4个字母代表株，小写最后用大写罗马数字，代表同一菌株中不同限制酶的编号,根据限制性内切酶的识别位点和切割位点以及所需要的辅助因子，可将目前已鉴定出的限制性内切酶一般将限制酶分为3种不同类型。I 型：切割位点不
2、确定，不适用于基因工程。型：基因工程的工具酶。型：切割位点不在识别位点。限制性内切酶的属性【酶活单位】、【最适温度】、【识别位点】、【切割位点】、【星活性】、【酶切切口】,限制与修饰系统的种类,识别双链DNA未甲基化修饰的特异序列，与该序列相互作用，然后延DNA分子移动，在距离特异性识别位点约1000-1500bp处随机切开一条单链，造成大约75个核苷酸的切口。EcoB识别序列：EcoK识别序列：,I型限制性内切酶,识别双链DNA上未甲基化修饰的一小段明确的序列（多数是回文序列），然后在识别位点之内的特定位置切割。EcoRI HaeIII识别序列：识别序列：HindIII EcoRV识别序列：
3、识别序列：,II型限制性内切酶,齐平末端(Blunt end)：在识别序列内的对称轴上切割，其切割产物具平头末端（不易重新连接）。粘性末端(Sticky end)：在识别序列2条链对应位上错位切割，有5端突出的粘性末端和3端突出的粘性末端。粘性末端的意义：粘性末端突出的单链部分可以与相同的酶或同尾酶切割得到的粘性末端的单链部分互补配对。,酶切切口,5NNNNNNGTTAACNNNNN3 3NNNNNNCAATTGNNNNN5,5NNNNNGTT pAACNNNNN33NNNNNCAAp TTGNNNNN5,Hae的识别序列和酶切切口（平端）,5NNNNNNNGAATTCNNNNNNNN33NN
4、NNNNNCTTAAGNNNNNNNN5,5NNNNNG 3NNNNNCTTAAp,EcoR的识别序列和酶切切口（粘端）,pAATTCNNNNNN3 GNNNNNN5,同裂酶：识别位点序列相同的限制性内切酶。,完全同裂酶,不完全同裂酶,同尾酶：识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。,5-GGATCC-3 3-CCTAGG-5,BamH I,Bcl I,5-TGATCA-3 3-ACTAGT-5,5-AGATCT-3 3-TCTAGA-5,Bgl,5-UGATCY-3 3-YCTAGU-5,Xho,同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点一般不能再被原来的酶识别。,能完全肯定的识别位点和切割位点
5、，但切割位点也是在识别位点的一侧的一定距离，通常距特异性位点24bp-26bp。AarI识别序列：BsmBI识别序列：,III型限制性内切酶,限制酶识别序列的长度一般为 4-8 个碱基，最常见的为 6 个碱基。当识别序列为 4 个和 6 个碱基时，它们可识别的序列在完全随机的情况下，平均每 256(44=256)个和 4096(46=4096)个碱基中会出现一个识别位点。4 个碱基识别位点：Sau3A GATC5 个碱基识别位点：EcoR CCWGG6 个碱基识别位点：EcoR GAATTC7 个碱基识别位点：BbvC CCTCAGC8 个碱基识别位点：Not GCGGCCGC以上序列中部分字
6、母代表的碱基如下：R=A或G；Y=C或T；M=A或C；K=G或T；S=C或G；W=A或TH=A或C或T；B=C或G或T；V=A或C或G；D=A或G或T；N=A或C或G或T,限制酶识别序列的长度,核酸限制性内切酶不同类型比较,1.DNA的纯度：DNA中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都会影响酶的活性。2.DNA的甲基化程度：基因工程中必须使用甲基化酶失活突变的菌株。大肠杆菌一般有两种甲基化酶修饰质粒：3.温度：不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数是37oC，少数要求40-65oC。4.DNA的分子结构：DNA分子的不同构型对限制性内切酶的活性也有很大的影响。某些限制性核
7、酸内切酶切割超螺旋的质粒DNA所需要的酶量要比消化线性的DNA量高出很多倍。5.缓冲液：影响限制酶活性的重要因素。商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。化学组成中MgCl2、NaCl/KCl提供Mg2+和离子强度；Tris-HCl维持pH；二硫苏糖醇（DTT）保持酶稳定性；牛血清白蛋白BSA等有助于酶的稳定。,影响限制性内切酶活性的因素,dam甲基化酶（修饰GATC中的A）；dcm甲基化酶（修饰CCA/TGG中的C）。,如改变反应条件就会影响酶的专一性和切割效率，称为星号活性。,限制性内切酶的星活性,EcoRI：正常状态在低盐、高pH（8）时,G|AATT CC TTAA|G,G|AATT AC
8、 TTAA|T,A|AATT CT TTAA|G,G|AGTT CC TCAA|G,DNA连接酶,DNA连接酶：一种封闭DNA链上缺口酶，借助ATP或NAD（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）水解提供的能量催化DNA链的5-PO4与另一DNA链的3-OH生成磷酸二酯键。【单位定义】在最佳反应条件下,15 反应1 小时，完全连接1 g-DNA（Hind III片段）所需的酶量.DNA连接酶分为ATP依赖型和NAD+依赖型。常用的DNA连接酶T4 DNA 连接酶E.coli DNA 连接酶Taq DNA 连接酶,第一种方法是，用DNA连接酶连接具有互补粘性末端的DNA片段；第二种方法是，用DNA连接酶直接将平
9、末端的DNA片段连接起来，或是用末端脱氧核苷酸转移酶给具平末端的DNA片段加上poly（dA）-poly（dT）尾巴之后，再用DNA连接酶将它们连接起来；第三种方法是，先在DNA片段末端加上化学合成的衔接物或接头，使之形成粘性末端之后，再用DNA连接酶将它们连接起来。,DNA连接策略,粘性末端,平末端,平末端,具互补黏性末端片段之间的连接,具平末端DNA片段之间的直接连接,1、DNA片段末端同聚物加尾后进行连接2、黏性末端修饰成平末端后进行连接3、DNA片段5端脱磷酸化作用后连接4、DNA片段加连杆或衔接头后连接,DNA片段末端修饰后进行连接,1、DNA片段末端同聚物加尾后进行连接,特点：给平
10、末端DNA片段3-OH加上同聚物,2、黏性末端修饰成平末端后进行连接,特点：先修饰成平末端，后连接。,3、DNA片段5端脱磷酸化作用后连接,特点：先使一种DNA片段的5端由磷酸基（-P）转变为（-OH）,4、DNA片段加连杆或衔接头后连接,DNA聚合酶（DNA polymerase）是细胞复制DNA的重要作用酶。DNA聚合酶,以DNA为复制模板，从将DNA由5端点开始复制到3端的酶。DNA聚合酶的主要活性是催化DNA的合成（在具备模板、引物、dNTP等的情况下）及其相辅的活性。真核细胞有5种DNA聚合酶，分别为DNA聚合酶（定位于胞核，参与复制引发，不具53外切酶活性），（定位于核内，参与修复
11、，不具53外切酶活 性），（定位于线粒体，参与线粒体复制，不具53，有35外切活性），（定位核，参与复制，具有35，不具53外切活 性），（定位于核，参与损伤修复，具有35，不具53外切活性）。原核细胞已发现有5种DNA聚合酶，分别为DNA聚合酶、和，都与DNA链的延长有关。DNA聚合酶I是单链多肽，可催化单链或双链DNA 的延长；DNA聚合酶II则与低分子脱氧核苷酸链的延长有关；DNA聚合酶III在细胞中存在的数目不多，是促进DNA链延长的主要酶。,DNA聚合酶,1聚合作用：在引物-OH末端，以dNTP为底物，按模板DNA上的指令由DNApol逐个将核苷酸从53的顺序加上去。235外切酶活性
12、（校对作用）：从35方向识别和切除不配对的DNA生长链末端的核苷酸。353外切酶活性（切除修复作用）：从53方向水解DNA生长链前方的 DNA链，主要产生5-脱氧核苷酸。这种酶活性只对DNA上配对部分（双链）磷酸二酯键有切割活力作用，方向是53。4焦磷酸Ppi水解作用：催化3末端焦磷酸解DNA分子。这种作用就是无机焦磷酸分解 DNA生长链，可以认为是DNA聚合作用的逆反应，而且这种水解DNA链作用需要有模板DNA的存在。5焦磷酸交换作用：催化dNTP末端的Ppi同无机焦磷酸的交换反应。【4】和【5】都要求有较高浓度的PPi，体内由于没有足够高的PPi而无重要意义。,DNA聚合酶的功能,大肠杆菌
13、DNA聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶（DNApol）大肠杆菌DNA聚合酶（DNApol）大肠杆菌DNA聚合酶（DNApol）Klenow片段T4-DNA聚合酶耐热DNA聚合酶Taq DNA 聚合酶pfu DNA 聚合酶,原核DNA聚合酶的种类,1、53聚合酶活性：以DNA为模版，在dNTP和镁离子的存在下，催化单核苷酸结合到引物分子的3-OH末端，沿53方向合成DNA。2、53外切酶活性：可以从5端降解双链DNA，使之成为单核苷酸，也可降解DNA:RNA杂交体中的RNA成份，即拥有RNA酶H活性。需要5端游离的磷酸基团3、35外切酶活性：从3-OH末端降解单链或双链DNA分子，降解产物为单核苷酸，
14、当有dNTP存在时，53聚合酶活性抑制35外切酶活性。DNA polI具有3种酶活性，在基因工程中常用作制备探针。,大肠杆菌DNA聚合酶（DNApol）,用枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶降解大肠杆菌DNA聚合酶I为两个蛋白质片段，其中较小的片段具有53外切酶活性，较大的片段具有53聚合酶和35外切酶活性，称为Klenow片段。Klenow片段的功能：1、补平粘性末端2、标记末端3、合成cDNA第二链4、用于Sanger双脱氧末端终止法的DNA序列分析5、合成杂交探针,Klenow片段,常用功能,DNA聚合酶缺陷的突变株仍能生存，这表明DNApol不是DNA复制的主要聚合酶。1970年发现了DNApo
15、l。此酶MW为120KD，每个细胞内约有100个酶分子，但活性只有DNApol的5%。DNApol的功能：聚合作用：该酶催化DNA的聚合，但是对模板有特殊的要求。该酶的最适模板是双链DNA而中间有空隙（gap）的单链DNA部分，而且该单链空隙部分不长于100个核苷酸。该酶也具有35外切酶活性，但无53外切酶活性。该酶对作用底物的选择性较强，一般只能将2-脱氧核苷酸掺入到DNA链中。该酶不是复制的主要聚合酶，可能在DNA的损伤修复中该酶起到一定的作用。,大肠杆菌DNA聚合酶II（DNA polII）,DNA pol也有35和53外切酶活性，但是35外切酶活性的最适底物是单链是DNA，只产生5-单
16、核苷酸，不会产生二核苷酸，即每次只能从3端开始切除一个核苷酸。53外切酶活性也要求有单链DNA为起始作用底物，但一旦开始后，便可作用于双链区。DNA pol是细胞内DNA复制所必需的酶，缺乏该酶的温度突变株在限制温度（non permissive temperature）内是不能生长的，此种突变株的裂解液也不能合DNA，但加入DNA聚合酶则可以恢复其合成DNA的能力。,大肠杆菌DNA聚合酶III（DNA polIII）,T4 DNA聚合酶与大肠杆菌DNA聚合酶相似，也是一条多肽链，分子量亦相近，但氨基酸组成不同，它至少含有15个半胱氨酸残基。T4 DNA聚合酶的作用与大肠杆菌DNA polI不
17、同1它无53外切酶活性2它需要一条有引物的单链DNA作模板3它利用单链DNA为模板，也可同时利用它作为引物，3端的未杂交部分即被T4 DNA聚合酶的35外切酶活性切去，然后在其作用下从3-OH端开始聚合，合成该模板DNA的互补链，再以互补链为模板合成原来的单链DNA。,T4 DNA 聚合酶,分离自水生栖热菌，分子量为94,000，最适反应温度75，对95高温具良好稳定性，该酶具有5 3外切酶活性，不存在35外切酶活性。TaqDNA聚合酶还要具有非模板依赖性活性，可将PCR双链产物的每一条链3加入单核苷酸尾，故可使PCR产物具有3突出的单A核苷酸尾；在仅有dTTP存在时，它可将平端的质粒的3端加
18、入单T核苷酸尾，产生3端突出的单T核苷酸尾。应用这一特性，可实现PCR产物的T-A克隆法。,耐热DNA聚合酶-Taq DNA聚合酶,从高温嗜热菌（Pyrococcus furiosis）中精制而成的高保真耐高温DNA聚合酶，它不具有5-3外切酶活性，但具有3-5外切酶活性，可校正PCR扩增过程中产生的错误，使产物的碱基错配率极低。PCR产物为平端，无3端突出的单A核苷酸。,耐热DNA聚合酶-pfu DNA 聚合酶,核糖核酸酶(Ribonuclease,Rnase)是一类催化RNA降解为小片段的核酸酶。在所有已研究的有机体中都含有大量不同类型的核糖核酸酶，表明RNA降解是一个非常原始而且重要的过
19、程。除了帮助清除细胞内不再需要的RNA，RNase同时也参与了所有RNA分子的成熟过程，其中既包含了携带遗传物质用于指导蛋白质合成的信使RNA，也包含了细胞内功能多样的各种非编码RNA。核糖核酸酶可划分为核糖核酸内切酶（endoribonucleases）和核糖核酸外切酶（exoribonucleases）。在生物科研的日常应用中，RNaseA和RNaseH是两类最常见的核糖核酸酶，两者同属于核糖核酸内切酶亚类。,核糖核酸酶,RNase H：是核糖核酸内切酶，它能够特异性地水解杂交到DNA链上的RNA磷酸二酯键，故能分解RNA/DNA杂交体系中的RNA链。该酶不能消化单链或双链DNA。RNas
20、e A：对RNA有水解作用，但对DNA则不起作用。RNase A在C端和U端残基处专一地催化RNA的核糖部分3-与5-磷酸二酯键的裂开，形成具有 2,3-环磷酸衍生物寡聚核苷酸。如 pG-pG-pC-pA-pG 被切割产生pG-pG-pCp 和 A-pG。可以用来去除DNA制品中的污染RNA。RNase酶非常稳定，是导致RNA降解最主要的物质。它在一些极端的条件可以暂时失活，但限制因素去除后又迅速复性。用常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不能使RNase完全失活。它广泛存在于人的皮肤上，因此，在与RNA制备有关的分子生物学实验时，必须戴手套。一般情况下采用用DEPC配制的70%乙醇擦洗取
21、液器的内部和外部，基本达到要求。玻璃制品则一般是在140度烘箱烘烤3个小时。,S1核酸酶来源于稻谷曲霉(Aspergillusoryzae)，是一种高度单链特异的核酸内切酶，在最适的酶催反应条件下，降解单链DNA或RNA，产生带5-磷酸的单核苷酸或寡核苷酸。对双链DNA、双链RNA和DNA-RNA杂交体相对不敏感。特异性降解单链DNA和RNA，在最适条件下,降解单链的速度比双链快75000倍。这种酶需要低水平的zn2+的激活，最适pH范围为4.04.3。一些螯合剂(如EDTA和柠檬酸等)能强烈地抑制s1核酸酶活性，此外磷酸缓冲液和0.6左右的SDS溶液也可以抑制它的活性，但它对尿素以及甲酰胺等
22、试剂则是稳定的。,S1核酸酶,S1 核酸酶,S1 核酸酶,逆转录酶,逆转录酶-AMV反转录酶,逆转录酶-M-MLV反转录酶,鸟类成髓细胞性白血病病毒（）的反转录酶具有两类活性：聚合酶的活性和的降解活性。其聚合酶活性表现为既能利用也能利用作为模板，指导与模板互补的的合成。这两种活性可能共用一个活性位点，在以为模板时称为指导的聚合酶活性，而以为模板时则叫做指导的聚合酶活性。,从莫洛尼氏鼠白血病病毒分离出来，可用于合成第一链cDNA、制作cDNA探针、RNA转录、测序和RNA的逆转录反 应。本酶是通过点突变使RNaseH活性缺失，所以它具有的DNA聚合酶的活性与野生型相同，同时其延伸能力也有显著提高
23、。,RNA聚合酶（RNA polymerase）：以一条DNA链或RNA为模板催化合成RNA的酶。因为在细胞内与基因DNA的遗传信息转录有关，所以也称转录酶。真核细胞含有3类不同的RNA聚合酶，根据其对-鹅膏蕈碱的敏感性不同，分为RNA聚合酶、RNA聚合酶、RNA聚合酶。,RNA聚合酶,用连接酶将Sau3A(GATC)切割的DNA与经BamHI(GGATCC)切割的DNA连接起来后，能够被BamHI切割的几率有多少？如何使下列的限制酶识别位点由一种序列变为第二种,或由第一种变为第三种 GATC GATATC GATCGATC Sau3AI EcoRV ClaI AAGCTT AAGCGCTT HindIII ThaI，HaeII一DNA分子中有一个SmaI识别位点(CCCGGG)，想要将这识别位点顺序完全除去，现已知该位点及两侧的序列为ACCCGGGT，应该如何设计实验?,作业,
