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1、第一节微生物的突变,一、基因突变（gene mutation）基因突变简称突变，是变异的一类，泛指细胞内（或病毒粒内）遗传物质的分子结构或数量突然发生的可遗传的变化，可自发或诱导产生。突变的几率一般很低（10-6 10-9）从自然界分离到的菌株一般称野生型菌株（wild type strain），简称野生型。野生型经突变后形成的带有新性状的菌株，称突变株（mutant，或突变体、突变型）。,凡能用选择性培养基（或其他选择性培养条件）快速选择出来的突变株称选择性突变株（selectable mutant），反之则称为非选择性突变株。,（一）突变类型,1、营养缺陷型（auxotroph）某一野生菌
2、株因发生基因突变而丧失合成一种或几种生长因子、碱基或氨基酸的能力，因而无法再在基本培养基上正常生长繁殖的变异类型。2、抗性突变型（resistant mutant）指野生型菌株因发生基因突变，而产生的对某化学药物或致死物理因子的抗性突变类型。3、条件致死突变型(conditional lethal mutant)某菌株或病毒经基因突变后，在某种条件下可正常地生长、繁殖并呈现其固有的表型，而在另一种条件下却无法生长、繁殖的突变类型。,4、形态突变型(morphological mutant)指由突变引起的个体或菌落形态的变异，一般属非选择性突变。5、抗原突变型(antigenic mutant)
3、指由于基因突变引起的细胞抗原结构发生的变异类型，包括细胞壁缺陷变异、荚膜或鞭毛成分变异等。6、产量突变型(metabolic quantitative mutant)通过基因突变而产生的在代谢产物产量上明显有别于原始菌株的突变株，称产量突变型。有两种类型：正变株（plus-mutant）、负变株（minus-mutant）,（二）突变率（mutation rate）某一细胞（或病毒粒）在每一世代中发生某一性状突变的几率，称突变率。（三）基因突变的特点 1.自 发 性：各种突变都可在无人为诱变因素处理下自发发生；2.不对应性：突变的性状与引起的原因间无直接对应关系；3.稀 有 性：自发突变的几率
4、极低，一般10-6-10-9，但稳定；4.独 立 性：某一突变既不提高也不降低其他任何基因的突变率；5.可 诱变性：诱变剂可提高突变的几率，两种变异株无本质差别；6.稳 定 性：是遗传物质结构上发生了稳定的变化，稳定，可遗传；7.可 逆 性：任何性状都可发生正向突变，也都可发生回复突变。,（四）基因突变自发性和不对应性的实验证明1、Luria 等的变量试验（fluctuation test）,2、Newcombe的涂布试验,3、Lederberg等的影印平板培养法(replica plating),(五)基因突变及机制,1、诱发突变（induced mutation）,诱发突变简称诱变，是指通
5、过人为的方法，利用物理、化学或生物因素显著提高基因自发突变频率的手段。凡具有诱变效应的任何因素，都称诱变剂（mutagen）。1）碱基的置换（substitution）转换(嘌呤间或嘧啶间)颠换(嘌呤和嘧啶间),亚硝酸引起的使AT转换成GC过程的简式见下图,HNO2 A:T He:T Hk+T第一次复制 AT HkC 第二次复制 GC HkC,直接引起置换的诱变剂,间接引起置换的诱变剂,2）移码突变（frame-shift mutation）,指诱变剂会使DNA序列中的一个或少数几个核苷酸发生增添（插入）或缺失，从而使该处后面的全部遗传密码的阅读框架发生改变，并进一步引起转录和转译错误的一类突
6、变。诱变剂：ICR（美国一癌症研究所名称）类化合物：原黄素，吖啶黄，吖啶橙等。诱变机理：至今不清。结果：加3、减3；加（减）1，短距离减（加）1；影响小。增（减）1、2、4、5引起后面全变。,常见的致变剂及其致变作用,(a)亚硝基的脱氨作用；(b)烷化剂和被甲基化的碱基；(c)5-溴脱氧嘧啶与鸟嘌呤配对(A=T变G三C)。,3）染色体畸变（chromosomal aberration）,某些强烈理化因子会引起DNA分子的大损伤（macrolesion）染色体畸变。既包括染色体结构上的缺失（deletion）、重复(duplication)、插入(insertion)、易位(translocat
7、ion)和倒位(inversion)，也包括染色体数目的变化。转座（因）子：在染色体组中或染色体组间能改变自身位置的一段DNA顺序。其跳跃过程往往导致DNA链的断裂或重接，产生重组交换、基因启动或关闭，使突变发生。转座（因）子主要有三类：IS、Tn、Mu。,2、自发突变,自发突变（spontaneous mutation）是指生物体在无人工干预下自然发生的低频率突变。自发突变的原因:1）背景辐射和环境因素的诱变；2）微生物自身有害代谢产物的诱变效应；3）互变异构效应；（配对错误）4）环出效应。（发生缺失）,(六)紫外线对DNA的损伤及其修复,嘧啶碱基受紫外辐射后产生的衍生物,(六)紫外线对DN
8、A的损伤及其修复 1、光复活作用（photoreactivation）把经UV照射后的微生物立即暴露于可见光下时，就可 出现明显降低其死亡率的现象，此即光复活作用。2、切除修复（excision repair）是活细胞内一种用于对被UV等诱变剂损伤后DNA的修复 方式之一，又称暗修复（dark repair），这是一种不依赖 可见光，只通过酶切作用去除嘧啶二聚体，随后重新合成 一段正常DNA链的核酸修复方式。,一、化学诱变剂 碱基类似物二、物理诱变剂 非电离辐射类因子和电离辐射类因子两种三、生物诱变剂（一）转座诱发突变（二）转化诱发突变（三）转导诱发突变（四）定点诱导,第二节 诱发突变及诱变剂
9、,第三节 突变体的选择和检出,一、基因的突变延迟原因：突变前所产生的物质仍然在细胞中存在活性 诱变剂作用在DNA的一条链上 多核细胞，所有的核都变为变异的核时细胞才会表现出来,二、突变体的筛选,（一）随机筛选（二）根据菌落特征或生化反应筛选（三）冷敏感菌筛选法（四）梯度平板法（五）营养缺陷型菌株的筛选,菌种筛选的策略,筛选的手段必需配合不同筛选阶段的要求,初筛：要力求快速、简便,复筛：应该做到精确，测得的数据要能够反映将来的生产水平,(1)从菌体形态变异分析初筛,有些菌体的形态变异与产量的变异存在着一定的相关性，在筛选工作中应尽可能捕捉、利用这些直接的形态特征性变化。,平皿快速检测法,平皿快速
10、检测法是利用菌体在特定固体培养基平板上的生理生化反应，将肉眼观察不到的产量性状转化成可见的“形态”变化。,纸片培养显色法、变色圈法、透明圈法、生长圈法和抑制圈法等。定性或半定量用，大大提高筛选的效率 初筛,微生物特异性平板检测方法,饱浸含某种指示剂的固体培养基的滤纸片变色圈,指示剂直接掺入或喷洒固体培养基，菌落周围形成变色圈。如淀粉的平皿上喷上稀碘液,固体培养基中渗入溶解性差、可被特定菌利用的营养成分，造成不透明的培养基背景。菌落利用此物质形成透明圈。,利用一些有特别营养要求的微生物作为工具菌，如待筛选菌具有该营养物的前体转化成营养物 能力，工具菌就能围绕该菌生长,待筛选的菌株能分泌产生某些能
11、抑制工具菌生长的物质,摇瓶培养法,摇瓶培养法是将待测菌株的单菌落分别接种到三角瓶培养液中，振荡培养，然后，再对培养液进行分析测定。,特殊变异菌的筛选方法,营养缺陷型突变株,抗阻遏和抗反馈突变型,抗生素抗性突变株,条件抗性突变,营养缺陷型突变株,浓缩、进一步检出和鉴别营养缺陷型等步骤。,筛选步骤：,浓缩营养缺陷型菌株,常用的浓缩方法有抗生素法、菌丝过滤法、差别杀菌法和饥饿法等。,目的：淘汰大量野生型，使营养缺陷型占的比例增加,进一步检出所需缺陷型,逐个检出法,影印培养法,一般从菌落大小也可以判断，新长出的菌落较小，即是营养缺陷型,夹层培养法,营养缺陷型的鉴定,获得的营养缺陷型菌株还应进一步确认其
12、生长的所需物。,生长谱法,组合补充培养基法,营养缺陷型的应用,利用营养缺陷型突变株来生产氨基酸和核苷酸是典型的例子,天冬氨酸激酶(AK)被赖氨酸及苏氨酸协同反馈所抑制,通过诱变处理，获得高丝氨酸缺陷型突变菌株，该突变型不能产生苏氨酸。,在限量高丝氨酸的培养基中缺陷型菌株能够正常生长，并且因为消除了反馈抑制,突变型能过量生产L-赖氨酸,抗阻遏和抗反馈突变型,抗阻遏和抗反馈突变型都是由于代谢失调所造成的，在细胞中已经有大量最终代谢产物时仍然继续不断地合成这一产物。,选育结构类似物抗性突变株,结构类似物是指一些和细菌体内氨基酸、嘌呤、维生素等代谢产物结构相类似的物质,主要用于末端产物的积累,抗性突变
13、菌株的筛选,抗生素抗性突变株,在抗生素产生菌选育中，通过筛选抗生素抗性突变可提高抗生素产量。,抗生素抗性突变株除能提高抗生素的产量外，还能提高其它代谢产物的量。,条件抗性突变,因环境不同，能表现为野生型菌株的特性和突变型菌株特性的突变称为条件抗性突变或称为条件致死突变。,温度敏感突变常用于提高代谢产物产量,致死,营养缺陷,抗性突变菌株的筛选方法,一次性筛选法,一次性筛选法就是指在对出发菌株完全致死的环境中，一次性筛选出少量抗性变异株。,噬菌体抗性菌株,耐高温菌株,阶梯性筛选法,梯度平板法,纸片扩散法,用打孔器将较厚的滤纸（如新华六号）打成小圆片，并使纸片吸收一定浓度的药物，经干燥或不经干燥，放
14、入涂布了菌悬液的平板上，一般9厘米的培养皿中等距放置三片为宜。经培养后观察围绕纸片的抑菌圈，抑菌圈内出现的可能就是抗性菌。,组成酶变异株的筛选,诱导酶的生产需要诱导物，而且受到诱导物的种类、数量以及分解产物的影响。能迅速利用的碳源（如葡萄糖）会引起酶合成的减少，诱导物有时又比较昂贵。,生产成本提高,控制酶合成的调节基因发生了变异,诱导酶转变成组成型酶,具体的筛选方法有恒化器法、循环培养法和诱导抑制物法,恒化器法：恒化器常被用于微生物的“驯化”，添加不能起诱导作用的低浓度底物，缓慢生长,循环培养法：利用不含诱导物的培养环境和含有诱导物的培养环境进行交替循环培养待分离的菌悬液，从而使组成酶变异株得
15、到富集。,诱导抑制剂法：加入诱导抑制剂如-硝基苯基-岩藻糖苷阻止某些诱导酶的合成,1、诱变育种的基本环节,第四节 微生物诱变育种,1）选择简便有效的诱变剂2）挑选优良的出发菌株（original strain）3）处理单细胞或单孢子悬液4）选用最适的诱变剂量5）充分利用复合处理的协同效应（synergism）6）利用和创造形态、生理与产量间的相关指标7）设计高效筛选方案（筛选比诱变更重要）8）创造新型筛选方法,2、诱变育种中的几个原则,1）产量突变株的筛选如：琼脂块培养法2）营养缺陷型突变株的筛选与筛选营养缺陷型突变株有关的3类培养基基本培养基、完全培养基、补充培养基与筛选营养缺陷型突变株有关
16、的3类遗传个体野生型(A+B+)、营养缺陷型(A+B-)、原养型(A+B+)营养缺陷型突变株的应用 基本理论:代谢途径、基因重组规律的标记菌种。应用研究:生产核苷酸、氨基酸，工程菌株的亲本。,3、三类突变株的筛选方法,第一步：诱变剂处理第二步：淘汰野生型抗生素法（细菌）、菌丝过滤法（真菌）第三步：检出缺陷型夹层培养法、限量补充培养法（观大小）逐个检出法（两种培养基）、影印平板法第四步：鉴定缺陷型生长谱法（auxanography）,营养缺陷型的筛选方法,3）抗药性突变株的筛选,梯度平板法：如：选育抗异烟肼的吡哆醇高产菌株突变株：产生了可分解异烟肼的酶；能合成更高浓度的吡哆醇（多）获突变酵母的吡
17、哆醇产量提高倍方法：10mL普通培养基斜放凝固平放 10mL药物培养基凝固涂诱变酵母选厚药区菌落检验,体内基因重组育种,接合、转化、转导和原生质体融合等遗传学方法和技术使微生物细胞内发生基因重组,1.原生质体融合,将遗传性状不同的两种菌(包括种间、种内及属间)融合为一个新细胞的技术。,选择亲株、原生质体的制备、原生质体的融合、原生质体再生和融合子选择等步骤,步骤,微生物原生质体融合的一般原理和过程,选择亲株,选择遗传性状稳定且具有优势互补的两个亲株,为了能明确检测到融合子，参与融合的亲株一般都需要带有可以识别的遗传标记，如营养缺陷型或抗药性等,原生质体制备,去除细胞壁是制备原生质体的关键,革兰
18、氏阳性菌的细胞壁主要由肽聚糖组成,溶菌酶,微球菌、枯草杆菌、巨大芽孢杆菌、黄色八叠球菌,革兰氏阴性菌不能直接溶壁，只有当乙二胺四乙酸（EDTA）存在时，某些革兰氏阴性菌的细胞壁才能够被溶菌酶溶解。,金黄色葡萄球菌,溶菌酶不能溶解,表皮葡萄球菌能产生一种内肽酶葡萄球菌素，溶解,放线菌的细胞壁结构类似于革兰氏阳性菌也可采用溶菌酶,真菌细胞壁主要由纤维素、几丁质和葡聚糖等组成,青霉菌多用纤维素酶和-1,3-糖苷酶等溶壁,曲霉用-1,3-糖苷酶和-1,4-糖苷酶等,酵母菌细胞壁中的葡聚糖和几丁质,蜗牛酶,培养基中添加甘氨酸，可以使菌体较容易被酶解,在菌体生长阶段添加蔗糖也能提高细胞壁对溶菌酶的敏感性,
19、在菌体生长对数期加入适量青霉素，就能使细胞对溶菌酶更敏感,菌龄：对数生长中期细胞的细胞壁中肽聚糖含量很低，对溶菌酶敏感。,原生质体制备的其他因素：,一般是将原生质体放在高渗的环境中以维持它的稳定性,原生质体融合,聚乙二醇（PEG）能有效地促进原生质体融合一般PEG的使用浓度范围在25-40%,采用电融合仪：在高频电场下，用直流电穿孔来进行融合,原生质体再生,使原生质体重新长出细胞壁，恢复完整的细胞形态结构,不同微生物的原生质体的最适再生条件不同，最重要的一个共同点是都需要高渗透压,再生率,细菌为3-10%,真菌在20-80%,融合重组子的筛选,通过两亲株遗传标记的互补而得以识别,两亲株的遗传标
20、记分别为营养缺陷型A+B-和A-B+，融合重组子应是A+B+或A-B-,重组子的检出方法有两种：,直接法,将融合液涂布在不补充亲株生长需要的生长因子的高渗再生培养基平板上，直接筛选出原养型重组子,间接法,把融合液涂布在营养丰富的高渗再生平板上，使亲株和重组子都再生成菌落，然后用影印法将它们复制到选择培养基上检出重组子。,第五节 菌种的衰退、复壮和保藏,一、菌种的衰退与复壮 衰退（degeneration）是指由于自发突变的结果，而使某物种原有一系列生物学性状发生量变或质变的现象。具体表现有：1、原有形态性状变得不典型了；2、生长速度慢、产生的孢子少；3、代谢物生产能力下降；4、致病菌对宿主侵染力的下降；5、对外界不良条件抵抗能力的下降,复壮,狭义的复壮仅是一种消极的措施，指的是在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和测定典型性状、生产性能等指标，从已衰退的群体中筛选出少数尚未退化的个体，以达到恢复原菌株固有性状的相应措施；而广义的复壮则应是一项积极的措施，即在菌种的典型特征或生产性状尚未衰退前，就经常有意识地采取纯种分离和生产性状的测定工作，以期从中选择到自发的正变个体。,
