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1、现代分子生物学实验 原理与技术,第一章 绪论第一节 基因操作技术,1.基因操作技术 基因操作技术（重组DNA技术、基因工程）是在DNA水平上阐明生命现象的技术，包括DNA的“切”、“连”、“扩”等。“切”指限制性内切核酸酶切割DNA。“连”指用DNA连接酶连接两个DNA片段。“扩”是指目的DNA在宿主/载体系统中进行扩增。,2.实验方案（1）基因操作实验的主要目的有三个：分离目的基因，获取DNA信息；分析基因结构；分析基因功能。,（2）试验流程设计首先，应确定使用怎样的研究方案；其次，根据试验规模和研究室情况；最后，根据研究人员生活规律确定试验时间。,3.实验方法 在设计实验方法时应考虑 能否
2、达到实验目的；是否符合实验室现状；是否符合自己的喜好。,实验方法,精度,爱好,实验目的,经费预算,实验周期,仪器性能,准确性,速度,确定实验方法时应考虑的因素,4.实验遵循的原则忠于实验流程 设平行对照实验关注实验要点 准确的试剂用量准备充足的实验材料 数据整理,注意：第一次实验成功，第二次实验马虎。实验精度：必须严格按照实验流程进行的操作；较严格的实验操作，允许5%的变动；允许20%变动的实验操作；不需要特别注意的实验操作。酶促反应不顺利时，若加入更多的酶或DNA，结果会 越来越糟。不设平行对照实验往往是实验失败的原因。样本标记的零乱也往往是实验失败的重要原因。,5.实验材料的准备购买利用公
3、共服务机构接受馈赠 写求助信要注意：你需要什么？及时、真实的将相关信息告诉对方，不能隐瞒。通常向论文通讯作者寻求帮助。写信的稿纸是印有单位标志、名称、电话号码等信息的公函纸。,第二节 实验室规则与安全,实验室规则 保持肃静 保持整洁 严格操作 注意节约 保证安全实验室常识使用贵重仪器如分析天平、分光光度剂、离心 机等倍加爱护，使用前熟知使用方法，使用时 严格遵守操作规程，发生故障时，立即关机。凡挥发性、有烟雾、有毒和有气味的实验，均 应在通风柜内进行。,配制试剂时，应对试剂纯度、结构式、分子质量等 特性熟悉，做到“有的放矢”。量瓶是量器，不要用量瓶做容器。洗净器皿应倒置架上，使其自然风干。实验
4、室安全实验室生物安全通用要求查看了解电闸、水阀煤气总阀门所在处，离开实验室检 查是否关好。使用电器设备时严防触电。使用高温高压锅灭菌时不得离人。使用可燃物，特别是易燃物，应特别小心。凡使用腐蚀性试剂，必须谨慎操作，防止溅出。废液特别是强酸强碱，应稀释后倒入水池。有毒物品应按照实验室规定办理审批手续后方可领取，使用时严格操作，用后妥善处理。,实验室急救触电 关闭电源；用干木棍将导线与被害者分开；将被害者移至木板上，与地面分离；急救者必须做好触电安全措施，手脚必须绝缘。火灾 隔绝氧气 起火物与水相容：水、湿布、沙土、灭火器等 起火物与水不相容：不可用水烫伤 乙醇消毒，涂2%苦味酸或5%鞣酸，防感染
5、玻璃割伤或其他器械损伤 清理伤口，硼酸水洗净，涂碘酒，包扎灼伤皮肤 强碱：大量清水稀释，涂5%硼酸或2%乙酸 强酸、溴：大量清水稀释，5%NaHCO3或5%氨水煤气中毒 呼吸新鲜空气,思考题：什么是DNA重组技术？其实验的主要目的是 什么？答案试分析有些人工作很辛苦，但总得不出理想实验结 果的原因。答案如何获得你需要的实验材料（特别是未商品化的材 料）？答案什么是实验室生物安全通用要求（GB 1948 9-2004）？据此生物学实验室可分几级？答案实验室发生火灾时该如何处理？烫伤、灼伤时该如 何处理？答案如何处理对环境有污染的试剂？答案,第二章 仪器操作与溶液配制 第一节 常用器皿与仪器,1、
6、塑料制品Eppendrof 管,2、微量移液器（枪）,使用方法调节时，自大到小。由小值调到大值时，应多调1/3圈，再反调至设定值。,3、恒温水浴锅,多用于酶促反应，将Eppendrof管插入浮漂中进行反应。,4、小型离心机,离心甩干是指短时间（13s）的离心操作，目的是使附着于管壁的液体沉入管底。,5、离心干燥机,目的是使DNA样品快速干燥。,6、旋涡混合器,利用不对称的旋转将管内液体混匀。,7、振荡器,搅拌离心管内液体，加速难容物溶解，清洗浸泡于溶液中的不洁器皿。,8、真空泵,利用真空吸走液体，作用与离心干燥机或凝胶干燥机类似。,9、紫外发光装置,防护板（贴有起保护作用的保鲜膜）,过滤板,紫
7、外线可分为短波、中波、长波等类型，短波光线强，对DNA损伤大。实验室一般使用中波，使用时应戴上防护眼镜。因灯管和过滤板有使用寿命，用完后及时关闭。,10、一次性手套,11、纸巾,防止危险试剂沾到手上。防止试剂受到污染。,吸走残余液体，一般卫生纸就可以。擦拭实验用品（如玻璃板）时，要用专用、不带毛屑的面巾纸。,第二节 溶液,1、实验用水,一蒸水：多用于大肠杆菌培养基的制备、电泳缓冲液的配制、器皿的漂洗的实验。,二蒸水：用于生物化学及组织培养实验。,2、储液,3、试剂称量精度一般称量精度为3位有效数字。,4、试剂灭菌 不可高温高压灭菌的试剂有：遇热易分解的试剂 易挥发的试剂 有机溶剂 腐蚀性、刺激
8、性强的试剂。,问题：1、如何正确使用微量移液器？使用中应特别注意哪些事项？2、如何改变微量移液器的移液量？应自大调到小，还是自小调到大？为什么？答案3、哪些试剂需要高温高压灭菌？哪些试剂不能采用高温高压灭菌？对于不能采用高温高压方式灭菌的试剂如何灭菌？灭菌后试剂如何保存？是否需要分装？答案4、分子生物学实验中，哪些简易仪器或装置可以替代真空泵的作用？答案5、分子生物学实验中，哪些溶液可以用旋涡混合器混匀？为什么？6、配制培养基时，通常使用哪种级别的水？为什么？答案,第三章 大肠杆菌培养与保存,准备,1）制作平板（称试剂、溶解、灭菌）2）清洁超净工作台,3）配制液体培养基,培养,平板培养,保存,
9、穿刺培养,液体小量培养（制作初始菌）,DNA扩增,甘油保存,液体大量培养,蛋白质表达,第一节 培养前准备,1、大肠杆菌菌株 主要来自K12，根据菌体表面糖蛋白成分（O抗原、H抗原、K抗原等）分类。2、培养大肠杆菌所需的物品,微量移液器,液体培养基,枪尖盒,1）操作台,油性记号笔、小木棒、70%乙醇、涂布棒、接种环、煤气灯、牙签抗生素（-20保存）平板（盖子朝上），保持干燥,2）灭菌方法 高温高压灭菌（培养基、试剂、枪尖、小木棒、牙签等）干热灭菌（玻璃器皿及金属器皿）火焰灭菌（试管瓶口、接种环等）紫外线灭菌（器械及培养基）乙醇灭菌（实验人员手、器械、操作台）,3）接种工具接种环用于液体培养基的接
10、种及平板划线。小木棒用于从平板向液体转接细菌。牙签用于从菌落中挑选需要的单菌落。涂布棒用于向平板上涂布液体菌体。,固体,液体,涂布棒,小木棒,牙签,3、培养基种类,1）液体培养基 用于大量繁殖菌株以提取质粒DNA或表达的目的蛋白质。2）固体培养基 目的是使菌落增殖到一定大小，以获取质粒斑或分离出单菌落。3）抗生素 配制：A无菌水溶解抗生素，吸入注射器针筒内。B注射器嘴上安装微量过滤器（过滤灭菌）。C按每份1ml量分装到Eppendorf管中，保存于-20冰箱。,使用：在接种前加入到液体培养基中，在配制固体 培养基时，待灭菌后加入抗生素。,4、培养基的配制 1)液体培养基的配制小体积LB培养基的
11、配制（2ml为例）材料：试管及瓶塞 药匙 1L烧杯 搅拌器及搅拌转子 试剂 步骤：胰蛋白酶10g 酵母提取物5g 1L烧杯 NaCl 10g,加双蒸水至刻度，用搅拌器混合均匀。用分装器分装至试管，每份2ml。高温高压灭菌，室温保存。,大体积LB培养基的配制（800ml为例）材料：药匙 2L三角瓶 铝箔纸 电动搅拌器及搅拌转子 试剂 步骤：胰蛋白酶8g 酵母提取物4g 三角瓶 NaCl 8g,加双蒸水至800ml，混合均匀。高温高压灭菌，室温保存。,2)制作平板 材料：煤气灯或酒精灯 水平台面 1L三角瓶 铝箔纸 直径9cm的培养基 药匙 试剂 琼脂粉 步骤：胰蛋白酶8g 酵母提取物4g 三角瓶
12、 NaCl 8g 琼脂粉,铝箔纸封口，混匀，灭菌。待冷却至60左右，分装至培养皿。水平台上凝固。倒置塑料袋中4保存。,注意：1、若需要加入抗生素，待冷却至60，分装前加入。2、直径9cm的平皿，每皿25ml为宜。3、尽量缩短平皿开盖时间，分装的培养基很快凝固，因此操作要快。4、凝结在盖上的水珠可能至污染，故倒转存放。5、氨苄青霉素易失活，添加后的平皿应在数周内使用。,第二节 大肠杆菌培养,无菌操作前用70%乙醇消毒台面。离酒精灯较近距离进行无菌操作。开盖前和开盖后用酒精灯灼烧瓶口2至3次。瓶口倾斜，不得垂直向上。使用平皿时尽量去除凝结在盖子上的水珠，并不 得混淆盖子。,1、培养 1）小量液体培
13、养 材料：接种针或小木棒 煤气灯,摇床 2mlLB液体培养基 长有细菌的平皿 步骤：用接种针接种 烧红接种针的铂金丝 轻触平皿边缘 挑起一个菌落 灼烧试管口，开盖 将铂金丝伸进液体培养基 37震荡过夜 用小木棒接种 灼烧瓶口，取一根木棒 木棒挑起单菌落 同上,2)大量液体培养基,材料：煤气灯 摇床 少量初始菌 8mlLB液体培养基步骤：小量培养数小时至过夜。稍微打开盛有大体积培养液的三角瓶瓶盖，灼烧瓶口。打开有初始培养菌的试管口，灼烧，将初始培养菌转入大量培养基中，盖上盖子，再灼烧瓶口。37震荡过夜。,3）菌落测定,在煤气灯旁用微量移液器吸培养液，转至Eppendrof管。打开分光光度计，调整
14、波长至600nm。吸取未接菌的培养基至比色杯中，调整光吸收值为零。取Eppendrof管内的菌液于比色杯中，测A600值。,4）平板培养 划线培养 材料：接种针、煤气灯或酒精灯、新的LA平板、菌,诱导期,对数生长期,平台期,死亡期,结果：A=0.21.0时为指数生长期，A 1.0为平台期。A=1.0为10 个/ml。,8,600,600,600,步骤：用煤气灯将接种针烧红，轻触平板一侧，冷却。用铂金丝挑去平板上的单菌落，在培养基表面划线。再灼烧铂金丝，冷却。与前面所划线的一部分交叉划线，以减少菌数。重复上步骤。37倒置培养过夜。,第三节 大肠杆菌菌株保存,1、平板保存 材料：新平板、圆形标签纸
15、、牙签、封口膜或胶带、长有大肠杆菌的初始平皿 步骤：在平板底部贴标签，做标记。用牙签挑单菌落，接种到平板。37过夜后4保存。,涂布培养 材料：涂布棒、新的平板、酒精灯或煤气灯、菌液 步骤：将平板翻转过来，置于盖上，50干燥20至 30分钟。取100ul菌液，滴于平板上。用涂布棒涂布均匀。37倒置过夜。,3、穿刺保存 材料：含0.7%琼脂的LB培养基、铂金丝、封口膜、玻璃瓶。步骤：玻璃瓶内装2/3培养基，灭菌，冷却。接种针火焰灭菌，在培养基中冷却。挑取单菌落后刺入培养基底部。37度下培养12至18小时。盖紧瓶盖，封口膜封口，室温避光保存。,2、甘油管保存 材料：2ml冻存管、灭菌的80%甘油、封
16、口膜、菌液 步骤：过夜培养2ml菌液后，取1ml至冻存管。加入200ul 80%甘油，混匀。拧紧管帽，用封口膜封口，保存于-70 或-20。,问题：1、用于基因克隆的大肠杆菌菌株主要有哪些？它们各自有什么主要特征？2、配制氨苄青霉素等抗生素时是否需要灭菌？如何灭菌?3、在进行大肠杆菌培养时，何时需要大量培养？何时需要小量培养？4、在大肠杆菌培养过程中，应注意哪些问题？5、当用平板培养大肠杆菌时，培养皿必须倒置，为什么？6、大肠杆菌的保存方法主要有哪些？,第四章 基因操作中的酶学反应第一节 常用酶的保存,注意：1、常规储存于-20，也有4或8。2、储存的冰箱不能选用自动除霜类。3、不与通常样品保
17、存在同一冰箱。4、尽可能在短时间内完成全部操作。5、直接在冰箱内吸取需要的酶量。6、可用冰盒或金属制的冰空盛装Eppendrof管，以便在冰箱之外吸取酶液。,第二节 限制性内切核酸酶,1、定义：是一类识别DNA上38个特异核苷酸序列，并产生切割反应的内切核酸酶的总称。2、修饰酶：与限制性内切核酸酶识别的DNA序列相同，产生修饰反应的酶叫修饰酶，主要是甲基化酶。3、限制-修饰系统：限制性内切核酸酶对病毒等外来DNA起切割反应，但自身基因组DNA因修饰酶的修饰作用而不能被切割，这种防御机制叫,1、识别序列 型限制性内切核酸酶的识别序列长度通常为48个核苷酸，对数具有对称的回文结构。识别序列越长，其
18、序列在DNA中出现的概率就越低。,4、限制性内切酶的命名 EcoR E代表Escherichia属 co代表coli 种 R代表RY13株 用罗马数字区别不同特异性的酶,2、DNA片段的末端结构,如EcoR切割后产生5粘性末端：,Pst切割后产生3粘性末端：,有一些酶沿对称轴切断DNA，产生平端或钝端（Blunt end）,如Sma：,3、反应条件添加缓冲液浓度：10储液反应最适温度：37,第三节 限制性内切核酸酶消化DNA实验,1、单个酶的切割反应材料:37恒温水浴箱 pBlueScriptSK（DNA）双蒸水 EcoR 10H添加缓冲液步骤：按以下顺序混合试剂：双蒸水 13uL DNA 4
19、uL 10H缓冲液 2uL EcoR 1uL 混匀。37保温1小时。,+,确认酶是否切完全（取14uL进行琼脂糖凝胶电泳）。剩余的反应液用于以后的实验。,本实验中注意：1、酶较昂贵，注意节约，加样中可能会失败，故最 后添加酶。2、反应体系中加入的酶量不能超过总体积的1/10。（否则将导致第二活力）。3、酶试剂中添加有甘油，应适当离心后混匀，切忌用旋涡混合器等剧烈震荡，否则可致酶失活。,2、酶切反应的注意事项：（1）、DNA纯度 混有RNA，不影响酶的反应速率，但可减少酶的有效浓度，并在电泳中干扰DNA的观察。,杂有核酸酶等蛋白质，会干扰酶切反应，并影响酶解产物，影响DNA片段的定性分析。混有其
20、他DNA，不影响酶解反应，但干扰酶解产物电泳图谱。混有其他杂质，如汞离子、酚、氯仿、乙醇等，会影响酶切速度，甚至改变酶切特异性，出现酶的第二活性。,（2）、DNA甲基化 若DNA上的识别序列被甲基化，则DNA不能被限制性内切核酸酶所识别切割。为解决此问题，应使用甲基化酶缺失的大肠杆菌或使用不受甲基化酶影响的限制性内切核酸酶。,（3）、星号活力（第二活力）定义：指改变了酶切反应条件后特异识别序列特性降低的一种现象。由于识别特异性降低，可能对原识别序列相似的序列也产生切割反应。,3、终止限制性内切核酸酶反应的方法 加EDTA螯合Mg，使酶失去辅助因子而终止酶切反应。高温使酶灭活，通常是65、510
21、min，但有些酶不能用此方法。加SDS至终浓度的0.1%或加尿素至0.5mol/L，使酶蛋白解聚变性。用等体积酚抽提酶解产物，灭活最彻底，用乙醇沉淀法回收DNA。,2+,第四节 DNA作图,1、定义：确定目的基因有哪些限制性内切核酸酶识别位点的过程叫DNA作图。2、选用哪些限制性内切核酸酶进行DNA作图？实验室常用的限制性内切核酸酶；克隆载体的多克隆位点存在的限制性内切核酸酶。3、实验步骤：反应体系 双蒸水 16uL DNA 1uL 10添加缓冲液 2uL 各限制性核酸内切酶 1uL,37温浴1小时。过夜。取10uL进行琼脂糖凝胶电泳。根据电泳结果，确定片段数及片段长度。作图边作图边推测切割位点。,作图结果,
