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1、抗炎免疫中药的作用机制及相关研究,杨伟鹏中药药代动力学研究室,中国中医科学院硕士研究生中药药理学,主要内容,炎症简介抗炎免疫中药的作用机制雪莲细胞培养物总黄酮抗炎作用的机理研究,炎症,炎症概念：炎症是具有血管系统的活体组织对损伤因子所发生的，由多种细胞、多种因子参与的复杂防御反应。是人类疾病的一种最常见的病理过程，大多数疾病均与此有关，如感染，肿瘤，心脑血管病，老年痴呆等。它是医学生物学中最原始、最复杂又最具挑战的新课题（New Adventures of an Old Flame）。它是我们防治人类重大疾病的一个最基本、最重要的共同公路。,临床表现：局部表现：红、肿、热、痛及功能障碍。红、热
2、：血管扩张、血流加速。肿胀：炎症性充血、液体和细胞成分渗出。疼痛：渗出物压迫和炎症介质直接作用于神经末梢。功能障碍：在以上病变基础上基于部位性质和严重程度不同引起不同的功能障碍。全身反应：发热、外周白细胞变化等。发热：致炎因子作用于机体，通过各种细胞因子作用于体温调节中枢，产热增加，散热减少，体温升高。白细胞变化：中性粒细胞增加-细菌感染引起的急性炎症早期和化脓性炎症。淋巴细胞增加-慢性炎症和病毒感染。嗜酸性粒细胞增加-过敏或寄生虫感染。白细胞减少-病毒、立克次体、伤寒等,常见致炎因素：物理因素（高热低温、紫外线、放射线等）化学因素（强酸、强碱、松节油、芥子气等）机械因素（切割、撞击、挤压等）
3、生物因素（细菌、病毒、立克次体、支原体、真菌等）免疫因素（各种变态反应、自身免疫性疾病等）炎症基本病理变化：变质、渗出、增生变质-炎症局部组织所发生的变性或坏死渗出-炎症局部组织血管内的液体和白细胞通过血管壁进入间质和浆膜腔的过程。以血管反应为中心的渗出病变是炎症的标志。增生-炎症局部的巨噬细胞、内皮细胞和纤维母细胞的增生。炎症是损伤（变质）、抗损伤（渗出）、修复（增生）三位一体的过程。,炎症过程及参与炎症反应的组织成分：吞噬细胞（巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性细胞）、血小板和血管内皮细胞，受刺激后活化，产生一系列炎性介质，引起炎症级联反应。激活的巨噬细胞和白细胞能杀灭病原体，清除异物，促进损伤
4、组织的修复。炎症的防御作用及潜在危害：防御作用对机体有利，消除致病因子，液体的渗出可稀释毒素，吞噬搬运坏死组织以利于再生和修复，使致病因子局限在炎症部位而不致蔓延全身。危害：严重过敏危及生命、喉部严重水肿可致窒息、脑膜炎可致颅内压升高压迫中枢而至死亡，炎症性瘢痕可致肠梗阻或关节活动受限等。,炎症的分类,抗炎实验方法,非特异性炎症模型早期炎症模型毛细血管通透性实验法：耳肿胀、腹腔染料渗出 毛细血管扩张及通透性亢进急性关节肿胀实验：足肿胀渗出、水肿中期炎症模型：羧甲基纤维素囊法血小板黏附、白细胞游走晚期炎症模型：棉球肉芽肿法 纤维组织增生、肉芽屏障形成,特异性炎症模型大鼠佐剂性关节炎：常作为类风湿
5、性关节炎的一种实验模型。将福氏完全佐剂（FCA）皮内注入大鼠足跖或尾根部致炎，历经急性局部炎症（第1-4天）、急性炎症缓解（7-12天）、以多发性关节炎为特征的慢性周身炎症（10-28天）及永久性关节畸形（第35天以后）等四个阶段。本病的发生与单核细胞的异常活化和抑制性T细胞功能的降低有关。胶原诱导关节炎：将II型胶原（关节软骨的一种主要成分）加入福氏不完全佐剂（FICA）中，皮内注入大鼠足跖或尾根部致炎。反应与大鼠佐剂性关节炎相似。抗原诱导关节炎：将抗原加入FCA中，给家兔皮内注射致敏，2-3周后，给已致敏兔的一侧关节内注射抗原，其关节病变的病理组织学和慢性过程，与类风湿关节炎相似。被动转移
6、关节炎：用ConA活化佐剂性关节炎大鼠的脾淋巴细胞，将其与IgG一起静脉注射受体鼠，3天后出现多发性关节炎，第13-15天，病变最严重，可见四肢关节广泛性骨质疏松、骨膜增厚等，最后引起关节畸变。一般认为该模型较其它模型更接近人的类风湿性关节炎。,炎性介质的分类,虽然部分致炎因子可直接引起局部组织发生急性炎症反应，但多数急性炎症过程是由一系列内源性化学因子介导实现的，这类化学因子称为炎症介质。包含细胞释放的炎症介质和体液中产生的炎症介质。细胞释放的炎症介质：血管活性胺、花生四烯酸代谢产物、白细胞产物、细胞因子、血小板活化因子、神经肽、NO体液中产生的炎症介质：补体系统、激肽系统、凝血系统和纤维蛋
7、白溶解系统。,1，血管活性胺（组胺和5-羟色胺）组胺：存在于肥大细胞、嗜碱性粒细胞的颗粒中，也存在于血小板颗粒中。可引起细动脉扩张、细静脉内皮细胞收缩，导致血管通透性升高。对嗜酸性粒细胞有趋化作用。5-羟色胺：由血小板释放，与血管通透性升高有关。2，花生四烯酸代谢产物：（前列腺素、白三烯）,炎症过程中花生四烯酸的代谢,3，白细胞产物：活性氧代谢产物：氧化应激：是1990年美国提出的一种病生理概念，是指机体在内外环境有害刺激的条件下，体内产生活性氧自由基（ROS）和活性氮自由基（RNS）所引起的细胞和组织的生理和病理反应。ROS有超氧阴离子（O2-）、羟自由基（OH-）和过氧化氢（H2O2）等等
8、；RNS有一氧化氮（NO）、二氧化碳（CO2）和过氧亚硝酸盐（ONOO-）等等。由于它们可以直接或间接氧化或损伤DNA、蛋白质和脂质，可诱发基因的突变、蛋白质变性和脂质过氧化，被认为是人体衰老和各种重要疾病如肿瘤、心脑血管疾病、神经退行性疾病（老年痴呆）、糖尿病等等最主要的危险因子。除杀伤细菌外，还可释放到细胞外引起多种细胞因子表达增加，促进炎症反应1，损伤血管内皮细胞导致血管通透性增加，2，灭活抗蛋白酶，导致蛋白酶活性增加，可破坏组织结构成分3，损伤红细胞和其他实质细胞中性粒细胞溶酶体成分：中性粒细胞的死亡、吞噬泡形成过程中的外溢及出胞作用，溶酶体成分可外释，介导急性炎症。,4，细胞因子：主
9、要由激活的淋巴细胞和单核巨噬细胞产生。见后5，血小板活化因子（PAF）：激活血小板，引起血小板粘附、聚集、释放组胺、5-HT，还能活化单核巨噬细胞和内皮细胞，增加血管通透性、促进白细胞聚焦和粘着以及趋化作用。此外还具有影响全身血流动力学的功能。嗜碱性粒细胞、中性粒细胞、单核细胞和内皮细胞均能释放PAF，PAF一方面可直接作用于靶细胞，还可刺激细胞合成其他炎症介质，特别是PG和白三烯的合成。6，神经肽：例如P物质，可直接和间接刺激肥大细胞脱颗粒，通过NF-B途径促进淋巴细胞表达IL-6、IL-8以及巨噬细胞蛋白-1，引起血管扩张和通透性增加；血管活性肠肽（VIP）可抑制肥大细胞脱颗粒和改变其颗粒
10、内容物，抑制前炎症因子IL-6、IL-12、TNF-和iNOS的产生，促进抗炎因子IL-10的产生，发挥调节炎症的作用；降钙素基因相关肽（CGRP）有较强的舒张真皮微血管作用，又能刺激微血管内皮细胞和单核细胞活化，使其分泌趋化因子IL-8，诱导内皮细胞与单核细胞及中性粒细胞的粘附作用。,7，一氧化氮NO：生理状况下，血管内皮细胞有少量NO产生，可松弛血管平滑肌，引起血管扩张。炎症和损伤，如缺血-再灌注损伤时，血管内皮细胞功能障碍，导致NO生成减少；而单核巨噬细胞、血管平滑肌细胞等在LPS、TNF-、IL-1、IFN作用下，产生大量NO。作用：一方面，NO可通过增加局部血流，促进血浆的渗出和水肿
11、的形成，引起细胞毒作用和组织损伤；另一方面，NO还具有抗炎作用，可减少血小板的聚集和粘附、抑制肥大细胞诱发的炎症反应、减少急性炎症灶内的白细胞聚集，而阻断NO的产生则可促进白细胞的滚动和粘着；NO有个不成对电子，可与白细胞的活性氧代谢产物结合，形成过氧亚硝酸盐（ONOO-）和NO2等，通过破坏微生物的DNA、蛋白质和脂类而杀灭之。,体液中产生的炎症介质：补体系统、激肽系统、凝血系统和纤维蛋白溶解系统补体系统：C3和C5的激活最重要，C3a和C5a是重要的炎症介质，从以下三方面影响炎症：1，C3a和C5a通过肥大细胞和单核细胞增加血管通透性，引起血管扩张；C5a还能激活花生四烯酸代谢的脂氧酶途径
12、，使中性粒细胞和单核细胞进一步释放炎症介质；2，C5a是中性粒细胞和单核细胞的趋化因子，通过激活中性粒细胞增加整合素的表达，引起中性粒细胞粘着于血管内皮细胞；3，C3b结合于细菌细胞壁时具有调理素作用，可增强中性粒细胞和单核细胞的吞噬活性。,激肽系统：血浆中的激肽原在激肽释放酶作用下裂解生成具有活性的缓激肽，缓激肽可引起细动脉扩张、内皮细胞收缩、细静脉通透性增加，还可使血管以外的平滑肌收缩以及在炎症局部产生疼痛。缓激肽作用十分短暂，很快被血浆和组织中的激肽酶灭活，其作用主要局限在血管通透性增加的早期。激肽释放酶本身也具有趋化性，能直接使C5转化为C5a。凝血系统和纤维蛋白溶解系统：凝血酶在使纤
13、维蛋白原转化为纤维蛋白的过程中释放纤维蛋白多肽，凝血酶可促使白细胞粘着和成纤维细胞增生，纤维蛋白多肽可使血管通透性增高，同时具有白细胞趋化作用。纤维蛋白溶解系统可通过激肽系统引起炎症的血管变化。由内皮细胞、白细胞和其他组织产生的纤维蛋白溶解原激活因子，能使纤维蛋白溶酶原转变成纤维蛋白溶酶，表现出炎症活性：启动缓激肽的生成过程、裂解C3生成C3a、降解纤维蛋白产生裂解产物，使血管通透性增加。,炎症介质的特点,特点：炎性介质来自白细胞和血浆，前者以颗粒形式储存于细胞内，需要时或在致炎因子作用下合成并释放；后者以前体形式存在于血浆中，经蛋白水解酶裂解才能被激活。多数炎性介质通过与靶细胞表面的特异性受
14、体结合发挥生物活性，少数本身具有酶活性。炎性介质可使靶细胞产生第二级炎性介质，后者的作用可以与原介质相同或相似，也可以截然相反。一种炎性介质可作用于一种或多种靶细胞，其产生的效果取决于细胞和组织的类型。炎性介质一旦被激活或由细胞释放，存在的时间很短。大多数炎性介质具有潜在的致损伤能力。,主要炎症介质的作用,抗炎免疫中药的作用机制,兴奋垂体-肾上腺皮质轴，促进肾上腺皮质激素的释放作用于细胞因子调节一氧化氮水平调节氧化应激/抗氧化平衡调控细胞内信号传导通路对基因转录环节的调控作用,1，兴奋垂体-肾上腺皮质轴，促进肾上腺皮质激素的释放下丘脑-垂体-肾上腺轴,促肾上腺皮质激素分泌激素,促肾上腺皮质激素
15、,GC,人参皂苷大鼠腹腔注射后，血浆内皮质酮和促肾上腺皮质激素水平的升高相平行，提示其促进肾上腺皮质激素分泌的始初部位可能在垂体前叶。人参皂苷在使血浆皮质酮升高时肾上腺内cAMP含量也相应升高，但于去垂体大鼠，人参皂苷则失去了升高肾上腺cAMP的作用，表明人参皂苷兴奋肾上腺皮质功能的作用必须通过垂体前叶，即首先释放垂体前叶ACTH才能得以实现。柴胡皂苷能使肾上腺增重，胸腺萎缩，柴胡皂苷a，d能兴奋垂体前叶分泌促肾上腺皮质激素（ACTH）促进肾上腺合成和分泌肾上腺皮质激素；还能提高糖皮质激素与其受体的亲和力，进而增加糖皮质激素的抗炎作用。,白芍总苷对正常大鼠的下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPAA）呈
16、现小剂量兴奋（血浆皮质醇CS含量升高），大剂量抑制（血浆皮质醇CS含量降低）的剂量依赖性调节作用。白芍总苷在降低束缚应激大鼠血浆CS、ACTH水平的同时，上调受抑制的大鼠脾淋巴细胞ConA增殖反应，提示白芍总苷的免疫调节作用可能与其调节HPAA的功能有关。青藤碱降低大鼠肾上腺维生素C的含量，切除大鼠肾上腺或垂体后，青藤碱的抗炎作用消失。黄褐毛忍冬总皂苷能使幼年大鼠胸腺萎缩，摘除双侧肾上腺后对大鼠角叉菜胶性足肿胀的抑制作用消失，也不能延长切除肾上腺幼年大鼠的生存时间，表明抗炎作用有赖于肾上腺的完整存在。,云南白药总苷给大鼠皮下注射15mg/kg，连续7天，可显著降低肾上腺内抗坏血酸含量，抑制幼年
17、小鼠胸腺生长，提示其抗炎作用部分可能通过肾上腺皮质系统产生。娑罗子皂苷5mg/kg腹腔注射一次给药，可显著降低清醒大鼠及戊巴比妥钠麻醉大鼠肾上腺内维生素C含量，表明本品通过刺激肾上腺皮质发挥作用；给大鼠腹腔注射B-七叶皂苷5mg/kg可使血浆中的皮质甾酮明显升高，引起ACTH分泌增加，促进肾上腺皮质甾酮的合成。雪莲黄酮5mg/kg腹腔注射对去肾上腺大鼠蛋清性足肿胀无明显抑制作用，致炎后4h后才表现出显著性差异，提示抗炎途径主要是通过肾上腺皮质发挥作用。大鼠腹腔注射雪莲黄酮可使大鼠肾上腺维生素C含量明显减少，进一步证实该药主要通过促进肾上腺皮质功能而发挥抗炎作用。,2，作用于细胞因子,细胞因子是
18、由多种细胞所分泌的能调节细胞生长分化、调节免疫功能，参与炎症发生和创伤愈合等小分子多肽的通称，包含白介素、干扰素、肿瘤坏死因子、转化生长因子-家族（TGF-）等。它们由淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、上皮细胞等产生。现已证实细胞因子在局部炎症反应和免疫反应中起重要作用，IL-1,IL-6,IL-8和TNF等是公认的促炎症细胞因子。机体在致炎因子的作用下，可引起多种细胞产生和释放细胞因子，如IL-1、TNF-、PGE2等，诱导iNOS生成，促进NO合成和释放，这些因子互相影响，促进炎症发展。当机体在重度感染时，腹腔巨噬细胞受到大量脂多糖刺激，产生大量的IL-1、IL-6、TNF等，它们相互诱生，相
19、互协同。这些细胞因子的过量存在，进一步激活多形核白细胞和内皮细胞等效应细胞，并释放氧自由基、蛋白酶等，加速花生四烯酸代谢，释放血栓素、前列腺素、白三烯等炎症介质，形成瀑布效应，导致过度炎症反应。,IL-1是由多种细胞合成和分泌的细胞因子，按其结构主要分为IL-1和IL-1两种，后者为其主要分泌形式。IL-1与炎症关系极为密切，它可使中性粒细胞聚集和发生急性反应，还可引起其他炎性因子的产生，可以通过诱导COX-2基因的表达，使前列腺素的分泌增加而参与介导炎症和免疫反应。IL-1不仅能够协同其他细胞因子促进B、T细胞活化，而且能够诱导其他炎性介质的产生，加强白细胞与内皮细胞的粘附，调节TNF-、I
20、L-6的产生，属于一种前炎性细胞因子。TNF是一种主要由单核细胞和巨噬细胞分泌产生的蛋白，可分为TNF-和TNF-两大类。其中TNF-可由感染、缺血和损伤诱导，属于前炎症细胞因子，具有广泛的生物学功能。,发生炎症时，单核巨噬细胞能产生大量TNF-和IL-1，这两种细胞因子具有许多相同的生物活性：如致热作用、促进细胞分解代谢、产生急性反应期蛋白以及使内皮细胞分泌NO、PGI2、PGE2和血小板活化因子等，这将导致炎症面积的扩大以及炎症介质、破坏性酶类、自由基分泌的增加。IL-1还可通过自分泌或旁分泌刺激其他炎症介质如IL-6,IL-8和TNF-的产生。TNF-则可使中性粒细胞聚集、内皮细胞粘附分
21、子上调以及增加上皮紧密连接的通透性和抑制上皮细胞的生长等。,IL-1和TNF在炎症中的主要作用,A，对白细胞介素的影响：商陆皂苷甲对人外周血单核细胞产生的TNF有明显的抑制作用，且能抑制LPS诱导的兔滑膜细胞产生的IL-1、和TNF，认为抑制IL-1、和TNF的产生可能是商陆皂苷甲强大抗炎作用的机制之一。青藤碱可抑制IL-2R的表达，从而阻断IL-2信号传导系统并改善类风湿性关节炎症状和体征，这可能是其治疗该病的机制之一。雷公藤总苷可有效降低AA大鼠血清中细胞因子IL-1、IL-6，降低AA大鼠关节液中IL-1、IL-6、IL-8、TNF的含量，抑制AA大鼠腹腔巨噬细胞分泌的IL-1、IL-6
22、、IL-8、TNF和脾淋巴细胞诱生的IL-6、IL-8的能力。,B，促进干扰素生成：人参三醇型皂苷促进人颈部淋巴细胞-干扰素诱生，促进-干扰素基因表达伴有活性增强。黄芪多糖、人参多糖、柴胡多糖、刺五加多糖当归多糖等均能诱生干扰素。C，对TNF的影响：白芍总苷对LPS诱导的大鼠腹腔巨噬细胞产生的TNF具有双向调节作用。另外白芍总苷可抑制原代培养的AA大鼠滑膜细胞过度分泌IL-1、TNF和PGE2等炎性细胞因子的能力，并使异常活化的滑膜细胞细胞因子降至正常。,3，调节一氧化氮水平,NO由NOS催化L-精氨酸与氧分子经多步氧化还原反应而生成，具有活跃的生化性质。NO在炎症及其免疫机制中发挥双重作用：
23、它能显著抑制细胞内外微生物和肿瘤细胞的活性；同时它又介导细胞毒性。一般地说，组织中诱生型NO合酶（iNOS）在炎症中被诱导生成，产生大量NO，促进炎症反应，包括使血管舒张，形成水肿和局部红斑，增加炎性渗出，细胞毒性以及细胞因子依赖过程的介导作用，促进败血症的发展，激活PG合成酶以及参与类风湿的发展等。相反的，由内皮细胞中原生型NO合酶（cNOS）所产生的NO，则通过激活微血管中的中性粒细胞，抑制白细胞和血小板在内皮细胞上的粘附，抑制淋巴细胞增殖，抑制巨噬细胞的氧化产物，而发挥其保护作用及抑制炎症反应的作用。受到抗原、LPS以及某些细胞因子刺激时多种免疫活性细胞表达iNOS并产生大量NO，抑制特
24、异性免疫反应，触发免疫病理过程而造成组织损伤，调整NO水平有助于许多自身免疫疾病的治疗。,雷公藤总苷对LPS激活的小鼠腹腔巨噬细胞的NO生成具有明显的抑制作用，呈时间和剂量依赖关系，提示雷公藤总苷的抗炎及免疫抑制作用可能与其抑制巨噬细胞一氧化氮生成有关。白芍总苷50mg/kg治疗7天上调佐剂性关节炎大鼠细胞低下ConA反应是其下调腹腔巨噬细胞NO等抑制介质的结果；使佐剂性关节炎大鼠腹腔巨噬细胞NO、TNF产生降低或恢复，白芍总苷能使AA大鼠14、21、28d低下脾细胞增殖反应恢复正常，同时还使其过低的SOD活性增高或恢复正常。,4，调节氧化应激和抗氧化平衡,ROS和氧化应激：是一把“双刃剑”，
25、产生过多，作用不当的确可以引起细胞凋亡和组织损伤，诱发多种疾病。但体内还有强大的抗氧化系统，如超氧化歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化酶（GSH-PrX）等等，可以及时快速清除体内过剩的ROS。在正常生理条件下，体内氧化和抗氧化系统保持动态平衡，既保证正常氧化应激反应，又防止ROS对人体的危害。只有在ROS生成过盛，抗氧化酶表达不足，氧化和抗氧化平衡失调，ROS不能及时清除和体内大量积蓄，才会引起细胞和组织的损伤，危害人体的健康。氧化和抗氧化的平衡和谐是健康的基础。,氧化应激和抗氧化不单纯是一种生化反应，它更有着极其复杂的细胞和分子机制，包括膜氧化、线粒体代谢、内质网应激、
26、核的重构、DNA损伤修复、基因转录表达、泛素和泛素化、自吞和溶酶体、细胞外基质、信号传递、蛋白折叠等多重的细胞和分子改变。它们还是体内多种代谢和信号通路的启动者和调节者，如JNK/SAPK、P38MAPK、IKK/NF-B等；激活和调控各种转录因子，如AP-1、Nrf2、NF-B、p53等，影响体内各种基因的转录和表达，参与体内炎症、免疫、生殖、发育、代谢、细胞生长、增殖、细胞再生、修复等各种重要生命过程的调节。,Nrf2（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2）是调节机体氧化应激反应的关键转录因子，为锌指蛋白转录因子家族的成员之一，在细胞调节转
27、录反应、调控细胞对抗外来异物和氧化损伤中发挥重要作用。正常情况下，Nrf2定位于细胞质中并与肌动蛋白结合蛋白Keap1相互作用，可被泛素蛋白酶体途径迅速降解。当受到来源于活性氧的信号攻击后，Nrf2从Keap1中解离，然后稳定状态的Nrf2转位进入细胞核，与其它的bZIP蛋白结合成异二聚体，异二聚体通过与抗氧化反应元件（ARE）相互作用调控靶基因相酶的转录和蛋白表达，这些酶能够保护机体免受毒性物质（如致癌物、药物代谢活化产物等）及一些活性氧的侵害。受到氧化冲击时，Nrf2的激活和随后的细胞保护基因的诱导可以恢复体内氧化和抗氧化系统的平衡，其在细胞的防御保护中发挥重要作用。,内源性Nrf2 参与
28、炎症反应与创伤修复，创伤后上皮细胞Nrf2 有高表达，Nrf2 缺失则炎性因子IL-1、TNF持续增高，创伤上皮修复期延长。Nrf2-Keap1 系统在细胞抵御外源性或内源性氧化应激的机制中有重要地位。目前认同的Nrf2 激活机制包括Nrf2 与Keap1 的解偶连、蛋白酶对Nrf2 的降解减弱、Nrf2 磷酸化等。Nrf2缺失或激活障碍，会引起细胞对应激源的敏感性增高，与化学促癌的发生、炎症修复进程延长、细胞功能障碍、细胞调亡等病变过程密切相关。,Nrf2-ARE通路在氧化应激中的调控作用,5，调控细胞内信号传导通路,A，NF-B信号传导途径1）NF-B的功能 NF-B是一种分布和作用均十分
29、广泛的真核细胞转录因子，功能性NF-B结合序列存在于许多基因的启动子和增强子中，故NF-B可与许多基因上的启动子区域的固定核苷酸序列结合而启动基因转录，控制着细胞因子、粘附因子、生长因子、酶（COX-2、iNOS）、神经肽等多种靶基因的表达，在机体的免疫应答、炎症反应及细胞生长调控等方面发挥重要作用。,静止细胞中的NF-B与IB结合以非活性异寡聚体的形式存在于胞浆中。细胞受刺激后，由信号诱导激活的IB激酶（IKK）引起IB蛋白第32位丝氨酸的磷酸化，磷酸化的IB则由泛素蛋白在多个位点形成泛素化，泛素化后的IB被26S蛋白酶小体降解，暴露出Rel蛋白上的核定位信号NLS，NF-B遂从三聚体上释放
30、出来，迅速移位入细胞核与靶基因上启动子区特定的B位点DNA序列发生特异性结合，从而启动基因转录，蛋白质合成。NF-B在核内与新合成的IB结合后出核，进入胞浆，从而失活。,NF-B为氧化应激反应性转录因子，可被多种能引起胞浆IB磷酸化或被体内泛素/蛋白酶体系识别而降解的因素所激活，如过氧化氢、活性氧（ROS）、促炎性细胞因子TNF-与IL-1、氧自由基、细胞内钙增加、促T细胞和B细胞分裂剂、细菌、病毒及内毒素等。其中ROS可能是激活IKK的共同第二信使，NF-B的各诱导因素可能通过产生ROS激活IKK，使IB快速磷酸化，此激活过程可在细胞受刺激后数分钟内完成。不同抗氧化剂均能抑制NF-B活化，抑
31、制粘附分子表达。,2）.NF-B活化调节与炎症性疾病 NF-B是前炎症因子基因表达调节的关键成分之一，它诱导前炎症细胞因子、趋化因子、粘附分子等的表达。NF-B在多种炎症性疾病的炎症部位高度活化，如类风湿性关节炎、炎症性腹泻、多发性硬化症、哮喘等。用NF-B特异性抗体进行组织切片染色显示核定位的NF-B活性的增加，同时伴有炎症细胞聚集的增加和前炎症细胞因子如IL-1、IL-6、IL-8和TNF的合成。,NF-B的活化在体内受到精细的调控,包括正负反馈调控途径：(1)正反馈调节途径：细胞受到前炎症因子如TNF-、IL-1刺激，经过一系列信号转导激活NF-B，增强TNF-、IL-1的转录，后者水平
32、增高可进一步活化NF-B，从而增强炎症反应。(2)负反馈调节途径：NF-B激活的同时，IB和p105基因转录增强，IB和p105基因的顺式作用元件中均含有NF-B的结合序列，抑制成分增多，一方面与细胞浆中NF-B二聚体结合，将其限制在细胞浆中，下调NF-B活化水平，细胞因子转录被终止而限制炎症反应；另一方面IB可连续穿梭于核质间，将大量入核的活化NF-B再次带回胞浆，避免NF-B的过渡活化。,这两种调节同时存在，NF-B的状态取决于占优势的调节方式。研究证实，通过IK亚单位的磷酸化，正负反馈调节IB激酶活性。在哺乳动物细胞中，受TNF、IL-1等前炎症因子刺激后,IKK T环中二个Ser残基的
33、磷酸化是IKK活化的基础。而将IKK中二个Ser残基消除，并不影响IKK的活化。因此,IKK是前炎症刺激的靶单位。IKK一旦活化，IKK在C末端富含的Ser自动磷酸化，这种磷酸化可降低IKK活性，可防止炎症反应的过渡，从而起到负反馈调节作用。,NF-B调节的蛋白包括细胞因子、趋化因子、生长因子、粘附分子、免疫受体、转录因子、氧化应激相关酶以及急性期蛋白等。众多的研究表明NF-B参与炎症和免疫反应、某些疾病的病理产生、急性期反应、细胞周期控制与分化以及对病毒感染的反应等。所以NF-B是非常重要的转录因子，与药物研究有密切的关系。,B，MAPK信号传导通路丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)是介导细胞反
34、应的重要信号系统，普遍存在于多种生物，包括酵母和哺乳动物细胞，包括JNK、p38、ERK1等亚族。MAPK在介导炎症反应和细胞因子生成中起着重要的作用，其中p38和ERK1通路与炎症反应有着密切的关系。,研究发现，ERK通路在某些生长因子刺激引起的细胞反应中起重要的调控作用，还参与应激刺激、细菌产物、炎症介质等引起的细胞反应；p38蛋白激酶可被促炎因子、应激刺激以及LPS等激活，在炎症反应中起主要作用，炎症刺激如LPS、TNF、IL-1等均可介导单核细胞、内皮细胞和中性粒细胞等先天性免疫细胞中p38MAPK激活，单核/巨噬细胞表达TNF、IL-1、IL-6、IL-8和环加氧酶-2均依赖p38M
35、APK。,LPS介导的细胞炎症反应是一个典型的病原体与机体相互作用的过程。LPS刺激细胞能够激活ERK、JNK和p38，然后作用于各自的底物，影响多种转录因子的活性，从而调节包括TNF、IL-1、IL-6、IL-8等多种细胞因子在内的基因的表达。而TNF-、IL-1、花生四烯酸(AA)产物、内皮素等多种炎症介质能激活不同MAPK，通过促进或抑制基因的转录来调控其它炎症介质的生成。,研究发现LPS可激活Raw264.7细胞p38，使其移位入核；p38激活入核后参与了LPS诱导的TNF-基因转录表达的调控。ERK、JNK和p38通路都能被TNF-强烈激活，通过对转录因子的作用而影响TNF-的产生和
36、生物学效应。,IL-1也是参与炎症反应的重要介质。它在炎症中的主要作用包括刺激其它炎症介质，如TNF-、IL-6、IL-8和PGs等的释放、激活T和B淋巴细胞。增加粘附分子的表达、刺激急性期蛋白的生成和释放等。有报道，IL-1能通过激活p38而上调PGE2和下调NO的合成。,AA代谢产物前列腺素(PGs)和白三烯类(LTs)在促进炎症的过程中起重要作用。ERK1/2激活可诱导COX-2生成，限制氧化应激对心肌细胞的损伤。COX是PG合成的限速酶，经典抗炎药水杨酸类通过抑制其活性而减少PG的产生，抑制炎症反应。P38通路和JNK通路激活后能上调IL-1诱导的COX表达，使PGE2合成增加，利用p
37、38抑制剂能完全抑制这种作用。,研究发现，ERK信号途径参与了LPS介导的人内皮细胞iNOS表达和NO产生。用ERK的特异性抑制剂处理细胞后可以显著抑制LPS诱导人内皮细胞ERK的活性。与对照组相比，LPS刺激后的ECV304细胞iNOS蛋白和mRNA的表达明显增加，培养基中NO水平也显著升高，用ERK抑制剂预处理细胞后，可显著抑制细胞iNOS表达和NO和产生。,研究表明，在LPS诱导的人内皮细胞内，p38MAPK可在转录和翻译水平上快速调节iNOS的表达。在小鼠内毒素血症模型中，发现在p38MAPK参与内毒素性休克，iNOS在肺组织的表达最快、最显著，提示在多器官功能障碍综合症的发生中肺是起
38、始器官，p38MAPK和iNOS参与多器官功能障碍综合症过程中的起始反应。,NF-B在调节慢性炎症疾病中粘附分子、酶和细胞因子的转录中起重要作用。p38MAPK能活化NF-B。研究发现p38MAPK特异性抑制剂可以抑制NF-B依赖的转录过程。在中性粒细胞中,高泳动类蛋白1(HMGB1)活化p38MAPK，从而增加NF-B的核转移和致炎因子的表达；然而，NF-B亚单位的磷酸化、核转移和NF-B与DNA结合不受p38MAPK抑制剂的影响。这说明NF-B和p38MAPK通过独立的效应通路活化，可能在细胞核内有共同的下游通路。,研究发现单独使用ERK抑制剂或p38 MAPK抑制剂，仅能部分降低LPS刺
39、激的肺泡巨噬细胞因子IL-6和TNF mRNA表达，而联合使用则能降低细胞因子基因表达，使之接近正常水平。说明ERK和p38 MAPK协同在LPS刺激的炎症反应中发挥作用。,6，对基因转录环节的调控作用A，调控细胞因子mRNA的表达人参皂苷皮下注射，可逆转IL-2、IL-2mRNA的受抑制状态，使IL-2mRNA和IL-2蛋白含量显著增加；人参三醇型皂苷对淋巴细胞分泌的IL-6有促进作用，是通过对IL-6mRNA转译的直接促进作用。B，影响核因子的结合活性明党参多糖可显著降低LPS刺激的NF-B结合活性的升高，从而降低IL-1、TNF、IL-6等细胞因子表达，发挥抗炎抗应激作用。,慢性炎症致突
40、变途径示意图,雪莲细胞培养物总黄酮抗炎作用的机理研究杨伟鹏 周钟鸣 中国中医科学院中药研究所,前 言,野生雪莲（国家三级保护植物）药用价值高，资源有限，目前已濒临灭绝。雪莲人工栽培周期较长，多年生，投入高，占用土地，受自然条件限制。雪莲的细胞培养周期短（仅需12天），有效成份得率高（总黄酮含量是野生雪莲的89倍）成本低。研究雪莲细胞培养物总黄酮抗炎作用机理，为开发我国有自主知识产权的新药提供实验方面的支持。,研究内容：1.野生雪莲总黄酮和雪莲细胞培养物总黄酮的药效学研究2.野生雪莲总黄酮和雪莲细胞培养物总黄酮对体内外炎症介质和细胞因子的影响3.雪莲细胞培养物总黄酮对巨噬细胞凋亡的影响4.雪莲细
41、胞培养物总黄酮抗炎作用的分子机制研究,第一部分 野生雪莲总黄酮和雪莲细胞培养物总黄酮的药效学研究表1 野生雪莲总黄酮、雪莲细胞培养物总黄酮对小鼠热刺激甩尾的影响（xs），n10,注：与对照组比较：*P0.05,*P0.01,图1 野生雪莲总黄酮、雪莲细胞培养物总黄酮对小鼠耳廓肿胀的影响,与模型组相比*P0.01,图2 野生雪莲总黄酮、雪莲细胞培养物总黄酮对大鼠角叉菜胶足肿胀的影响,与模型组相比*P0.01,图3 野生雪莲总黄酮、雪莲细胞培养物总黄酮对小鼠脾脏B淋巴细胞增殖的影响,与溶剂对照组相比，*P0.05，*P0.01,图4 野生雪莲总黄酮、雪莲细胞培养物总黄酮对小鼠脾脏T淋巴细胞增殖的影
42、响,与溶剂对照组相比*P0.01,野生雪莲总黄酮和雪莲细胞培养物总黄酮都具有镇痛、抗炎、免疫抑制的作用，二者在镇痛、抗炎和免疫抑制作用上没有显著性差别。,第二部分 野生雪莲总黄酮和雪莲细胞培养物总黄酮对体内外炎症介质和细胞因子的影响表2 野生雪莲总黄酮、雪莲细胞培养物总黄酮对致炎大鼠血清IL-1含量的影响(xs),注：与模型组相比，*P0.01*P0.05，以下同。,表3 野生雪莲总黄酮、雪莲细胞培养物总黄酮对致炎大鼠血清NO含量的影响(xs),表4 野生雪莲总黄酮、雪莲细胞培养物总黄酮对炎大鼠血清PGE2含量的影响(xs)，n=10,野生雪莲总黄酮和雪莲细胞培养物总黄酮均能明显抑制致炎鼠血清
43、中的炎症介质NO、PGE2和炎性细胞因子IL-1的分泌而起到抗炎作用。野生雪莲总黄酮和雪莲细胞培养物总黄酮在抑制炎症介质和细胞因子的作用上无显著性差异。,野生雪莲总黄酮和雪莲细胞培养物总黄酮对RAW264.7细胞IC50的测定。,MTT法测定野生、培养雪莲总黄酮的IC50，结果如图：得到野生雪莲总黄酮的IC500.4377mg/ml.、雪莲细胞培养物总黄酮的IC500.8999mg/ml。,图5 MTT法测定IC50,表5 野生雪莲总黄酮和雪莲细胞培养物总黄酮对体外培养巨噬细胞分泌NO含量的影响(xs)，n=3,注：模型组与对照组相比 P0.01,给药组与模型组相比，*P0.01*P0.05，
44、以下同。,表6 野生雪莲总黄酮和雪莲细胞培养物总黄酮对体外培养巨噬细胞分泌PGE2含量的影响(xs)，n=3,表7 野生雪莲总黄酮和雪莲细胞培养物总黄酮对体外培养巨噬细胞分泌IL-1含量的影响(xs)，n=3,表8 雪莲细胞培养物总黄酮对体外培养巨噬细胞分泌TNF含量的影响(xs)，n6,图6 雪莲细胞培养物总黄酮对体外培养巨噬细胞分泌IL-6含量的影响,注：模型组与溶剂对照组相比 P0.01,给药组与模型组相比，*P0.01,野生雪莲总黄酮和雪莲细胞培养物总黄酮对LPS诱导的巨噬细胞产生的炎性介质NO、PGE2以及炎性细胞因子IL-1具有显著的抑制作用，二者无显著性差异。雪莲细胞培养物总黄酮
45、对LPS诱导的巨噬细胞产生的TNF、IL-6也有显著的抑制作用。,第三部分 雪莲细胞培养物总黄酮对巨噬细胞凋亡的影响,A,B,D,E,F,实验结果表明，1g/ml、0.1g/ml LPS虽可促进巨噬细胞发生凋亡，但并没有显示出显著性差异，而吲哚美辛和雪莲总黄酮均可在LPS存在的基础上进一步显著促进巨噬细胞发生凋亡和坏死。,图7 Raw264.7细胞流式细胞术检测结果（LPS 1g/mL）,图8 Raw264.7细胞流式细胞术检测结果（LPS 0.1g/mL）,第四部分 雪莲细胞培养物总黄酮抗炎作用的分子机制研究,对RNA表达的影响提取细胞总RNA逆转录合成cDNAPCR扩增琼脂糖凝胶电泳,CO
46、X-2（244bp）,A：空白组；B：DMSO对照组；C：LPS刺激组；D：45g/ml；E：22.5g/ml；F：4.5g/ml；G：2.25g/ml；H：0.45g/ml；I：0.045g/ml,GAPDH（358bp）,图9.雪莲细胞培养物总黄酮对巨噬细胞COX-2mRNA表达的影响,A B C D E F G H I,iNOS（499bp）,GAPDH（358bp）,a：空白组；b：DMSO对照组；c：LPS刺激组；d：45g/ml；e：4.5g/ml l；f：0.45g/ml；g：0.045g/ml,图10.雪莲细胞培养物总黄酮对巨噬细胞iNOSmRNA表达的影响,a b c d e
47、 f g,IL-1（529bp）,GAPDH（358bp）,A：空白组；B：DMSO对照组；C：LPS刺激组；D：45g/ml；E：22.5g/ml；F：4.5g/ml；G：2.25g/ml；H：0.45g/ml；I：0.045g/ml,A B C D E F G H I,图11.雪莲细胞培养物总黄酮对巨噬细胞IL-1mRNA表达的影响,雪莲细胞培养物总黄酮能显著抑制巨噬细胞COX-2、IL-1、iNOS mRNA表达，进而抑制PGE2 IL-1、NO的产生而达到抗炎效果。,NF-B p65（404bp）,GAPDH（358bp）,A：空白组；B：DMSO对照组；C：LPS刺激组；D：45g/
48、ml；E：22.5g/ml；F：4.5g/ml；G：2.25g/ml；H：0.45g/ml；I：0.045g/ml,A B C D E F G H I,图12.雪莲细胞培养物总黄酮对巨噬细胞NF-B p65 mRNA表达的影响,对蛋白表达的影响提取细胞核蛋白和细胞质蛋白Western blot法测定蛋白表达,图13.雪莲细胞培养物总黄酮对巨噬细胞NF-B、P38、ERK1胞浆蛋白、核蛋白的表达的影响,雪莲细胞培养物总黄酮能显著抑制巨噬细胞NF-B p65 mRNA表达和蛋白表达，其抗炎机理可能与抑制核转录因子NF-B的mRNA表达和蛋白表达有关。LPS刺激可明显增加巨噬细胞中Erk1、p38的
49、蛋白表达，各给药组同刺激组相比，可以降低Erk1、p38的蛋白表达。雪莲细胞培养物总黄酮的抗炎作用可能与MAPK途径中Erk1、p38两条传导通路有关。,LPS,雪莲总黄酮,NF-B,P38,ERK1,iNOS mRNA,NO,抗炎作用,雪莲细胞培养物总黄酮抗炎机理示意图,巨噬细胞,COX-2 mRNA,IL-6 mRNA,IL-1 mRNA,PGE2,IL-1,TNF-,IL-6,TNF-mRNA,通过本研究，我们认为雪莲细胞培养物总黄酮和野生雪莲总黄酮有着相近的抗炎效果，均能够抑制炎症介质和细胞因子的产生，二者没有显著性差异，并探讨了雪莲细胞培养物总黄酮抗炎作用的相关机制。用雪莲细胞培养物总黄酮代替野生雪莲总黄酮作为抗炎药物完全是可行的，将会极大缓解濒危保护植物药材的需求紧张状况。,Thanks!,
