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1、产前诊断技术及羊水、绒毛细胞培养,中南大学医学遗传学国家重点实验室湖南家辉遗传专科医院 文娟,产前诊断的定义,产前诊断(prenatal diagnosis)又称宫内诊断，指先天性疾病或遗传性疾病的胎儿期的诊断，分为无创产前检测和有创产前诊断。通过产前诊断可以在早孕期或中孕期对异常胎儿做出诊断，以便及时治疗或处理。,无创性检查,1.母体血清三项筛查（AFP、-hCG、uE3）2.超声影像检查（B超、CT、MRI）3.母体血中的胎儿细胞检测（无创产前染色体非整倍体综合征检测技术）,基于新一代测序技术的非侵入性产前染色体非整倍体综合征检测技术,无创产前检测指征,高龄（年龄35岁），不愿选择有创产前
2、诊断的孕妇；唐筛结果为高风险或者单项指标值改变，不愿选择有创产前诊断的孕妇；孕期B超胎儿NT值增高或其它解剖结构异常,不愿选择有创产前诊断的孕妇；具有创产前诊断禁忌症的孕妇，如病毒携带者、胎盘前置、胎盘低置、羊水过少或过多、RH血型阴性、流产史、先兆流产或珍贵儿等；羊水穿刺细胞培养失败不愿意再次接受或不能再进行有创产前诊断的孕妇；希望排除胎儿21三体、18三体、13三体综合征，自愿选择行无创产前检测的孕妇。,有创产前诊断,包括采用绒毛穿刺术、羊膜腔穿刺术、脐带血穿刺术获取胎儿细胞，利用染色体技术、微阵列技术（SNP array）和基因检测技术对胎儿进行染色体病、基因组病和基因病的产前诊断，结合
3、终止妊娠技术阻止患儿的出生。,有创产前诊断 1.绒毛膜穿刺（孕10周-13周+6）2.羊膜腔穿刺（孕16周-22周+6）3.脐静脉穿刺（18周之后）4.胎儿镜检查（根据检查目的确定检查时间）,有创产前诊断指征,1、夫妇双方家系中曾出生过有染色体病和基因组病患儿的孕妇；2、既往有生育智力低下、多发畸形、发育迟缓患儿的不良孕产史的孕妇；3、孕期曾接触过可能导致胎儿先天缺陷的物质（如放射线、毒物、化学药剂、微生物等）的孕妇；4、希望通过一次性检测排除染色体异常和基因组异常所致的严重致愚、致残、致死性遗传病的孕妇（发生率达2-3%）。5、可疑有单基因病或有单基因病家族史的孕妇。,羊膜腔穿刺（amnio
4、centesis）羊水细胞主要来自胎儿的皮肤、胃肠道、呼吸道和泌尿生殖道或羊膜内层（表皮细胞、羊膜细胞、未分化细胞、吞噬细胞等），可用于核型分析、DNA诊断,羊水则可用于生化分析。,人羊水细胞培养及染色体制备,人的羊水细胞能长成单层并可连续进行传代培养（50代），羊水中存在着各种不同类型的胎儿细胞，根据细胞形态和生长特征分为三类：上皮样细胞（E）、成纤维样细胞（F）和羊水细胞（AF）。,E细胞：呈致密生长，细胞集落边界清晰，在胰酶消化的连续培养中不再生长，仅在原代培养时可见到，生长期最短。AF细胞：呈鸟眼状，不同的孕妇的羊水中细胞体积可变化。F细胞：呈梭型，生长期最长，细胞分裂旺盛，在较老的羊
5、水培养物中占优势。,三种细胞的生长特性,细胞接种,在无菌条件下抽得3-4管（约20-30ml）羊水后，注入10ml离心管中，立即送检；1500rpm，室温离心10min；在无菌操作台上吸去上清液，每管约留0.5ml，吸管打散细胞。制成细胞悬液，再加入约4.5ml完全培养基入管内，吸管吹打，尽量将细胞打散，移至25cm2方形培养瓶中置含5%CO2的37温箱行开放式培养。,一般5-6天后镜下观察，可见成纤维样或上皮样细胞生长，当细胞生长旺盛，在贴壁细胞层的背景上出现圆形细胞时，视情况换液，继续培养24-48小时，如细胞生长状况好，细胞密度适中，即可加入秋水仙素0.04ug-0.08ug/ml(20
6、ug/ml)，4-6小时左右行细胞学处理。,细胞培养,细胞收获吸出瓶中细胞液入10ml离心管，生理盐水冲洗细胞壁两遍；0.25%EDTA-trypsin消化3-5分钟，待细胞面出现肉眼可见皱形改变时即用吸管吹打细胞，直至全部脱落；收集细胞悬液：1500rpm，室温离心10min，去上清；,低渗：加入0.075M KCl 6ml-7ml，吸管吹打，37水浴5min-10min;预固定：加入1.5ml左右3:1固定液，轻混匀,37水浴5min,1500rpm,室温离心10min；固定：加入3:1固定剂8ml左右，轻混匀，37水浴10min；1500rpm,室温离心10min，去上清，约留0.5ml
7、；重复固定：同上；,1500rpm，室温离心10min，去上清；调悬液：视管底细胞量加入几滴新鲜固定剂，并吹打混匀;滴片：每片1-2滴,滴片4-6张;烤片：75烤箱烘烤3小时;第二天行显带处理：同外周血。,注意事项,在抽取羊水前先引导孕妇做超或翻身，使胎儿脱落细胞悬浮在羊水中；羊水标本应及时送检，送检过程中不宜受热或冰冻，实验人员收到羊水后应先观察羊水是否清亮，含胎脂的多少及是否为血性羊水；羊水中少量红细胞不需处理；离心时，一定要注意离心机内温度，必须达到室温方可离心；接种细胞密度很重要，离心后应根据细胞沉淀来决定几管接种一瓶；,羊水培养首先必须有好的培养基，培养基pH为7.2-7.4也是羊水
8、细胞开放式培养成功的关键；注意接种时培养基不能加得过多，卧倒瓶子时，培养基不能接触瓶盖；抓住细胞生长旺盛时期相当重要，如羊水为血性羊水或胎质较多须给予不同的处理。,绒毛膜穿刺,绒毛膜穿刺术(CVS）绒毛组织位于胚囊之外且又具有和胚胎同样的遗传性，故早孕期绒毛活检被广泛应用于胎儿遗传性疾病的产前诊断。1983年Simoni首次将其用于产前诊断，至今孕早期绒毛活检已成为国内外早期产前诊断常用的最有效的方法之一。,丛密绒毛膜,平滑绒毛膜,绒毛活检量 不同诊断目的所需的绒毛量不同，染色体分析约需绒毛10mg，DNA分析5mg即可,生化测定仅需35mg。故一次绒毛活检获取20mg左右的绒毛组织可满足任何
9、产前诊断的需要。,优点 1、早期诊断，减轻孕妇及家人的心理压力；2、取材简便易行；3、培养方法及条件成熟，易掌握。,优缺点,缺点1、有2%的绒毛样本由于染色体嵌合，结果不能判断，需进一步行羊膜腔穿刺确定是否有染色体异常；2、并发症多：流产、出血、宫内感染、刺破胎膜、胎儿肢体发育缺陷。,优缺点,绒毛细胞培养与染色体制备方法,直接法（优点：不易污染。缺点：染色体形态不佳，分裂极少而不稳定。）干贴壁法（优点：操作简便。缺点：绒毛要新鲜，相对于消化法其细胞生长稍慢。）消化法（产前诊断和流产绒毛培养常使用本方法。）,接种,漂洗：1、取3个平皿,编号1、2、3号，分别加入10ml PBS(无菌生理盐水也可
10、)，向三个平皿中依次加入终浓度为500U/ml、300U/ml、100U/ml的双抗（氨苄青霉素+硫酸链霉素），轻混匀。2、打开灭菌手术器械，用镊子夹取标本至1号平皿中，再在三个平皿中依次进行漂洗。,分离：用镊子、剪刀等去掉多余血凝块及蜕膜组织，在3号平皿中用眼科剪将组织均匀剪成小块，用镊子夹取一块组织至15ml离心管口，用眼科剪尽量剪碎至大小约1-3mm3。,干贴壁：用镊子夹取一块组织至T25方形瓶口，用眼科剪尽量剪碎至大小约1-3mm3，将剪碎的绒毛枝涂抹铺平至平底贴壁面，平放3-5min后在其背面加入5ml培养基，置温箱中行开放式培养，5小时后或次日早上翻瓶培养。,消化法：用吸管吸取3m
11、l0.25%胰酶+0.02%EDTA沿管壁轻轻注入同时将管口组织冲至管底部，轻摇混匀，放至37 水浴消化，每隔2min摇动一次。消化10-15min后，观察液体如变浑浊、呈粘稠状，立即加3ml培养基终止消化。,细胞培养,一般3-7天在碎绒毛枝周围可见成纤维样细胞生长，细胞致密，形成的细胞集落小而多，根据生长情况决定换液次数（必要时进行原瓶消化）。培养6-20天，待细胞生长旺盛时，收获细胞。绒毛细胞收获与制片同羊水细胞。,注意事项,由于接种时操作步骤较多，严格无菌操作是培养成功的关键；绒毛细胞由于生长致密，大多要进行原瓶消化，使得细胞尽量呈散在均匀生长，有利于细胞同步，收获到的分裂相也较多；低渗之后每一步均应轻吹打，用力过大可能损失掉较多细胞。,
