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1、CRISPR-Cas9系统基因修饰理论与实战,1 基因表达研究方法,干扰基因表达（过表达或低表达），或者表达突变体并检测其相关生理功能，是基因功能研究中最重要的方式之一；基因表达技术-质粒转染，病毒转染等传统方法得到广泛运用，但同时其也存在缺点；,1 基因修饰的方法与各自优势,质粒-瞬时转染-某些细胞效率偏低-表达结果不稳定，有内源表达的干扰；质粒-稳定细胞-表达结果不稳定，筛选效率不高，在重组插入基因组中可能干扰其它基因表达；病毒-瞬时感染-表达结果不稳定，质粒容易在细胞复制过程中丢失，随机插入基因组中可能会干扰其它基因表达；新一代的基因编辑技术-利用重组酶在基因组水平修饰基因，产生的遗传性
2、质稳定，直接作用于内源，减少表达干扰，目前有成熟的技术如CRISPR/Cas9；,DNA,NHEJ and HDR,DNA修复的机制与基因编辑原理,非同源性末端接合修复机制(Non-homologous end joining,NHEJ),同源介导的修复机制(Homology-directed repair,HDR),5,ZFN and TALEN,ZFN与TALEN基因编辑原理,6,Le C,F Ann R,David C,et al.2013,Science,(6121):819-823.,Genome Editing in Mammalian Cells,7,Dumpier nemato
3、des,Zebrafish embryos,Fruit flies,Pennisi E.2013.Science,(6148):833-6.,Rice,Models generated by CRISPR/Cas9 system,Monkey,1 CRISPR-Cas概述,1987年，日本大阪大学（Osaka University）在对一种细菌编码的碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）基因进行研究时，发现在这个基因编码区域的附近存在一小段不同寻常的DNA片段，这些片段是由简单的重复序列组成的，而且在片段的两端还存在一段不太长的特有的序列。2013以后，研究者们在包括scien
4、ce和nature biotechnology等著名杂志上发表多篇文章介绍CRISPR-Cas系统，并且已成功在人类、小鼠、斑马鱼等物种上实现精确的基因修饰。,1 CRISPR-Cas概述,CRISPR-Cas：一种来源是细菌获得性免疫的由RNA指导Cas蛋白对靶向基因进行修饰的技术。,CRISPR-Cas主要由两部分组成：,识别,切割,1 CRISPR-Cas概述,1.1 CRISPR结构,CRISPR：（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）CRISPR 是一个特殊的DNA重复序列家族,广泛分布于细菌和古细菌基因
5、组中。CRISPR 位点通常由短的高度保守的重复序列(repeats)组成,重复序列的长度通常 2148 bp,重复序列之间被 2672 bp 间隔序列(spacer)隔开。CRISPR就是通过这些间隔序列（space）与靶基因进行识别。,1.1 CRISPR结构,1.2 Cas家族,Cas（CRISPR associated）：存在于CRISPR位点附近，是一种双链DNA核酸酶，能在guide RNA引导下对靶位点进行切割。它与folk酶功能类似，但是它并不需要形成二聚体才能发挥作用。,2 CRISPR-Cas系统的发现,CRISPR-Cas是很多细菌和大部分古生菌的天然免疫系统，通过对入侵
6、的病毒和核酸进行特异性的识别，利用Cas蛋白进行切割，从而达到对自身的免疫。,2 CRISPR-Cas系统的发现,2 CRISPR-Cas系统的发现,2 CRISPR-Cas系统的发现,CRISPR-Cas系统赋予原核细胞针对外源DNA特异性免疫,而这种特异性是由间隔序列（spacer）决定的。在宿主防御噬菌体攻击中，针对自然界中庞大的噬菌体种群，细菌进化了CRISPR 介导的适应性免疫。这种免疫功能的发挥是由CRISPR 间隔序列的动态性变化，即通过增加或删除间隔序列（spacer）来实现的。,2 CRISPR-Cas系统靶向要求,最主要的要求：PAM（protospacer-adjacen
7、t motif）为NGG。,2 CRISPR-Cas系统靶向要求,在人类基因组中，平均每8bp就出现一个NGG PAM。,2 CRISPR-Cas系统靶向要求,3 CRISPR-Cas系统介导基因修饰,3.1 dual-RNA：Cas介导编辑模板替换,2013年1月29日在nature biotechnology上发表的RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems一文中，作者利用CRISPR-Cas系统用设计好的DNA模板替换的相应基因来达到基因的定向修饰。,3.1 dual-RNA：Cas介导编辑模板替换,3
8、.2 sg-RNA：Cas介导基因修饰,2013年1月29日在nature biotechnology上发表的efficient genome editing in zebra fish using a CRISPR-Cas system一文中，作者利用人工合成的sgRNAs能指导Cas9内源性核酸酶对斑马鱼胚胎基因进行修饰。,3.2 sg-RNA：Cas介导基因修饰,3.2 sg-RNA：Cas介导基因修饰,3.2 sg-RNA：Cas介导基因修饰,Cas9,sg-RNA,2013年2月15日在science上发表的Multiplex Genome Engineering Using CRI
9、SPR/Cas Systems一文中，作者利用一个包含两个靶向不同基因的spacers的crRNA实现了同时对两个基因进行编辑。,3.3 cr-RNA：Cas介导双基因修饰,3.3 cr-RNA：Cas介导双基因修饰,4 CRISPR-Cas系统前景分析,这是一项靶向基因修饰的革新技术，一项极具有可能获得诺贝尔奖技术。,4 CRISPR-Cas系统前景分析,2013年4月12日在cell stem cell上发表的Enhanced Efficiency of Human Pluripotent Stem Cell Genome Editing through Replacing TALENs
10、with CRISPRs一文中，作者利用TALENs和CRISPRs对同一基因进行修饰，效率分别为0%-34%和51%-79%。,4 CRISPR-Cas系统前景分析,而且从实际应用的角度来说，CRISPRs比TALENs更容易操作，因为每一对TALENs都需要重新合成，而用于CRISPR的gRNA只需要替换20个核苷酸就行。,4 CRISPR-Cas,只需合成一个sgRNA就能实现对基因的特异性修饰，Cas蛋白不具特异性。编码sgRNA的序列不超过100bp，因此比构建TALENs和ZFNs更简单方便。较短的sgRNA序列也避免了超长、高度重复的TALENs编码载体带来的并发症。,技术优势,
11、5 我们的工作利用CRISPR-Cas9载体肿瘤基因M在卵巢癌细胞HeLa的编辑与敲除,流程-a.sgRNA的引物设计（4条）；b.px459-cas9载体构建，HeLa细胞上的转染与基因靶点筛选（1次）；c.母克隆的基因剪切的确定（2-3个母克隆）；d.单克隆筛选（2-3轮，100个子克隆）f.单克隆的鉴定（Q-PCR以及WB检测）；,母克隆8-31-M测序,子克隆8-31-12-d-M测序,5 我们的结果成功获得了M基因敲除的HeLa细胞系，,模板 CCCGGCAGGCTGGACAC-TTCGTGGAGGGCTCCAAAG11-5-1 CCCGGCAGGCTGGACAC-TCGTGGAGG
12、GCTCCAAAG(缺失2个碱基，移码）11-5-2 CCCGGCAGGCTGGACAC-GGAGGGCTCCAAAG(缺失6个碱基，不移码）11-5-3 CCCGGCAGGCTGGACAC-GGAGGGCTCCAAAG(缺失6个碱基，不移码）11-5-5 CCCGGCAGGCTGGACAC-TCGTGGAGGGCTCCAAAG(缺失2个碱基，移码）11-5-4 CCCGGCAGGCTGGACAC-TCGTGGAGGGCTCCAAAG(缺失2个碱基，移码）11-5-6 CCCGGCAGGCTGGACAC-TCGTGGAGGGCTCCAAAG(缺失2个碱基，移码）11-18-1 CCCGGCAG
13、GCTGGACAC-TCGTGGAGGGCTCCAAAG(缺失2个碱基，移码）11-18-2 CCCGGCAGGCTGGACAC-TCGTGGAGGGCTCCAAAG(缺失2个碱基，移码）11-18-4 CCCGGCAGGCTGGACACTTTCGTGGAGGGCTCCAAAG(插入1碱基，移码)11-18-6 CCCGGCAGGCTGGACAC-TCGTGGAGGGCTCCAAAG(缺失2个碱基，移码）11-18-8 CCCGGCAGGCTGGACAC-TCGTGGAGGGCTCCAAAG(缺失2个碱基，移码）11-18-9 CCCGGCAGGCTGGACAC-GGAGGGCTCCAAAG(缺失6个碱基，不移码）11-18-5 CCCGGCAGGCTGGACACTTTCGTGGAGGGCTCCAAAG(插入1碱基，移码)11-18-7 CCCGGCAGGCTGGACACTTTCGTGGAGGGCTCCAAAG(插入1碱基，移码),5 我们的结果验证肿瘤增殖、迁移等功能受到影响；,
