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1、水污染生物学实验,水体富营养化的评价与测定,一.实验目的,1.了解水体富营养化评价方法，并通过对单一因子指标的测定，对模拟水体的富营养化程度进行评价。2.回顾水体单一污染因子测定方法，包括透明度(SD)、总磷(TP)、总氮(TN)和高锰酸盐指数(CODMn)。3.掌握叶绿素Chla 的测定方法，熟悉实验程序，了解各种仪器的工作原理和操作方法。,二.实验材料、设备和试剂,可见分光光度计722型,台式离心机TDL-5-A,电冰箱BCD-196E/B,抽滤器,主要设备,二.实验材料、设备和试剂,其他：抽滤瓶；10ml比色管；醋酸纤维微孔滤膜（0.45m玻璃纤维滤纸）；碳酸镁；90%乙醇（分析纯）。,
2、水体富营养化评价方法,单因子评价方法,综合指数法,物理参数：气温、水温、SD等,化学参数：DO、TN、TP、COD等,生物学参数：Chla、多样性指数、指示生物群落结构的变化、藻类优势种,:TSI、TSIM、TLI,营养状态法（NQI）,溶解氧指数法,营养度指数法（AHP-PCA）,三.实验原理,多指标综合营养状态指数法,1.TLI评价法,TLI评价法是中国环境检测总站推荐的湖泊（水库）富营养化评价方法，该方法考虑影响因素包括Chla、SD、TP、TN和CODMn指数，具体计算公式为：TLI(Chla)=10(2.5+1.086lnChla)（1）TLI(SD)=10(5.118-1.94ln
3、SD)（2）TLI(TP)=10(9.436+1.624lnTP)（3）TLI(TN)=10(5.453+1.694lnTN)（4）TLI(CODMn)=10(0.109+2.661lnCODMn)（5）,1.TLI评价法,其中:TLI(Chla)叶绿素a(mg/m3)指数；TLI(SD)透明度SD(m)指数；TLI(TP)总磷TP(mg/L)指数；TLI(TN)总氮TN(mg/L)指数；TLI(CODMn)高锰酸盐CODMn(mg/L)指数。,评价某水体的富营养化程度，需要对(1)(5)式中各TLI指数进行加权求和，其最终营养状态指数以TLI表示。,三.实验原理,TLI的计算公式为：TLI=
4、WjTLI(j)式中:TLI综合营养状态指数；Wj第j种参数的营养状态指数的相关权重；TLI(j)第 j 种参数的营养状态指数。,m,j=1,三.实验原理,各指标权重,当（TLI）70，为重度富营养。,三.实验原理,2叶绿素a的测定原理,叶绿素a存在于所有植物中，约占有机物干重的 1%2%，是水体初级生产力和估算水体中浮游植物浓度的重要指标，对叶绿素a进行测定，可以了解水体的生产力和富营养化水平。叶绿素不溶于水，但溶于乙醇、丙酮、乙醚等有机溶剂。叶绿素a和b，分别在蓝紫光区和红光区对光谱有两个吸收峰。因此，可以应用有机溶剂提取叶绿素，在特定波长下进行比色测定。,三.实验原理,叶绿素测定方法,分
5、光光度法,荧光高效液相色谱法,基本原理：以有机溶剂直接提取浮游生物浓缩样中的叶绿素，测定其吸光度，根据叶绿素 a 在特定波长的吸收，用公式计算其含量。目前大多采用Lorenzen 提出的单色分光光度法，此法只测定叶绿素 a，并对脱镁叶绿素a的干扰进行了校正。,仪器昂贵，操作复杂，难作为常规的监测方法,三.实验原理,单色法测定叶绿素a 根据萃取溶剂不同，分为丙酮法和乙醇法。丙酮法于1941 年由 Mackinney 首先提出，自1949年经 Arnon 解释和推导以来在国际上广泛应用，我国也长期使用此法，并有相应的国家规范方法。相对于丙酮法而言，乙醇法测定叶绿素 a 含量具有操作简便、快捷、低毒
6、害和萃取效率高等优点，国际上已经逐渐改用乙醇法，本实验也将采用乙醇法提取叶绿素a。,三.实验原理,3.其他污染因子测定原理,本实验中其他因子测定包括透明度 SD、总磷 TP、总氮 TN和高锰酸盐指数 CODMn，具体实验方法及仪器设备等参考国家环境保护总局水和废水监测分析方法（第四版）。,三.实验原理,四.实验步骤,水样采集与保存,测定吸光度值,抽滤,离心、上清液定容,不干燥研磨、提取,四.实验步骤,水样采集后放在阴凉处，避免日光直射，最好立即进行测定的预处理。如需经过一段时间(448h)才能进行预处理，则应将水样保存在低温避光处，在每升水样中加入1ml 1%的碳酸镁悬浊液，以防止酸化引起色素
7、溶解。,四.实验步骤,在抽滤器上装好0.45m醋酸纤维滤膜，倒入定量体积的水样进行抽滤，抽滤时负压不能过大(约50kPa)。水样抽完后，继续抽12min，以减少滤膜上的水分。,抽滤完毕后，将带有浮游植物的滤膜直接放入 10ml 比色管中(即不干燥研磨)，加入少量的碳酸镁粉末，再加入 90%乙醇 10ml，在常温暗室中提取68h；,四.实验步骤,取出，充分摇匀比色管内含物，用3500r/min 离心10min，上清液再转入比色管中，用 90%的乙醇定容至 10ml；,四.实验步骤,用分光度度计在750nm、663nm、645nm、630nm 波长处，分别测定其吸光度值，并以90%的乙醇作空白吸光
8、度测定。,四.实验步骤,叶绿素a的含量计算,叶绿素(mg/m3)=11.64(D663-D750)-2.16(D645-D750)+0.10(D630-D750)V1/(V)式中：V水样体积(L)；D吸光度；V1提取液定容后的体积(ml)；比色皿光程(cm)。,四.实验步骤,五.实验结果记录及整理,主要水质参数测定结果记录,六.评价结果及讨论,根据实验测定结果和表格整理数据，对模拟水体富营养化水平进行评价，并对水体外观进行描述。,水质 总氮的测定,-碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法,一、主题内容与适用范围,1.1 主题内容 本标准规定了用碱性过硫酸钾在120124消解、紫外分光光度测定水中总氮的
9、方法。1.2 适用范围 本标准适用于地面水、地下水的测定。本法可测定水中亚硝酸盐氮、硝酸盐氨、无机铵盐、溶解态氨及大部分有机含氮化合物中氮的总和。氮的最低检出浓度为0.050mgL，测定上限为4mgL。本方法的摩尔吸光系数为1.47103Lmo11cm1。测定中干扰物主要是碘离子与溴离子，碘离子相对于总氮含量的2.2倍以上，溴离子相对于总氮含量的3.4倍以上有干扰。某些有机物在本法规定的测定条件下不能完全转化为硝酸盐时对测定有影响。,二、定义,2.1 可滤性总氮：指水中可溶性及含可滤性固体(小于0.45?m颗粒物)的含氮量。2.2 总氮：指可溶性及悬浮颗粒中的含氮量。,三、原理,在60以上水溶
10、液中，过硫酸钾可分解产生硫酸氢钾和原子态氧，硫酸氢钾在溶液中离解而产生氢离子，故在氢氧化钠的碱性介质中可促使分解过程趋于完全。分解出的原子态氧在120124条件下，可使水样中含氯化合物的氮元素转化为硝酸盐。并且在此过程中有机物同时被氧化分解。可用紫外分光光度法于波长220和275nm处，分别测出吸光度A220及A275按式(1)求出校正吸光度A：AA2202A275(1)按A的值查校准曲线并计算总氮(以NO3N计)含量。,四、试剂和材料,除非(4.1)另有说明外，分析时均使用符合国家标准或专业标准的分析纯试剂。4.1 水，无氨。按下述方法之一制备；4.1.1 离子交换法：将蒸馏水通过一个强酸型
11、阳离子交换树脂(氢型)柱，流出液收集在带有密封玻璃盖的玻璃瓶中。4.1.2 蒸馏法：在1000mL蒸馏水中，加入0.10mL硫酸(p=1.84gmL)。并在全玻璃蒸馏器中重蒸馏，弃去前50mL馏出液，然后将馏出液收集在带有玻璃塞的玻璃瓶中。4.2 氢氧化钠溶液，200gL：称取20m氢氧化钠(NaOH)，溶于水(3.1)中，稀释至100mL。4.3 氢氧化钠溶液，20gL：将(4.2)溶液稀释10倍而得。4.4 碱性过硫酸钾溶液：称取40g过硫酸钾(K2S2OB)，另称取15g氢氧化钠(NaOH)，溶于水(4.1)中，稀释至1000mL，溶液存放在聚乙烯瓶内，最长可贮存一周。4.5 盐酸溶液，
12、19。,试剂和材料,4.6 硝酸钾标准溶液 4.6.1 硝酸钾标准贮备液，CN100mgL：硝酸钾(KNO3)在105110烘箱中干燥3h，在干燥器中冷却后，称取0.7218g，溶于水(4.1)中，移至1000mL容量瓶中，用水(4.1)稀释至标线在010暗处保存，或加入12mL三氯甲烷保存，可稳定6个月。4.6.2 硝酸钾标准使用液，CN10mgL：将贮备液用水(4.1)稀释10倍而得。使用时配制。4.7 硫酸溶液，135。,五、仪器和设备,5.1 常用实验室仪器和下列仪器。5.2 紫外分光光度计及10mm石英比色皿。5.3微波消解炉5.4 25mL比色管所用玻璃器皿可以用盐酸(19)或硫酸
13、(135)浸泡，清洗后再用水(4.1)冲洗数次。,六、样品,6.1 采样 在水样采集后立即放入冰箱中或低于4的条件本保存，但不得超过24h。水作放置时间较长时，可在1000mL水样中加入约0.5mL硫酸(p1.84gmL)，酸化到pH小于2，并尽快测定。样品可贮存在玻璃瓶中。6.2 试样的制备 取实验室样品(6.1)用氢氧化钠溶液(4.3)或硫酸溶液(4.7)调节pH至59从而制得试样。如果试样中不含悬浮物按(7.1.2)步骤测定，试样中含悬浮物则按(7.1.3)步骤测定。,七、分析步骤,7.1 测定7.1.1 取10.00mL试样(含氮量超过4mg/L时，可减少取作量并加水(4.1)稀释至1
14、0mL)置于消解罐中，加入5mL碱性过硫酸钾溶液。7.1.2 试样不含悬浮物时，按下述步骤进行。a.旋紧密封盖依次将消解罐均匀的放入微波炉玻璃转盘周边，关好炉门。进行消解。消解时间为（n+4）分+n*20秒，取出放冷。将液体转移至25mL比色管内，加10%盐酸1mL然后用水稀释至标线。,分析步骤,e.移取部分溶液至10mm，石英比色皿中，在紫外分光光度计上，以无氨水作参比，分别在波长为220与275nm处测定吸光度，并用式(1)计算出校正吸光度A。7.1.3 试样含悬浮物时，先按上述7.1.2中a至d步骤进行，然后待澄清后移取上清液到石英比色皿中。再按上述7.1.2中e步骤继续进行测定。7.2
15、 空白试验 空白试验除以10mL水(4.1)代替试料外，采用与测定完全相同的试剂、用量和分析步骤进行平行操作。注：当测定在接近检测限时，必须控制空白试验的吸光度Ab不超过0.03，超过此值，要检查所用水、试剂、器皿.,分析步骤,7.3 标准曲线的绘制7.3.1 校准系列的制备：a.用分度吸管向一组(10支)比色管(5.4)中，分别加入硝酸盐氮标准使用溶液(4.6.2)0.0，0.10，0.50，1.00，2.50，5.00，10.00mL。加水(4.1)稀释至10.00mL。b.按7.1.2中a至e步骤进行测定。,分析步骤,7.3.2 校准曲线的绘制：零浓度(空白)溶液和其他硝酸钾标准使用溶液
16、(4.6.2)制得的校准系列完成全部分析步骤，于波长220和275nm处测定吸光度后，分别按下式求出除零浓度外其他校准系列的校正吸光度As和零浓度的校正吸光度Ab及其差值Ar AsAs220-2As275(2)AbAb2202Ab275(3)ArAsAb(4)式中：AS220标准溶液在220nm波长的吸光度；AS275标准溶液在275nm波长的吸光度；Ab220零浓度(空白)溶液在220nm波长的吸光度；Ab275零浓度(空白)溶液在275nm波长的吸光度。按Ar值与相应的NO3-N含量(微克)绘制校准曲线。,八、结果表示,计算方法 按式(1)计算得试样校正吸光度Ar，在校准曲线上查出相应的总
17、氮?g数，总氮含量(mgL)按下式计算：CN=m/v-（5）式中：m试样测出含氮量，微克；V测定用试样体积，mL。,九、精密度与准确度(参考）,9.1 重复性 21个实验室分别测定了亚硝酸钠，氨基丙酸与氯化铵混合样品；CW604氨氮标准样品；L谷氨酸与葡萄糖混合作品。上述三种作品含氮量分别为1.49，2.64和1.15mgL，其分析结果如下：各实验室的室内相对标准偏差分别为2.3，1.6和2.5。室内重复测定允许精密度分别为0.074，0.092和0.063mgL。9.2 再现性 上述实验室对上述三种统一合成样品测定。实验室间相对标准偏差分别为3.1，1.1和4.2；再现性相对标准偏差分别为4
18、.0，1.9和4.8；总相对标准偏差分别为3.8，1.9和4.9。9.3 准确度 上述实验室对上述三种统一合成样品测定，实验室内均值相对误差分别为6.3，2.4和8.7。室内单内相对误差分别为7.5，3.8和9.8。实验室平均回收率置信范围分别为99.06.4，99.05.1和1019.4。,水质 总磷的测定,-钼酸铵分光光度法,一、主题内容与适用范围,1、本标准规定了用过硫酸钾（或硝酸高氯酸）为氧化剂，将未经过滤的水样消解，用钼酸铵分光光度测定总磷的方法。2、总磷包括溶解的、颗粒的、有机的和无机磷。3、本标准适用于地面水、污水和工业废水。4、取25mL试料，本标准的最低检出浓度为0.01mg
19、L，测定上限为0.6mgL。5、在酸性条件下，砷、铬、硫干扰测定。,二、实验原理,在中性条件下用过硫酸钾（或硝酸高氯酸）使试样消解，将所含磷全部氧化为正磷酸盐。在酸性介质中，正磷酸盐与钼酸铵反应，在锑盐存在下生成磷钼杂多酸后，立即被抗坏血酸还原，生成蓝色的络合物。,三，实验试剂,3.1 硫酸(H2SO4)，1+13.2过硫酸钾，50gL溶液：将5g过硫酸钾(K2S2O8)溶解干水，并稀释至100mL。3.3 抗坏血酸，100gL溶液：溶解10g抗坏血酸(C6H8O6)于水中，并稀释至100mL。此溶液贮于棕色的试剂瓶中，在冷处可稳定几周。如不变色可长时间使用。,实验试剂,3.4 钼酸盐溶液：溶
20、解13g钼酸铵(NH4)6Mo7O24 1 H2O于100mL水中。在不断搅拌下把钼酸铵溶液徐徐加到300mL硫酸(3.4)中，加酒石酸锑钾溶液并且混合均匀。此溶液贮存于棕色试剂瓶中，在冷处可保存二个月。3.5 浊度一色度补偿液：混合两个体积硫酸(3.4)和一个体积抗坏血酸溶液(3.3)。使用当天配制,实验试剂,3.6 磷标准贮备溶液：称取0.21970.001g于110干燥2h在干燥器中放冷的磷酸二氢钾(KH2PO4)，用水溶解后转移至1000mL容量瓶中，加入大约800mL水、加5mL硫酸(3.4)用水稀释至标线并混匀。1.00mL此标准溶液含50.0?g磷。本溶液在玻璃瓶中可贮存至少六个
21、月。3.7 磷标准使用溶液：将10.0mL的磷标准溶液(3.12)转移至250mL容量瓶中，用水稀释至标线并混匀。1.00mL此标准溶液含2.0?g磷。使用当天配制。,四、实验仪器,实验室常用仪器设备和下列仪器：4.1 微波消解炉一台，附有若干聚四氟二烯消解罐4.2 50mL比色管。（50mL具塞(磨口)刻度管也可。）4.3 分光光度计。注：所有玻璃器皿均应用稀盐酸或稀硝酸浸泡。,五、采样和样品,5.1 采样采取500mL水样后加入1mL硫酸(3.1)调节样品的pH值，使之低于或等于1，或不加任何试剂于冷处保存。注：含磷量较少的水样，不要用塑料瓶采样，因易磷酸盐吸附在塑料瓶壁上。5.2 试样的
22、制备：取25mL样品(5.1)于比色管中(4.2)。取时应仔细摇匀，以得到溶解部分和悬浮部分均具有代表性的试样。如样品中含磷浓度较高，试样体积可以减少。,六、分析步骤,6.1 空白试样 按(6.2)的规定进行空白试验，用水代替试样，并加入与测定时相同体积的试剂。6.2 测定：6.2.1 消解 6.2.1.1 过硫酸钾消解：吸取25mL水样于消解罐中（如样品中含磷浓度超过0.6mg/L时可少取水样或稀释后在取样）。加4mL过硫酸钾。旋紧密封盖依次将消解罐均匀的放入微波炉玻璃转盘周边，关好炉门。进行消解。消解时间为（n+4）分+n*20秒，取出放冷。将液体转移至50mL比色管内，然后用水稀释至标线
23、。注：如用硫酸保存水样。当用过硫酸钾消解时，需先将试样调至中性。,分析步骤,6.2.2 发色：分别向各份消解液中加入1mL抗坏血酸溶液(3.3)混匀，30s后加2mL钼酸盐溶液(3.4)充分混匀。注：如试样中含有浊度或色度时，需配制一个空白试样(消解后用水稀释至标线)然后向试料中加入3mL浊度色度补偿液(3.5)，但不加抗坏血酸溶液和钼酸盐溶液。然后从试料的吸光度中扣除空白试料的吸光度。砷大于2mgL干扰测定，用硫代硫酸钠去除。硫化物大于2mgL干扰测定，通氮气去除。铬大于50mgL干扰测定，用亚硫酸钠去除。,分析步骤,6.2.3 分光光度测量：室温下放置15min后，使用光程为30mm比色皿
24、，700nm波长下，以浓度空白溶液作参比，测出吸光度,从工作曲线(6.2.4)上查得磷的含量。(以水做参比，测定吸光度。扣除空白试验的吸光度后，从工作曲线(6.2.4)上查得磷的含量)。注：如显色时室温低于13，可在2030水花上显色15min即可。6.2.4 工作曲线的绘制取7支具塞刻度管(4.2)分别加入0.0，0.50，1.00，3.00，5.00，10.0，15.0mL磷酸盐标准溶液(3.7)。加水至50mL。然后按测定步骤(6.2)进行处理。以水做参比，测定吸光度。扣除空白试验的吸光度后，和对应的磷的含量绘制工作曲线。,七、结果的表示,总磷含量以c(mg/L）表示，按下式计算：C=m
25、/v式中：m 试样测得含磷量，g；v 测定用试样体积,mL。,精密度与准确度（参考）,8.2 六个实验室测定(采用6.2.1.2消解)含磷量2.06mgL的统一样品。8.2.1 重复性 实验室内相对标准偏差为1.4。8.2.2 再现性 实验室间相对标准偏差为1.4。8.2.3 准确度 相对误差为1.9。质控样品主要成分是乙氨酸(NH2CH2COOH)和甘油磷酸钠,八、精密度与准确度（参考）,8.1 十三个实验室测定(采用6.2.1.1消解)含磷2.06mgL的统一样品8.1.1 重复性 实验室内相对标准偏差为0.75。8.1.2 再现性 实验室间相对标准偏差为1.5。8.1.3 准确度 相对误差为1.9。,
