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1、生物制药 之 胰岛素,主要内容,1、胰岛素简介2、胰岛素的功能作用3、利用大肠杆菌生产重组人胰岛素4、新型固液分离技术在重组人胰岛素生产中的应用,1.1、胰岛素（insulin）,定义：由胰岛细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的一种蛋白质激素。胰岛素是机体内唯一降低血糖的激素，同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成。,1.2、胰岛素的发现,1921年-从动物胰腺中提取出胰岛素，开创了人类胰岛素治疗的历史。1926年-重结晶胰岛素1930s-传统中、长效动物胰岛素1970s-单峰胰岛素和 单组分胰岛素 70年代末-半合成胰岛素1982年-采用基因重组技术生产的
2、人胰岛素正式上市。90年代至今-重组人胰岛素类似物成功研发上市，包括超短效和长效人胰岛素类似物。,1.3、胰岛素结构组成,胰岛素由A、B两个肽链组成。人胰岛素A链有11种21个氨基酸，B链有15种30个氨基酸，共26种51个氨基酸组成。其中A7(Cys)-B7(Cys)、A20(Cys)-B19(Cys)四个半胱氨酸中的巯基形成两个二硫键，使A、B两链连接起来。此外A链中A6(Cys)与A11(Cys)之间也存在一个二硫键,人胰岛素的一级结构,猪胰岛素的一级结构,1.4、胰岛素的空间构型,胰岛素二聚体（dimer）,胰岛素六聚体（hexamer）,2、胰岛素的功能作用,主要功能：2.1、调节糖
3、代谢；2.2、调节脂肪代谢；2.3、调节蛋白质代谢；2.4、其它功能 2.5、体内对抗胰岛素的激素,2.1、调节糖代谢,胰岛素能促进全身组织细胞对葡萄糖的摄取和利用，并抑制糖原的分解和糖原异生，因此，胰岛素有降低血糖的作用。,胰岛素降血糖是多方面作用的结果,（1）促进肌肉、脂肪组织等处的靶细胞细胞膜载体将血液中的葡萄糖转运入细胞。（2）通过共价修饰增强磷酸二酯酶活性、降低cAMP水平、升高cGMP浓度，从而使糖原合成酶活性增加、磷酸化酶活性降低，加速糖原合成、抑制糖原分解。（3）通过激活丙酮酸脱氢酶磷酸酶而使丙酮酸脱氢酶激活，加速丙酮酸氧化为乙酰辅酶A，加快糖的有氧氧化。（4）通过抑制PEP羧
4、激酶的合成以及减少糖异生的原料，抑制糖异生。（5）抑制脂肪组织内的激素敏感性脂肪酶，减缓脂肪动员，使组织利用葡萄糖增加。,2.2、调节脂肪代谢,胰岛素能促进脂肪的合成与贮存，使血中游离脂肪酸减少，同时抑制脂肪的分解氧化。胰岛素缺乏可造成脂肪代谢紊乱，脂肪贮存减少，分解加强，血脂升高，久之可引起动脉硬化，进而导致心脑血管的严重疾患；与此同时，由于脂肪分解加强，生成大量酮体，出现酮症酸中毒。,2.3、调节蛋白质代谢,胰岛素一方面促进细胞对氨基酸的摄取和蛋白质的合成，一方面抑制蛋白质的分解，因而有利于生长。腺垂体生长激素的促蛋白质合成作用，必须有胰岛素的存 在才能表现出来。因此，对于生长来说，胰岛素
5、 也是不可缺少的激素之 一。,2.4、其它功能,胰岛素可促进钾离子和镁离子穿过细胞膜进入细胞内；可促进脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)及三磷酸腺苷(ATP)的合成。,2.5、体内对抗胰岛素的激素,体内对抗胰岛素的激素主要有胰升糖素、肾上腺素及去甲肾上腺素、肾上腺皮质激素、生长激素等。它们都能使血糖升高。,胰岛素与胰高血糖素的拮抗作用,3、利用大肠杆菌生产重组人胰岛素,提取步骤：3.1、提取目的基因 3.2、提取质粒 3.3、基因重组 3.4、将质粒送回大肠杆菌 3.5、胰岛素的产生,3.1、提取目的基因,既从人的DNA中提取胰岛素基因,可使用限制性内切酶将目的基因从原DNA中分离。1
6、.鸟枪法：用一大堆限制性核酸内切酶对附近基因进行剪切，再提取所需要的。至于如何筛选，可用DNA分子杂交，即DNA探针。2.人工合成法：根据转录蛋白或者mRNA推导出基因序列，然后人工合成，没有内含子。3.从基因文库中提取：也就是事先已经提取完毕的拿来用。4.PCR扩增技术：用于大量生产该段基因片段，用于商业化运作。,3.2、提取质粒,从大肠杆菌的细胞质中提取质粒,质粒为环状。此质粒将作为胰岛素基因的载体。提取方法：1.碱裂解法：在pH12.012.5这个狭窄的范围内，线性DNA双螺旋结构解开而被变性。闭合环状的质粒DNA，在变性后不会分离，复性快。2.煮沸法：将细菌悬浮于含Triton X-1
7、00和能消化细胞壁的溶菌酶缓冲液中，然后加热到100使其裂解。3.小量一步提取法：由于细菌染色体DNA比质粒大得多,受机械力后细菌染色体DNA会被震断成不同大小的线性片段而缠绕附着在细胞碎片上，并发生变性。同样受机械力质粒DNA会变性，机械力后复性。但质粒DNA的复性要快于细菌染色体DNA。,3.3、基因重组,取出目的基因与质粒,先利用同种限制性内切酶 将质粒切开,再使用DNA连接酶将目的基因与质 粒“缝合”,形成一个能表达出胰岛素的DNA质粒。,3.4、将质粒送回大肠杆菌,在大肠杆菌的培养液中加入含有Ca+的物质,如CaCl2,这使细胞会吸收外源基因.此时将重组的质粒也放入培养液中,大肠杆菌
8、便会将重组质粒吸收.将大肠杆菌用氯化钙处理，以增大大肠杆菌细胞壁的通透性，使含有目的基因的重组质粒能够进入受体细胞，此时的细胞处于感受态（理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态）。,3.5、胰岛素的产生,在大肠杆菌内,质粒通过表达转录与翻译后,便产生出胰岛素蛋白质.通过大肠杆菌的大量繁衍,便可大量生产出胰岛素!注意：大肠杆菌产出的是多肽链，因为原核生物没有内质网、高尔基体等，不能进行多肽的折叠、修饰等，还需人为进行菌体外加工。,基本 流程图,4、新型固液分离技术在重组人胰岛素生产中的应用,4.1、固液分离技术 4.2、菌体收集 4.3、晶体收集 4.4、前景展望,4.1、
9、新型固液分离技术又称：中空纤维膜过滤技术,近 二 十 年 来，中 空 纤 维 膜 过 滤 技 术 在 生 物 技 术 诸 多应 用 领 域 得 到 深 入 研 究，其 优 良 的 物 理 化 学 耐 受 性(Compatibility)、可 放 大 性(Scalability)和 工 艺 耐 用 性(Robustness)已得到国际生物制药行业广泛认可，有利于提高工艺放大成功率，改进生产效率，显著降低生产成本。,应用实例,中空纤维膜过滤技术属于现代生物分离技术，无筛网的管状流道有效避免循环湍流，提供温和剪切力的过滤方式，有利于保护蛋白活性和完整性；同时开放式的膜管结构具有更高的容尘量，可以直接
10、处理高固含量的复杂料液，常用于不同规模高密度发酵液的预处理和固液分离。如：高密度 CHO 细胞培养液澄清生产单克隆抗体；发酵液细胞或菌体收集；包涵体蛋白收集/洗涤；病毒类大分子温和浓缩和洗滤 等。,4.2、菌体收集,相比传统离心操作，中空纤维膜过滤技术具有处理速度快、寿命长、设备日常维护简单、可直接线性放大等特点，可以更好的满足重组胰岛素药物生产过程中数十吨级规模发酵液菌体收集对生产工艺重复性、工艺可放大性和经济性的要求。对于固含量较高的粘稠料液，推荐选择0.75mm(D 柱)或1mm(E 柱)纤维内径的滤膜。此工艺集成菌体收集和洗涤步骤，可以避免多次反复离心等繁冗操作，最终得到65%固含量(
11、650g 湿菌体/L)的菌体悬液，可直接用于接下来的细胞破碎步骤。目前，此工艺已经成功线性放大到 1000L 以上的发酵规模。,4.3、晶体收集,传统晶体收集方法是多步层析精细纯化得到的胰岛素在冷冻干燥之前，常采用多次结晶和洗涤工艺进一步去除杂质、提高产品纯度。,显微镜下的胰岛素结晶体,采用中空纤维成功将重组胰岛素晶体悬液进行高速浓缩收集以显著减小体积，封闭的系统有利于保护产品不受外源因子污染，中空纤维 0.45m 微滤膜 表现出众。高透过通量使得相对较小的膜面积和切向流系统处理较大体积料液成为可能，较小的系统将系统死体积降到最低，有利于进一步提高产品回收率。,4.4、前景展望,尽管我国已成功建立超过 30 吨发酵体积的大规模重组人胰岛素药物生产线，但由于重组胰岛素生产技术路线复杂、工艺和质量要求较高，国内外主要市场目前仍为几大跨国公司占据。为了增强国产自主胰岛素药物竞争力，需要采用新型现代生物工艺加工技术和过程控制/分析工具，如高密度发酵和过程控制、新型膜过滤和工业层析技术、生物分子微量热制剂技术等，以进一步改进生产效率和工艺控制水平、提高产品质量、降低生产成本，从而实现成功高效的工艺生产放大，加速重组人胰岛素药物的现代产业化进程。,
