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1、生物技术制药,第一章 现代生物技术,一、现代生物技术的定义与主要内容,生物技术(Biotechnology or Bioengineering）:对生物有机体（微生物至高等动、植物）或其组成部分（器官、组织、细胞或细胞器等），运用分子生物学、细胞生物学、生物化学、生物物理学、生物信息学等手段，研究、设计、改造，以改良生物乃至创造新的生物品种的一种技术体系。,现代生物技术包括四个方面：,（1）基因工程：生物遗传物质核酸的分离、提取、体外剪切、拼接重组以及扩增与表达等技术。,（2）细胞工程：细胞（也包括器官或组织）的离体培养、繁殖、再生、融合及细胞核、细胞质及染色体与细胞器（如线粒体、叶绿体等）的
2、移植与改建等操作技术。,（3）酶工程：利用酶，借助固定化、生物反应器和生物传感器等新技术、新装置，高效优质地生产特定产品的技术。,（4）发酵工程（微生物工程）：给微生物提供最适宜的发酵条件以生产特定产品的技术。,生物技术的依据和出发点：生物有机体的种种机能，是生物在生长、发育与繁殖过程中进行物质合成、降解和转化的能力（即利用其新陈代谢的能力），反应器、代谢反应、酶、特定的遗传基因,核心基础：基因工程和细胞工程“工程菌株”或“工程细胞株”使酶工程或发酵工程生产出更多、更好的产品，发挥出更大的经济效益。,酶工程和发酵工程 现代生物技术产业化，特别是发展大规模生产的最关键环节。,二、现代生物技术的优
3、越性,（一）不可取代性植物品种改良 杂交育种基因工程改良品种基因资源的来源可不受限制 牛(猪)生长激素基因鱼 生长、发育快，体重速增 人血红蛋白基因猪体内 生产人的血红蛋白，分离，可作为人血液的替代物。,生长激素释放抑制因子（抑制生长激素不合时宜的分泌，“肢端肥大症”的特效药）50万个羊脑 5mg样品，化学法 300多美元/5mg 基因工程 7.5升大肠杆菌发酵 5mg,成本几十美分。,（二）快速、精确 试剂盒 有效的早期诊断（遗传病、病毒引起的 疾病和癌症等）。,McAb检查妇女妊娠 比用抗血清法检查提高了灵敏度，怀孕后8天得知，准确率100,（三）低耗、高效“酶”催化化学效应，无需高温、高
4、压和强酸碱等大大降低能耗的成本、能耗。例：L-苹果酸生产（生物技术）产氨短杆菌 收集菌体固定化细胞 L-苹果酸原理：延胡索酸 L-苹果酸成本比化学合成降低几十倍。,人生长激素（治疗侏儒病）一个患者每年需用量 50个死人的垂体中提取基因工程生产 价格为14提取，不需依赖死人脑。,（四）副产物少、不良反应小、安全性好 疫苗的生产 常规方法 用血液，成本高，可带来病毒感染的危险性。现代生物技术 用大肠杆菌 如乙肝疫苗，凝血因子等大大改进使用的安全性。,2.“生物导弹”McAb接抗癌药物体内McAb只与该肿瘤细胞特异性结合抗癌药物专一、靶向到肿瘤细胞 小鼠的免疫球蛋白 McAb免疫球蛋白分子中含有人免
5、疫球蛋白分子片段,三、现代生物技术在医药领域的应用,（）在疾病诊断与治疗中的应用,1.单克隆抗体与疾病诊断 妊娠试验 FDA批准上市的McAb产品 已有几十种。,3.基因诊断 核酸分子杂交技术 80年代中期 聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）体外扩增基因的方法产前和症状前基因诊断:苯丙酮尿症、珠蛋白合成障碍性贫血、假肥大型肌营养不良、甲型血友病、乙型血友病、成年型多囊肾、慢性进行性舞蹈病等遗传病,4.基因治疗 因单一结构基因即编码蛋白质的基因缺陷所引起的遗传病。治疗:导入正常基因校正缺陷基因引起的DNA代谢异常及细胞突变使之恢复正常功能。,（二）未来医药
6、卫生领域中的生物技术展望转基因动物生产的“转基因药物”1978年 把人tPA基因转入小鼠受精卵发育成转基因小鼠并证明在其乳汁中能得到tPA 美国DNx公司的“制药工厂”转基因猪 环球基因药物公司 转基因奶牛 基因酶公司 转基因山羊 英国药物蛋白公司 转基因绵羊“转基因药物”与基因工程药物相比,产量高，成本低,具有与人体自身产生的蛋白相同的生物学活性。乳腺细胞能进行一系列的翻译后修饰作用，包括糖基化作用等，正确地产生人体蛋白。,2.人型McAb(monoclonal antibody)的制备 技术路线：鼠型McAb分子中更换一段人抗体分子中与抗原结合的链段（用蛋白质工程的方法）；从人鼠杂交瘤细胞
7、中直接克隆人抗体基因，并使之在细菌中得到表达；将人免疫球蛋白重链C区基因转入小鼠受精卵，发育成转基因小鼠，用特定抗原免疫得人型化McAb。,3.基因治疗“基因打靶”技术 将外源基因定点整合到细胞基因组的某一确定位点上，因而能对缺陷基因进行原位修复。,聚合酶链反应及其他不断涌现的分子生物学新技术 将得到广泛应用。,在细菌、酵母菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞等不同的细胞内能得到高效表达的载体 将不断地构建成功，大幅提高基因工程的生产效率。,生物技术后处理工程和蛋白质工程 将迅速发展有目的地修饰、改造乃至重新组建,4.生物技术的各个环节,第一节 生物药物(biopharmaceutics)一、概念 利用
8、生物体及其成分综合利用生物学、生物化学、微生物学、生物组织免疫学、物理化学、药学原理、方法加工制造的 预防 诊断疾病的制品 治疗,第二章 生物药物与生物技术药物概述,（一）按来源和制造方法1.动物来源 动物脏器 资源丰富 家畜：猪、马、牛、羊 家禽：鸡、鸭 海洋生物：海带、鲨鱼、海蛇,二、分类,2.微生物来源发酵法优点：1）微生物及其代谢物资源丰富、开发潜力大2）培养、繁殖快、产量高、成本低，便于大规模工业生产，不受原料、运输、保存、季节和资源供应影响3）生产的生物药物可综合利用 代谢物和菌丝体;诱变选育良种;加入前体培养法4）体内酶的转化作用，使复杂、难反应能专一、迅速,4.化学合成 氨基酸
9、、多肽、核酸降解物及其衍生物、维生素、激素 结构改造以高效，长效和高专一性,3.植物来源 植物中的蛋白质、多糖、脂类、核酸等 生物大分子的研究和利用,5.现代生物技术产品基因工程技术生产的重组活性多肽 活性蛋白质类 基因工程疫苗 McAb 多种细胞生长因子利用转基因动、植物生产的生物药物 利用蛋白质工程技术改造天然蛋白质创造自然界没有的而功能上更优良的蛋白质类生物药物,生物技术药物（基因工程药物，Biotech Drugs）:以DNA重组技术（包括基因工程技术、蛋白质工程技术）生产的蛋白质、多肽、酶、激素、疫苗、单克隆抗体和细胞生长因子类药物。,细胞因子干扰素类：IFN-、IFN-和IFN-。
10、IFN-有 lb，2a，2b等2.细胞因子白介素类和肿瘤坏死因子类：IL-2和突变型白介素-2；TNF-和TNF受体。,二、生物技术药物的主要类型,第二节 生物技术药物,一、概念,3.造血系统生长因子类：粒细胞集落刺激因子（G-CSF）、巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）、巨噬细胞粒细胞集落刺激因子（GM-CSF）、红细胞生成素（EPO）、促血小板生成素（TPO)、干细胞生长因子（SCF）等。,4.生长因子类：促进细胞生长、组织再生和创伤治疗。胰岛素样生长因子（ICF）、表皮生长因子（ECF）、血小板衍生生长因子（PDGF）、转化生长因子（TGF-与TGF-）、神经生长因子（NGF）及各种神经
11、营养因子。,5.重组蛋白质与多肽类激素：人重组胰岛素（Humulin）、人生长激素（rhGH）、促卵泡激素（FSH）、促黄体生成素（LH）、绒毛膜促性腺激素（HCG）等。,6.心血管病治疗剂与酶制剂：心血管疾病和抗肿瘤治疗因子、水蛭素、组织纤溶酶原激活剂（tPA）、尿激酶、链激酶、葡激酶、门冬酰胺酶、超氧化物歧化酶（SOD）、葡萄糖脑苷酶及DNase等。,7.重组疫苗与单抗制品：重组乙肝表面抗原疫苗（酵母）、乙肝基因疫苗（重组乙肝表面抗原疫苗、CHO细胞）、艾滋病疫苗和肿瘤疫苗等。己开发的McAb有72种，多用于治疗难治性疾病如预防移植物急性排斥、免疫性疾病和肿瘤等。,8.基因药物：应用于基因
12、治疗目的的DNA片段重组药物。基因治疗:将外源基因导入机体以达到治疗疾病目的。遗传性疾病、肿瘤、艾滋病、囊性纤维变性、糖尿病和心血管病等。,我国已批准上市品：IFN-1b（自研），IFN-2a，IFN-2b，IFN-，IL-2，IL-2125Ser，G-CSF，GM-CSF，SK，EPO，EGF，ECF衍生物，b-ECF，胰岛素，GH，TPO，TNF衍生物，抗IL-8单抗乳膏剂，胸苷激酶基因工程细胞制剂，乙肝疫苗，痢疾疫苗等。,细胞:生物有机体形态结构和生命活动的基本单位。,第三章 细胞工程技术概念,细胞工程：以细胞作为研究对象，运用细胞生物学、分子生物学等学科的原理与方法，按照人们的意志设计
13、改造细胞的某些遗传性状，培育出新的生物改良品种或通过细胞培养获得自然界中难以获得的珍贵产品的新兴生物技术,细胞培养、细胞融合、细胞重组和遗传物质转移等,第一节 细胞培养技术,细胞培养：生物体内某一块组织，用酶消化法分散成单个细胞，接种至特定的培养容器中并给予必要的生长条件，使其在体外生长繁殖的技术。,细胞生长所需的培养条件：1.足够的营养，糖、氨基酸、维生素、无机盐等；2.生长环境，合适的温度、pH值、无菌条件。,动物细胞的培养：先在无菌条件下用消化酶将组织分散成单个细胞，用培养基制成细胞悬液，使其在体外合适的条件下生长繁殖的技术。,一、动物细胞培养,细胞培养的对象 单个的细胞，组织培养的对象
14、 组织块（0.51mm），器官培养的对象 器官的一部分或整个器官。,动物细胞分类：,（）动物细胞培养特征,贴壁依赖性细胞 贴壁 大多数动物细胞,非贴壁依赖性细胞 悬浮 血液淋巴细胞、肿瘤细胞、杂交瘤细胞、转化细胞系,兼性贴壁细胞 附壁或悬浮,1.原代培养（or初次培养，primary culture）胚胎或出生后几天幼龄动物的脏器获取组织，剪成小块 长宽1mm、厚约0.5mm，胰酶消化分散，稀释成21057105ml，分装到培养瓶（板）于37 CO2培养箱内培养。,原代培养的细胞特点：离体时间短，一般具二倍体遗传性状，能较好地反映在体内的生长状况 适合用作药物测试和细胞分化的研究工具。,（二）
15、动物细胞培养技术,2传代培养（或继代培养，subculture）将细胞悬液转接分装到两个瓶中培养 传代培养。,分裂次数：正常细胞有限 一般人正常细胞可传代5060次有限细胞系（finite cell line），传代过程中可无限制生长繁殖的细胞系连续细胞系（continuous cell line）或已确立的细胞系 肿瘤细胞,（三）动物细胞培养的营养条件,1.培养基 1）天然培养基 成分复杂、来源有限 血清、水解乳蛋白、胶原、胚胎浸液等。,主含蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素、其他对维持细胞生长繁殖和保持细胞生物学活性不可缺少的未知因子，促进细胞贴壁、中和有毒物质以保护细胞。,动物血清：,缺点：来
16、源困难，成分不确定，使得细胞生长过程不易检测控制。,水解乳蛋白 乳白蛋白的水解产物,胶原 动物真皮（豚鼠、牛）或大鼠尾腱来源的组织提取物 胚胎浸液 鸡胚和牛胚,特点：一定化学组成主要组分：氨基酸、维生素、糖、无机盐、其他一些辅助因子。,2.合成培养基,根据天然培养基的成分，人工设计模拟合成,RPMI-1640、DMEM、TC199、Eagles MEM等。只能维持细胞的生存(基础培养基)须补充部分天然培养基，血清 一般为1020%。,维持细胞生长所需的激素和生长因子胰岛素、生长激素、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子细胞贴壁或铺展所需的细胞因子，纤维粘连素、铺展因子、胎球蛋白等；,血清在培养液中
17、的主要作用：提供,识别维生素、脂类、激素和金属的结合蛋白，调节被结合物的活力白蛋白 与维生素、脂类、激素结合，将它们载入细胞转铁蛋白 结合并传递铁离子，结合蛋白与有毒金属或热原结合则可解除它们的毒性；细胞生长所需的脂肪酸与微量元素磷脂质、胆固醇、前列腺素等，铜、锌等；,蛋白酶抑制剂，使胰蛋白酶失活，保护细胞不受伤害；起缓冲作用，保证培养液pH的稳定。,不足：成分复杂，含已知或未知成分，研究激素、细胞因子及药物的作用时，干扰分析；产品生产 增加细胞培养后产物提取的难度，或影响产品的质量；大规模培养 成本过高。,消除因不同批次血清之间的差异而造成的实验误差，保证实验结果的准确性与稳定性；减少血清中
18、可能存在的支原体、病毒所造成的污染；,3.无血清培养基,优点 与含有血清的培养基相比,产品的分离纯化更加容易，简化鉴定细胞工程产品的程序；来源稳定，供应充足。,无血清培养基组成：基础培养基+替代血清作用的补充成分。,1激素和生长因子：激素胰岛素、胰高血糖素、生长激素等多肽激素 及孕酮、氢化可的松、雌二醇等甾体类激素。胰岛素调节和控制细胞内多种代谢途径，加强糖原、蛋白质、甘油三酯及DNA的合成。生长因子表皮生长因子、神经生长因子、成纤维生长因子、血小板生长因子等。,补充成分种类：,2.结合蛋白：转铁蛋白增强细胞摄取和利用培养液中铁的能力，可结合有毒金属离子解除其毒性；白蛋白与脂类、金属离子、激素
19、等结合后可以增强其作用，刺激细胞增殖。,3.贴壁和铺展因子：常用的贴壁因子有纤维连结素、多聚赖氨酸、胶原，血清铺展因子则是一种糖蛋白。,4.低分子量营养因子和元素：主要有维生素A、抗坏血酸、-生育酚、硒等,（四）动物细胞培养的环境条件培养基，培养环境无毒无菌；合适的温度、湿度、气体环境和pH值。,1.培养环境无毒无菌：动物细胞 体内 强大免疫系统，清除和抵抗病原体免受侵害 体外培养 失去抵御能力 保证环境的无毒无菌(首要条件)加双抗液青霉素、链霉素以抑制可能存在的细菌和霉菌的生长,2温度哺乳动物细胞3537，动物细胞耐低温能力强于耐高温能力，41 细胞严重受损，4 细胞也能存活数日。培养物+保
20、护剂二甲亚砜（DMSO）或甘油-80或液氮罐（温度可降至-196）可长期保存。,3渗透压：哺乳动物细胞 260320mOsmkg 渗透压可略低 培养过程中水分蒸发渗透压,4 气体环境与pH：一般为95的空气+5%CO2，O2 参与三羧酸循环，产生能量供给细胞生长，CO2 细胞生长所必需的成分，细胞的代谢产物，维持培养液的pH。大多数细胞生长的适宜pH是7.27.4,NaHCO3 细胞培养过程中不断释放出CO2，使培养液变酸，添加一定量的NaHCO3 碳酸盐缓冲系统维持培养液pH值相对稳定,（五）动物细胞种质保存与运输 超低温冰冻方法 长期保存 细胞冻存液中加入保护剂 DMSO或甘油，将细胞密封
21、保存于-80或-196的液氮罐中。,1.保护剂甘油或DMSO，速渗透入胞内结合H2O，降低冰点，延缓冻结过程，同时增加胞膜对水的通透性，使H2O在冻结前缓慢透出胞外，减少胞内冰晶，降低因冰晶形成而造成的胞损伤。使用浓度 甘油520，DMSO 510。,影响细胞冻存质量的因素：,DMSO 与甘油相比，作用更快，膜通透性更强，抗冻伤能力也更强，细胞在DMSO中30秒即可达到细胞内外平衡（甘油需2h）实验室普遍采用。,2.细胞悬液的冻存速度:降低冻存速度使冰晶尽量在胞外形成，减少胞内冰晶的形成降低对细胞的伤害。先缓降至一定温度，如-30，使胞外冻结，胞内脱水，再迅速降温。,3.冻存后用液氮超低温保藏
22、-150-196，细胞所有理化活动均降至最低限度，或忽略不计长期储存。,4.细胞复苏时的融化速度。细胞冻存管,取出迅速升温胞外结晶在短时间内融化避免因缓慢融化而使水分渗入胞内再次形成冰晶对细胞造成的伤害。操作：取出后立即投入到3738水浴。,大规模培养：在人工条件下高密度大量培养特定的动物细胞从而生产珍贵医药产品的技术 是实现大规模生产的关键技术。产品：疫苗、激素、细胞因子、单克隆抗体等。,（六）动物细胞的大规模培养,1.培养基 与实验室培养基基本一致（除用无血清培养基外）。无血清培养基中难生长细胞采用渐适法驯化细胞使适应于在无血清培养基中生长。*无血清培养液中易出现细胞毒（与水中的微量元素或
23、有机物污染有关）制备培养液须用高纯水，经0.22m的微孔滤膜过滤除菌。,培养方法：悬浮培养，贴壁培养，贴壁-悬浮培养。（1）悬浮培养非贴壁依赖性细胞和兼性贴壁细胞气升式生物反应器或通气搅拌式反应器动物细胞 胞膜薄，娇嫩易碎，抗剪切能力弱气升式反应器工作原理：通过气体的上下循环起到供氧以及搅拌的效果。培养规模 5L、30L、100L到1000L,2动物细胞大规模培养系统,而微生物可用搅拌式发酵罐,（2）贴壁培养（单层细胞培养）贴壁依赖性细胞和兼性贴壁细胞转瓶（滚瓶）培养 培养瓶旋转使吸附在瓶壁上的细胞交替与培养液及空气接触而增加细胞吸附面积。优点：普遍适用于大多数细胞的培养，规模较易放大，容易实
24、现罐流培养(及时放出陈旧培养液，补加新鲜培养液)。缺点：操作较为繁琐，传代或放大时需要用蛋白酶将其从瓶壁上消化下来。,（3）微载体培养 基本原理：将细胞附着在微载体的表面，后置于培养液中悬浮培养，使细胞在载体表面单层生长繁殖。商品微粒:DEAE-交联葡聚糖、二甲氨丙基聚丙烯酰胺（Biocarrier）及聚苯乙烯（Biosilon）等市售。优点：细胞附着表面积增大；细胞生长环境均一，条件易于控制；取样及细胞计数简单；细胞与培养液易于分离；大规模培养只需对微生物发酵罐或气升式深层培养系统稍加改进即可；适合于培养原代细胞、二倍体细胞株以及基因重组细胞。,（4）固定化包埋培养与微囊培养固定化包埋培养(
25、大载体培养)用高分子材料将细胞包埋并制成固定化颗粒，在培养液中培养。海藻酸钙包埋:细胞溶液与海藻酸钠溶液混合，通过喷珠装置将其喷入氯化钙溶液直径约2.6mm固定化颗粒，去除氯化钙溶液，通入培养液培养。海藻酸钠分子中含有重复排列的葡糖醛酸和甘露糖酸与钙离子作用后形成网络状凝胶珠，而将细胞包埋于其中。,微囊培养：细胞包被在薄的半透性膜中 采用海藻酸钠包埋细胞制成固定化凝胶颗粒，再用长链氨基酸聚合物、多聚赖氨酸包被形成坚韧、多孔可通透的外膜。液化胶化小珠，使其成胶的物质从多孔膜流出，活细胞或生物活性物质留在多孔外膜内，置气升式培养系统中进行增殖。,（5）中空纤维培养 数千根中空纤维封存于特制的圆筒里
26、，组成一个中空纤维培养系统。“内室”灌流无血清培养液供细胞生长；“外室”细胞贴附于管壁上，吸取从“内室”渗透出来的养分，迅速生长繁殖。单抗等细胞分泌的大分子量物质只能留在外室，且不断被浓缩。收集产物 打开“外室”总出口,代谢废物为小分子物质，渗进内室，从其出口流出，不对外室细胞产生毒害,优点：培养器体积小，细胞密度高；产物浓度高、纯度高；自动化程度高，细胞生长周期长。缺点：价格较贵。,（5）中空纤维培养,第二节 细胞融合,离体条件下用人工将两或多个不同种的细胞通过无性方式融合成一个杂合细胞的过程 融合后的细胞含两或多个不同的细胞核（异核体），随后细胞的有丝分裂中，有些不同胞核的染色体合并到一个
27、核中单核杂种细胞，而不能形成单核的融合细胞在培养过程中逐步死亡。,细胞融合(体细胞杂交):,法国 Barski 1960年,过程：细胞在促融因子的作用下发生凝集现象，胞间质膜粘连，细胞融合，在培养过程中核融合杂种细胞。,1）细胞的准备 贴壁培养的细胞，两亲本细胞混合培养 悬浮细胞 制成一定浓度的悬液；2）诱导融合 需要添加促融剂诱导融合；,一、动物细胞融合,小鼠和田鼠，小鼠和小鸡，小鼠和人 远缘和超远缘的体细胞杂交。,1、动物细胞融合的基本过程,3）杂种细胞的选择 利用选择性培养基，使亲本细胞死亡而让杂种细胞存活；4）杂种细胞克隆 选择与纯化杂种细胞，再经培养得所需要的无性繁殖系。,2.促融剂
28、,（1）病毒：仙台病毒(灭活)两种不同动物细胞混合物中存在大剂量病毒,即细胞周围布满病毒，病毒或其组分在细胞间起粘连作用使细胞聚集成团不同胞膜蛋白及膜脂质分子重新排布而结合成一个整体。,诱导细胞融合的关键,使细胞膜蛋白重新分布,膜中脂质分子重排,（2）PEG诱导：当不同种属动物细胞混合液中存在PEG时即产生细胞凝集作用，在稀释和除去PEG的过程中即产生融合现象。原理：脱水作用细胞凝集，使膜结构变化，改变膜表面电荷或膜电位膜蛋白颗粒聚集及脂层分子重排所致。特点：使用简便、结果稳定、诱导融合率较高等 选用：分子量10004000，浓度30%50,（3）电场脉冲：将两种细胞混合液经10100Vcm低
29、强度非均匀交变电场作用，极化成偶极子而相互吸引紧密接触排列成串，此时对该状态的细胞施加瞬时高强度电脉冲，一般击穿电压为0.510kVcm，作用时间为3050s，细胞之间形成稳定的膜连接（可逆性电击穿），不同细胞间膜脂质分子重排而合并成一个双核或多核细胞。融合率高，可控性好。,3.杂种细胞的筛选融合后细胞（五种）异型融合细胞（双核和多核）、两种同型融合细胞（双核和多核）、未发生融合的两种亲本细胞。,（1）筛选原理筛选目的：获遗传性状比亲本细胞更优良的杂种细胞。筛选原理：在培养过程中利用选择性培养基，杀死四种类型细胞。,（2）选择系统常用：HAT选择系统、抗药性选择系统及营养缺陷型选择系统。,HA
30、T选择系统：含一定数量次黄嘌呤（H）、氨基蝶呤（A）、胸腺嘧啶核苷（T）的选择性培养基。DNA为绝大多数生物的遗传物质。嘌呤核苷及嘧啶核苷是DNA的重要组成部分，是细胞生长的必需成分。,补救合成途径：细胞从培养液或自身的代谢产物中吸收游离的嘌呤或嘧啶合成DNA。,正常细胞中DNA合成途径,全合成途径：细胞利用简单的外源性小分子物质的从头合成途径；,图 细胞中DNA合成途径,次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷型（HPRT-）细胞 嘧啶 全合成+补救合成 嘌呤 全合成 胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）细胞 嘌呤 全合成+补救合成 嘧啶 全合成,常用的亲本细胞：酶缺陷型细胞 不能分裂的淋巴细胞。,HP
31、RT-及TK-细胞无嘌呤或嘧啶的补救合成途径,全合成 需甲基（胞中由二氢叶酸还原酶作用而生）,DNA合成的两条途径均受抑制，亲本细胞（HPRT-及TK-）在培养过程中死亡。,含氨基蝶呤的培养基,细胞融合物在HAT培养基上的选择结果图,同一药物 对不同种类细胞的作用差异。一种亲本细胞对A药物敏感，而对B药物不敏感；另一种亲本细胞对B药物敏感，而对A药物不敏感。一定量A、B于培养液中培养细胞两种亲本细胞被杀死，融合细胞存活，,抗药性选择系统：,营养缺陷型筛选：有些细胞在一些营养物（如氨基酸、糖、嘌岭、嘧啶或维生素等）的合成能力上出现缺陷难在缺少这种营养成分的培养基中存活（该营养的营养缺陷型细胞）。
32、,亲本细胞 色氨酸缺陷型，苏氨酸缺陷型，选择性培养基中不加入色氨酸和苏氨酸只有融合所形成的杂种细胞才能生长。,4.杂种细胞的表型杂种细胞（与亲本细胞相比）在遗传表型上变化：,）互补作用：两亲本细胞的某些生物学特性在杂种细胞中共同表达的现象。,免疫淋巴细胞 分泌抗体，体外培养不能生长；小鼠骨髓瘤细胞 体外生长。杂种细胞 既体外生长又分泌特定的抗体。,）激活作用：某一亲本细胞的不活动基因在杂种细胞中被激活的现象。,HPRT-及HPRT+人的细胞分别与HPRT-小鼠细胞杂交，两种杂种细胞 均显示出正常小鼠的HPRT酶活性，人的细胞具有激活小鼠细胞HPRT基因的作用。,）消失作用：亲本的某一或某些性状
33、在杂种细胞中消失的现象。,金黄色仓鼠黑色素瘤细胞 很高的多巴氧化酶活性，可催化酪氨酸形成黑色素，,但与不产生黑色素的小鼠成纤维细胞融合的杂种细胞 不产生黑色素 表明多巴氧化酶基因在杂种细胞中被抑制而呈隐性。,）激活与消失作用：杂种细胞中出现的同一亲本细胞的某一些非活动基因被激活，而另一些遗传性状同时消失的现象。,小鼠胚胎发育早期的胸腺细胞能表达t12抗原，但成年后不表达t12抗原而表达H-2抗原，说明其带有t12和H-2两种抗原的基因，但在不同的发育阶段不同的基因之间表达存在差异。当成年小鼠的胸腺细胞与小鼠胚胎性癌细胞融合所形成的杂种细胞中，H-2抗原基因呈隐性，而t12抗原基因呈显性。,两种
34、亲本细胞的遗传物质融合在一个细胞中后，某些遗传物质经过一段时间后可能会逐渐消失，其结果是由该基因所控制的性状也就随之消失。,遗传物质虽然存在，但在杂种细胞中可以表现出其基因性状（显性），也可能不表现出其基因性状（隐性）。,细胞重组：在体外条件下运用一定的实验技术从活细胞中分离出各种细胞的结构或组成“部件”，再把它们在不同的细胞之间重新进行装配，而得到新的生物活性细胞。,第三节 细胞重组（cell econstruction）,一、核移植技术（nuclear transplantation）借助显微操作仪，利用微吸管将一个细胞的细胞核吸出并移植到另一个去核的细胞中。最初鱼类和两栖类动物后扩展到高
35、等哺乳动物小鼠和家养动物等,二、细胞器移植细胞器种类很多，分离与纯化也较容易，不过研究较多的是叶绿体和线粒体的移植。,（一）叶绿体移植：叶绿体 进行光合作用，把太阳能转变为化学能。高光合效率作物的叶绿体转移到低光合效率作物中增产。,叶绿体移植的方法：将分离纯化的叶绿体与原生质体一道培养，通过细胞的胞饮作用将叶绿体摄入原生质体，经过培养，原生质体再发育成完整的植株,（二）线粒体移植：线粒体有自己的遗传基因，能够合成一些蛋白质。线粒体的移植，可传递遗传信息，改变受体细胞的某些特征，如抗药性和雄性不育性等。,移植方法：微注射、载体转移、胞饮摄入等。,第四节 单克隆抗体技术,外源性物质侵入人体或动物体
36、时免疫反应。即，B淋巴细胞激活、增殖、分化成浆细胞抗体（体液免疫）（血清、体液、外分泌液）。,获得一定特异性抗体的经典方法：用抗原免疫动物（如兔、马、羊、鼠等），从其血清中进行分离。,多个抗原表位（决定簇）针对多种抗原表位的混合抗体（多克隆抗体）。,缺陷：1、抗体不均一，特异性差，效价低，用于检测会影响检测的精确性和灵敏度；2、成熟的能分泌抗体的淋巴细胞寿命很短，一般只有几天，抗体的产量有限，无法实现大规模生产。,骨髓瘤（恶性肿瘤）细胞 体外培养、无限制繁殖，但不能产生抗体，遗传表现型HPRT+-TK+、HPRT+-TK-及HPRT-TK+免疫淋巴细胞 产生抗体，但不能在体外长期培养和无限期繁
37、殖，遗传表现型 HPRT+-TK+。杂种细胞产生抗体、体外长期培养、无限期繁殖（杂交瘤技术，杂交瘤细胞）杂交瘤细胞株 经体外培养分泌成分单克隆抗体（McAb）,一、单克隆抗体及其特性,二、单克隆抗体的制备过程,第一步用抗原免疫动物（如鼠）。第二步脾细胞与骨髓瘤细胞融合。第三步杂交瘤细胞的筛选与克隆化。,第四步单克隆抗体的大规模生产。体外法转瓶或生物反应器对杂交瘤细胞大规模培养并表达相应的单抗体内法动物体内培养杂交瘤细胞生产单抗,McAb制备图,高纯度单一抗体，在氨基酸序列及特异性方面均为一致，检测灵敏度极高；可通过对杂交瘤细胞的大规模培养进行生产；,McAb优点：（与常规抗体相比）,杂交瘤细胞
38、可用液氮深冻法进行长期保存；可在分子水平上解析存在于病毒表面的抗原或受体；可用不纯的抗原制备纯的McAb。,缺点：McAb特异性太强，有时不能检出微生物突变株；有时不能产生与抗原交联的功能；,易受pH、温度、盐浓度影响，或亲和力较低、半衰期短；制备程序复杂、工作量大。,疾病的诊断与治疗。纯度高、特异性强、易于大规模生产的特点，用于临床疾病诊断敏感性高、特异性强、检测结果重复性好，血清学检测 取代常规的多克隆抗体 免疫学诊断。,已生产抗激素、抗病毒、抗细菌、抗寄生虫、抗肿瘤相关抗原等单克隆抗体，体内激素或药物等微量物质的测定、传染病与肿瘤的诊断等,三、单克隆抗体的应用,疾病的治疗 癌症的治疗 结
39、直肠癌、淋巴癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、黑色素瘤、白血病、前列腺癌、胰腺癌等，治疗类风湿性关节炎、A型糖尿病的单抗。与各种毒素（如白喉外毒素、篦麻毒素）、放射性元素或药物（如氨基蝶呤、阿霉素等）化学偶联制备成靶向性药物（targetting drug）肿瘤的治疗,、用于生物活性蛋白的分离与纯化。目的蛋白的单抗交联到溴化氰活化的层析介质（如Sepharose）上，制成亲和层析吸附剂,1什么叫动物细胞工程？包括哪些内容？2动物细胞培养基分为哪几种类型？各有何特点？3何谓动物细胞的原代培养与传代培养？各有何特点？4如何控制动物细胞悬液的冻存速度？5如何控制动物细胞培养时的气体环境与pH的稳定?6动物细胞大规模培养有哪些方法？各有何特点？7气升式生物反应器的工作原理是什么？8叙述血清在细胞培养中的作用及其不足。9.与含有血清的培养基相比，无血清培养基有哪些优点？10.简述无血清培养基的组成。,11.微载体培养细胞法有哪些优点？12.中空纤维培养细胞有哪些优点？13.淋巴细胞杂交瘤的形成原理是什么？简述其制备路线。14.什么叫单克隆抗体（McAb）？有哪些基本特征？15.什么叫细胞融合？其促融剂主要有哪些？16.叙述无血清培养基需补充的成分及其作用。17.转瓶培养细胞法有哪些优点？,单克隆抗体制备流程图,
