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1、子情境 青霉素发酵仿真,青霉素的历史？,1928年Fleming在研究葡萄球菌变异时发现，污染在培养葡萄球菌双碟上的一株霉菌，能杀死周围的葡萄球菌。将此霉菌分离后得到的纯菌株，经鉴定为点青霉（Penicillium notatu m），Fleming将这种菌产生的抗生物质命名为青霉素。,青霉素基础知识,青霉素基础知识,青霉素分类及分子结构青霉素是6氨基青霉烷酸（6-aminopenicillanic acid,6-APA）苯乙酰衍生物。侧链基团不同，形成不同的青霉素，主要是青霉素G。工业上应用的有钠、钾、普鲁卡因、二苄基乙二胺盐。青霉素发酵液中含有5种以上天然青霉素（如青霉素F、G、X、K、F
2、和V等），它们的差别仅在于侧链R基团的结构不同，其中青霉素G在医疗中用得最多，它的钠或钾盐为治疗革兰氏阳性菌的首选药物，对革兰氏阴性菌也有强大的抑制作用。,青霉素基础知识,青霉素的单位目前国际上青霉素活性单位表示方法有两种：一是指定单位（unit）；二是活性质量（g），最早为青霉素规定的指定单位是：50mL肉汤培养基中恰能抑制标准金葡萄菌生长的青霉素量为一个青霉素单位。在以后，证明了一个青霉素单位相当于0.6g青霉素钠。因此青霉素的质量单位为:0.6g青霉素钠等于1个青霉素单位。由此，1mg青霉素钠等于1670个青霉素单位(unit)。,青霉素基础知识,青霉素作用机理已有的研究认为，青霉素的抗
3、菌作用与抑制细胞壁的合成有关。细菌的细胞壁是一层坚韧的厚膜，用以抵抗外界的压力，维持细胞的形状。细胞壁的里面是细胞膜，膜内裹着细胞质。细菌的细胞壁主要由多糖组成，也含有蛋白质和脂质。革兰氏阳性菌细胞壁的组成是肽聚糖占细胞壁干重的5080（革兰氏阴性菌为110）、磷壁酸质、脂蛋白、多糖和蛋白质。其中肽聚糖是一种含有乙酰基葡萄糖胺和短肽单元的网状生物大分子，在它的生物合成中需要一种关键的酶即转肽酶。青霉素作用的部位就是这个转肽酶。现已证明青霉素内酞胺环上的高反应性肽键受到转肽酶活性部位上丝氨酸残基的羟基的亲核进攻形成了共价键，生成青霉噻唑酰基-酶复合物，从而不可逆的抑制了该酶的催化活性。通过抑制转
4、肽酶，青霉素使细胞壁的合成受到抑制，细菌的抗渗透压能力降低，引起菌体变形，破裂而死亡。,青霉素发酵生产过程,1菌种青霉是产生青霉素的重要菌种。广泛分布于空气、土壤和各种物上，常生长在腐烂的柑桔皮上呈青绿色。目前已发现几百种，其中产黄青霉(Penicillum chrysogenum)、点青霉(Penicillumnototum)等都能大量产生青霉素。青霉素的发现和大规模地生产、应用，不仅对抗生素工业的发展起了巨大的推动作用，而且加上其他抗生素的广泛使用，比如像磺胺药物，使人类的平均寿命，再次延长了四岁。此外，有的青霉菌还用于生产灰黄霉素及磷酸二酯酶、纤维素酶等酶制剂和有机酸。1981年报导，疠
5、孢青霉是纤维素酶的新来源，它能分解棉花纤维。,青霉素发酵生产过程,2菌种的保藏菌种的保藏方法有：斜面菌种低温保藏法砂土管保藏法真空冷冻干燥法,青霉素发酵生产过程,3孢子的制备这是发酵工序的开端，是一个重要环节。抗生素产量和成品质量同菌种性能以及同孢子和种子的情况有密切关系。生产用的孢子需经过纯种和生产能力的检验，符合规定的才能用来制备种子。保藏在砂土管或冷冻干燥管仲的菌种经无菌手续接入适合于孢子发芽或菌丝生长的斜面培养基中，经培养成熟后挑选菌落正常的孢子可再一次接入试管斜面。对于产孢子能力强的及孢子发芽、生长繁殖快的菌种可以采用固体培养基孢子，孢子可直接作为中子罐的种子。,青霉素发酵生产过程,
6、4种子制备种子制备是指孢子接入种子罐后，在罐中繁殖成大量菌丝的过程，其目的是使孢子发芽、繁殖和获得足够数量的菌丝，以便接种到发酵罐当中去。种子制备所使用的培养基及其它工艺条件，都要有利于孢子发芽和菌丝繁殖。种子罐级数是在指制备种子需逐级扩大培养的次数，一般根据种子的生长特性、孢子发芽及菌体繁殖速度，以及发酵罐的容积而定。青霉素种子制备一般为二级种子罐扩大培养。,青霉素发酵生产过程,前体添加苯乙酸或者苯乙酰胺，可以借酰基转移的作用，将苯乙酸转入青霉素分子，提高青霉素G的生产强度，添加苯氧乙酸则产生青霉素V。因此前体的加入成为青霉素发酵的关键问题之一。但苯乙酸对发酵有影响，一般以苯乙酰胺较好。也有
7、人采用苯乙酸月桂醇酯，其优点是在发酵中月桂醇酯水解，苯乙酸结合进青霉素成品。而月桂酸作为细菌营养剂及发酵液消沫剂，且其毒性比苯乙酸小，但价格较贵。前体要在发酵开始20h后加入，并在整个发酵过程中控制在50g/ml左右,青霉素发酵生产过程,5发酵这一过程的目的主要是为了使微生物分泌大量的抗生素。发酵开始前，有关设备和培养基必须先经过灭菌，后接入种子。接种量一般为520%。发酵周期一般为45天，但也有少于24小时，或长达二周以上的。在整个过程中，需要不断通气和搅拌，维持一定的罐温和罐压，并隔一段时间取样进行生化分析和无菌试验，观察代谢变化、抗生素产生情况和有无杂菌污染。,2.7发酵,青霉素发酵生产
8、过程,6发酵液预处理发酵液中的杂质如高价无机离子（Fe2+、Ca2+、Mg2+）和蛋白质在离子交换的过程中对提炼影响甚大，不利于树脂对抗生素的吸收。如用溶媒萃取法提炼时，蛋白质的存在会产生乳化，使溶媒合水相分离困难。对高价离子的去除，可采用草酸或磷酸。如加草酸则它与钙离子生成的草酸钙还能促使蛋白质凝固以提高发酵滤液的质量。如加磷酸（或磷酸盐），既能降低钙离子浓度，也利于去除镁离子。,青霉素发酵生产过程,7提取化学提取和精制的目的：从发酵液中制取高纯度的、合乎药典的抗生素成品。由于发酵液中青霉素浓度很低，仅0.14.5%左右，而杂质浓度比青霉素的高几十倍甚至几千倍，并且某些杂质的性质与抗生素的非
9、常相近，因此提取精制是一件十分重要的工作。发酵液中常见的杂质有：菌丝、未用完的培养基、易污染杂菌、产生菌的代谢产物、预处理需要加入的杂质等。,青霉素发酵生产过程,8脱色和去热原质脱色和去热原质是精制注射用青霉素中不可缺少的一步。色素是在发酵过程中所产生的代谢产物，它与菌种和发酵条件有关热原质是在生产过程中由于被污染后杂菌所产生的一种内毒素。生产中一般用活性炭脱色去热原质，但需注意脱色时pH、温度、活性炭用量及脱色时间等因素，还应考虑它对抗生素的吸附问题，否则影响收率。,青霉素发酵生产过程,9结晶抗生素精制常用结晶法来制得高纯度成品。常用的几种结晶方法有：（1）、改变温度结晶利用抗生素在溶剂中的
10、溶解度随温度变化而显著变化的这一特性来进行结晶（2）、利用等电点结晶当将某一抗生素溶液的pH调到等电点时，它在水溶液中溶解度最小，则沉淀析出。（3）、加成盐剂结晶在抗生素溶液中加成盐剂使抗生素以盐的形式从溶液中能够沉淀结晶。,青霉素生产设备,青霉素生产设备,1、罐体 2、搅拌器和挡板 3、消泡器 4、联轴器及轴承 5、变速装置 6、空气分布装置 7、轴封 8、控温装置 9、附属设施,溶解氧对发酵的影响及其控制,（一）、溶解氧对发酵的影响,溶氧是好氧发酵控制最重要的参数之一。由于氧在水中的溶解度很小，在发酵液中的溶解度更小，因此，需要不断调整通风和搅拌，才能满足不同发酵过程对氧的需求。溶氧的大小
11、对菌体生长和产物的形成及产量都会产生不同的影响。如谷氨酸发酵，供氧不足时，谷氨酸积累就会明显降低，产生大量乳酸和琥珀酸。,溶解氧对发酵的影响及其控制,（二）、溶氧浓度控制,典型的分批发酵中氧浓度的变化规律（一定Kla下）：,r,X,Q,CL,一般有一个低谷，在对数生长的末期,溶解氧对发酵的影响及其控制,1.在供氧方面,主要是设法提高氧传递的推动力和液相体积氧传递系数KL值。结合生产实际，在可能的条件下，采取适当的措施来提高溶氧，如调节搅拌转速或通气速率来控制供氧,发酵液的需氧量，受菌浓、基质的种类和浓度以及培养条件等因素的影响，其中以菌浓的影响最为明显。控制最适的菌浓可以通过控制基质的浓度来实现,2.在需氧方面,通气量,搅拌转速,罐压,溶解氧对发酵的影响及其控制,仿真软件操作规程,1正常发酵（过程）1、进料(基质)，开备料泵2、开备料阀3、备料后（罐重100000KG）关备料阀4、关备料泵5、开搅拌器6、设置搅拌转速为200转,仿真软件操作规程,7、开通风阀8、开排气阀9、投加菌种10、补糖，开补糖阀11、补氮，开加硫铵阀12、开冷却水，维持温度在2513、PH值保持在一定范围内14、前体超过1KG/M3（扣分步骤，出现则扣分）,仿真软件操作规程,2出料1、停止进空气2、停搅拌3、关闭所有进料，开阀出料,Thank You!,
