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1、第22章 真核生物DNA复制和起始调控,DNA复制执照假说DNA复制起始点与前DNA复制复合体组装前DNA复制复合体组装过程的调节DNA复制起点的激活与G1/5期检控点,目录,J Julian Blow等人提出DNA复制执照假说（DNA replication-licensing theory），认为在细胞中必然存在一种因子，能够在G1期与染色质结合，对染色质的DNA复制发行“执照”，引导DNA复制的起始。当DNA一旦复制完成，该执照即行消失，避免复制后的DNA过度复制。,第一节 DNA复制执照假说,实验表明，处于G1期的细胞核加入到非洲爪蟾卵提取物中，该细胞能够进行有效的DNA复制；而G2期
2、的细胞核加入同样的非洲爪蟾卵提取物，该细胞核则不能复制其DNA。如果将G2期的细胞核先去除核膜，再加入该提取物，则能够进行DNA复制。,提出复制执照假说的实验,对于实验的解释,在M期，细胞核膜破裂，胞质中的执照因子与染色质接触并与之结合，使后者获得DNA复制所必需的执照。在子细胞形成的过程中该执照因子被限制在细胞核内。细胞通过G1期进入S期，DNA起始复制。随DNA复制过程的进行，“执照”信号不断减弱直到消失。到达G2期，细胞核不再含有执照信号，DNA复制结束，并不再起始。只有等到下一个M期，染色质再次与胞质中的执照因子接触，重新获得执照，细胞核才能开始新一轮的DNA复制。,DNA复制执照因子
3、,DNA复制执照因子（DNA replicatinlicensing）:真核细胞中用于精准控制DNA分子在每个细胞周期只复制一次的蛋白质因子,DNA复制执照系统的成员,DNA复制执照系统主要是由Mcm蛋白（mini-chromosome-maintenance proteins）复合体结合到染色质的复制起点上来完成的。,Mcm蛋白复合体是DNA复制执照系统的主要成员，它是由Mcm1，Mcm2，Mcm3，Mcm4，Mcm5，Mcm6，Mcm7蛋白单体在DNA复制起点上组装而成的一个六聚体。,DNA复制执照系统的具体机制,M晚期：CDK活性变化引起执照系统被激活，Mcm蛋白复合体结合DNA的复制起
4、点，DNA准备复制。S期：CDK活性变化引起执照系统失活，即在S期，G2期，以及M期早期，新的Mcm蛋白复合体不能再被募集到DNA的复制点上。,大量实验表明：DNA复制执照假说涉及的不仅仅是一个蛋白质分子与染色质的结合，而是涉及到一整套调控系统，既保持DNA的有效复制，又保持基因组的完整性与稳定性。,第二节 DNA复制起始点与前DNA复制复合体组装,一、DNA复制起点的确定,DNA复制起点是一段相对特殊的DNA序列。在原核生物细菌中，DNA复制只有一个起始位点。而在真核生物中，DNA复制起点有许多个，分布在基因组中，共同起始DNA的复制。不同的真核生物DNA复制起始位点也不相同。,在DNA复制
5、起始过程中，由6个亚基组成的复制起点识别复合体（origin recogniyion complex,ORC）首先识别并结合到复制起始点上。随后，一系列参与与DNA复制起始的蛋白质如Cdc6、Cdt1、MCM复合体等被依次召集到复制起始位点上，形成前DNA复制复合体（pre-Replication Complex,pre-RC）。Pre-RC复合体的组装及其去组装是DNA复制起始点上组装完成及表明该DNA复制起点被发行了执照从而能够起始DNA复制。,二、前DNA复制复合体的组装过程,三、DNA复制起始点识别复合体的构成和组装,ORC：由六个蛋白（或亚基）构成，分别为Orc1、Orc2、Orc3
6、、Orc4、Orc5和Orc6。Orc蛋白在结构和功能上均相当保守。经分析表明，芽殖酵母的ORC仅分布在有限的DNA复制起始位点上。与启动子相关的转录调节因子，可能影响ORC与DNA复制起始位点结合，进而影响DNA复制的起始。ATP的结合与水解也显著影响ORC的功能。,在整个细胞周期中，ORC蛋白成员并不是一直以一个复合体的形式存在。ORC对DNA复制起始点的选择缺乏特异性，任何DNA系列都可以作为DNA复制起始点。,四、Cdc6蛋白与前DNA复制复合体组装,Cdc6(cell division cycle 6)是参与DNA复制起始过程中的另一个重要蛋白。芽殖酵母Ccd6最早被鉴定出参与DNA
7、复制起始调控。此后，在人、爪蟾、小鼠等相继发现Cdc6，他们在进化过程中显示出高度的序列保守性。Cdc6属于ATP酶家族AAA+(ATPases associated with a variety of cellular activities)，能够结合且水解ATP。,Cdc6的含量在酵母细胞中呈现周期性变化，在G1期晚期开始表达，在G1/S期交界处到达高峰，进入S期后迅速降低，在下一轮G1期的晚期再次升高。芽殖酵母Cdc6与复制起始点上的ORC蛋白直接结合，并参与调控MCM蛋白结合到染色质。细胞进入S期是，即一旦DNA复制开始启动，芽殖酵母Cdc6发生磷酸化，经SCFCDC4（Skp1-CD
8、C53-F-box protein）依赖性泛素化蛋白降解途径经蛋白酶降解。在酵母中，Cdc6在S期的降解有效的阻止同一个周期内MCM蛋白在复制起始点上的重新组装，从而阻止DNA在同一个周期内发生多重复制。在酵母细胞中，调节Cdc6的表达水平是保证“在一个细胞周期中DNA只能复制一次”的重要机制之一。,五、Cdt1蛋白与前DNA复制复合体组装,Cdt1也是参与DNA复制起始调控的重要蛋白之一。Cdt1（Cdc10 dependent transcript 1）的、是1994年于酵母中首先发现的Cdc10依赖性转录因子。,六、Mcm2-7复合体与前DNA复制复合体组装,MCM蛋白在DNA复制起始过
9、程中起主要作用。,第三节 前DNA复制复合体组装过程的调节,前DNA复制复合体组装过程的调节机制主要是由周期性依赖性的CDK激酶活性进行直接或间接驱动的。Cdk（cyclin dependent kinase）激酶活性在真核生物DNA复制起始调控中具有双重作用。一方面，当细胞进入S期，Cdk激酶活性增高，激活DNA复制的起始；另一方面，Cdk激酶活性阻止同一周期中S、G2和M期中DNA的多重复制。此外，Cdk激酶还控制特定起始点复制的起始时间。,一、Cdk激酶对Orc蛋白的功能调节,芽殖酵母细胞中的Orc2和Orc6遗迹裂殖酵母细胞中的Orc2等均可被Cdk激酶磷酸化。实验证明，只是磷酸化程度
10、降低或丧失的突变体在特殊情况下还可能引起基因组再复制，说明Cdk通过磷酸化Orc蛋白，对DNA复制的起始进行负调控。,二、Cdk激酶对Cdc6的功能调节,当DNA复制起始完成，细胞进入S期，周期蛋白B/Cdk激酶表现活性，Cdc6就不再参与与前DNA复制复合体的组装。芽殖酵母Cdc6（或者裂殖酵母Cdc18）被CDK磷酸化后降解。,Cdk激酶对MCM蛋白的功能调节,在芽殖酵母中，Cdk激酶活性调节MCM的亚细胞定位。MCM蛋白于G1和S期中定位在细胞核中，而在G2和M期则从细胞核中被运送出核。Cdk激酶活性丧失将导致MCM滞留于细胞核。其次，MCM蛋白的磷酸化修饰还可能直接抑制MCM复合体解旋
11、酶活性。,四、Cdk激酶和Geminin对Cdt1作用的功能调节,Cdk激酶磷酸化后降解从而下调Cdt1活性。Cdt1的抑制蛋白Geminin通过抑制Cdt1活性从而抑制执照系统,Cdt1分子结构及与Geminin前端形成复合体示意图,染色质构型对DNA复制起始的影响,参与DNA复制其是调控的所有因子都必须与染色质结合，所以染色质的构型对DNA复制起始点的激活和起始时间的确立有重要影响。结构致密的异染色质区的DNA较晚复制。染色质重构因子也被认为影响DNA复制。局部核小体结构也会影响DNA复制起始调控。,第四节 DNA复制起点的激活与G1/5期检控点,一、DNA复制起始的激活,DNA复制起始的
12、激活也称为“复制起始点触发”，需要更多的因子组装到复制起始点上。这个过程可以分为两个步骤：1.MCM解螺旋酶或子女更的激活引起复制起始位点DNA双链解璇而形成一对复制叉。2.DNA聚合酶募集到复制叉上。,DNA复制起始的激活过程,（A）DNA复制复合体（pre-RC）形成后，在Cdk激酶和DDK激酶以及Mcm10参与下，募集Cdc45和GINS（Sld5-Psf1-Psf2-Psf3复合体）于复制起点上，Cdc45、GINS、和随后RPA、DNA pol、DNA pol、RFC、PCNA、DNA pol等因子顺序性结合于复制起始点处，启动DNA复制。（B）周期蛋白E与周期蛋白A的激酶活性变化以
13、及Geminin蛋白水平的周期性调节共同调节前DNA复制复合体和前DNA复制起始复合体的形成。,1.DDK（Dbf4-dependent cdc7 kinase，Dbf4依赖性的Cdc7激酶）,DDk激酶主要由两个亚基构成，即Cdc7和Dbf4。Cdc7具有激酶活性的催化亚基，Dbf4为调节亚基。Cdc7-Dbf4的激酶活性依赖于调节亚基Dbf4的周期性表达。Dbf4在S期出现表达高峰，受蛋白质降解机制所调控。DDK激酶需要定位到染色质上才能发挥作用。,2.Cdk激酶,Cdk激酶在DNA复制起始的激活过程中起着重要的作用。Cyclin E-CDK2能够通过促进Cdc7激酶对Mcm2的磷酸化，从
14、而促进Mcm2和染色质结合。,3.mcm10,爪蟾mcm10与染色质的结合需要mcm2-7先与染色质结合。若除去mcm10，另两个重要调控因子Ccd45和RPA与染色质结合受阻，说明mcm10在DNA复制起始的激活过程中发挥作用。在不同动物细胞中，Mcm10与Orc2和Mcm2-7的两个成员相互作用。在酵母中，Mcm10对于DNA复制起始是必需的。该基因的突变会导致复制叉停止在复制起始点或其附近，说明它在DNA复制延伸中起作用。,4.Cdc45,Cdc45是在筛选细胞周期过程中冷敏感突变株时首先发现的，是DNA复制起始的激活过程中的关键性调控因子之一。,5.GINS（SLD5-Psf1-Psf
15、2-Psf3复合体）,GINS（SLD5-Psf1-Psf2-Psf3复合体）和Cdc45均能够结合到复制起始点上，并且对于复制叉的延伸是必需的。GINS和Cdc45与MCM共同形成的CMG（GINS-Cdc45-MCM）复合体具有解旋酶的活性。,二、其实复制时机（origins firing timing）的控制,真核细胞S期内，不同复制起始点启动DNA复制的时机不同。转录活跃期的DNA较早开始复制，转录不活跃的DNA较晚复制。起始复制的时期似乎在有丝分裂晚期或G1期即已建立。起始复制时期的调控不影响前DNA复制复合体的组装，而是调节DNA复制起始的激活过程。,三、DNA复制相关的细胞周期检
16、控点,1.G1/S期检控点,G1/S检控点的作用：保证基因组的忠实复制，避免DNA复制异常（如DNA损伤或DNA合成紊乱），这是真核细胞演化发展的控制机制。当DNA收到物理化学损伤时，复制起始或复制过程将被停止，直到DNA损伤的因素撤除和DNA完成修复为止。除G1/S期检控点外，细胞内还存在其他数个检控点，对细胞的正常生命活动起着重要的调控作用。,2.S期内检控点,当细胞在S期内发生DNA损伤时，S期内检控点被激活，暂时的、可逆的一直尚未起始的那些复制起始点即晚期复制起始点的 启动，是DNA复制速度减缓。,3.S/M检控点,S/M检控点（S/M checkpoint）也叫DNA复制检控点（DNA replication checkpoint）。在细胞进入有丝分裂前，未完成复制的DNA能够激活S/M检控点，组织细胞进行有丝分裂，防止未完成复制的染色质的提前凝集。,谢谢,
