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1、课件药品微生物限度检测技术,目录,药品微生物限度检测概述,药品微生物限度检测条件,药品微生物限度检测方法,一、药品微生物限度检测概述,药品微生物限度检查定义,药品微生物限度检查意义,药品微生物限度检测的内容,药品微生物限度检查适用剂型,药品微生物限度检测概述,1.1药品微生物限度检查定义,微生物限度检查方法是检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。,微生物的种类和数量必须限制在一定的范围内或不得检出。,1.2药品微生物限度检查 适用剂型,部分口服给药制剂:口服液、酊剂、中药丸剂、糖浆剂、散剂、特殊部位使用的片剂（口腔帖片、阴道片、阴道泡腾片、外用可溶片）含中药原粉、豆豉、神曲、
2、动物组织等口服制剂鼻用制剂洗剂灌肠剂等,非规定灭菌制剂及其原、辅料,1.3药品微生物限度检查意义,确定药物是否污染或其污染程度，控制药品的质量；,保证用药的有效性和安全性,可作为衡量药品生产全过程卫生水平的根据之一,1.4药品微生物限度检测的内容,大肠埃希菌大肠菌群沙门菌铜绿假单胞菌金黄色葡萄球菌梭菌白色念珠菌,二、药品微生物限度检测条件,检查环境和人员要求,A,环境要求:无菌室内进行。背景洁净度10,000级下的局部100级，单向流空气。,操作人员：卫生、着装符合要求。,操作要求：严格遵守无菌操作，严防污染。,二、药品微生物限度检测条件,由于某些供试品具有抗菌活性，在建立测定方法或原测定法的
3、检验条件发生改变时，可能影响检验结果的准确性，必须对供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性进行验证。,二、药品微生物限度检测条件,1.抽样方法,二、药品微生物限度检测条件,2.检测用量,3.检测量,二、药品微生物限度检测条件,仪器 超净工作台、光学显微镜、恒温培养箱、压力蒸汽灭菌器、薄膜过滤装置、比浊仪等。,用具 试管、注射器、三角瓶、刻度吸管、移液器、精密pH试纸、滤膜、滤杯、剪刀、镊子、无菌服、牛皮纸等。,环境清洁，表面消毒（75%(V/V)乙醇、新洁尔灭(1：1000)溶液或其他适宜消毒溶液）空气过滤系统，紫外灯或臭氧空气消毒仪,E环境准备,二、药品微生物限度检测条件,培养基的酸碱度应符合细
4、菌生长要求。应按各种培养基要求准确测定调节pH值。多数细菌生长的适宜pH值为7.27.6。酵母菌霉菌（6.06.5）。培养基的灭菌时间和温度，应按照各种培养基的规定进行，以保证灭菌效果及不损失培养基的必需营养成分。,湿热：115 121，15min30min 物品切勿立即取出置冷处，以免急速冷却，使灭菌物品内蒸气冷凝造成负压，以致染菌。干热：160 170，2h 适于耐高温的玻璃、陶瓷或金属器皿的灭菌。灭菌程序需要经过验证,计数培养基适用性检查,细菌、霉菌及酵母菌计数用培养基应进行培养基的适用性检查，成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应检查。,计数培养基适用性检查,菌种大肠埃希菌
5、CMCC（B）44 102金黄色葡萄球菌CMCC（B）26 003枯草芽孢杆菌 CMCC（B）63 501白色念珠菌 CMCC(F)98 001黑曲霉 CMCC(F)98 003验证试验所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物学特性。,计数培养基适用性检查,菌液制备 细菌新鲜培养物（一般18h24h，白念24h48h，黑曲霉 57天），用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml 含菌数50cfu100cfu的菌悬液（黑曲霉用含0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液）菌悬液在室温下放置应在2小时内使用，若保存在2
6、 8可以在24小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在2 8，在验证过的贮存期内使用。,计数培养基适用性检查,培养基接种 金黄色葡萄球菌2个平皿营养琼脂培养基 大肠埃希菌2个平皿 枯草芽孢杆菌2个个皿 玫瑰红钠琼脂培养基 白色念珠菌2个平皿 黑典霉2个平皿酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基：白色念珠菌2个平皿,计数培养基适用性检查,结果判定 若被检培养基上的菌落平均数不小于对照培养基上的菌落平均数的70%，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致，判该培养基的适用性检查符合规定。,2.2药品微生物限度检测的基本条件,2.2药品微生物限度检测的基本条件,供试品检出控制菌或其它致病菌时，按一次检出结果为准，不
7、再复试。,供试品的细菌数、霉菌和酵母菌数其中任何一项不符合该品种项下的规定，应从同一批样品中随机抽样，独立复试两次，以3次结果的平均值报告菌数。,供试品的细菌数、霉菌和酵母数及控制菌三项检验结果均符合该品种项下的规定，判供试品符合规定；若其中任何一项不符合该品种项下的规定，判供试品不符合规定。,三、药品微生物限度检测方法,细菌数、霉菌和酵母菌数检查,控制菌检查,3.1细菌数、霉菌和酵母菌数检查,1.平皿法,3.1细菌数、霉菌和酵母菌数检查,1.平皿法,3.1细菌数、霉菌和酵母菌数检查,2.薄膜过滤法,3.1细菌数、霉菌和酵母菌数检查（薄膜过滤法）,阴性对照：取供试品微生物限度检查相应的溶剂和稀
8、释液同法操作，阴性对照不得长菌,3.1细菌数、霉菌和酵母菌数检查薄膜过滤法,结果判断细菌总数真菌总数,符合药典该品种项下限度规定,判定药物的细菌、真菌总数检验合格,否则因从同一批次产品中重新抽样，独立复试三次，以三次结果的平均值报告菌数,3.1细菌数、霉菌和酵母菌数检查,3.1细菌数、霉菌和酵母菌数检查,3.1细菌数、霉菌和酵母菌数检查,3.1细菌数、霉菌和酵母菌数检查,宜选取细菌、酵母菌平均菌落数小于300 cfu、霉菌平均菌落数小于100 cfu的稀释级，作为菌数报告（取两位有效数字）的依据。（1）以最高的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告1g，1ml供试品中所含的菌数。（2）如各稀释级的平板
9、均无菌落生长，或仅最低稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小于1时，以1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。,3.2控制菌检查检查项目,（1）阴性对照试验：取稀释液10ml按相应供试品控制菌检查法检查，应无菌生长。（2）阳性对照试验：供试品+10100CFU 阳性对照菌，应检出相应的阳性对照菌。（3）供试品控制菌检查：依相应的检查方法进行。,3.2控制菌检查检查流程,3.2控制菌检查检查流程,由于药品在生产过程中，常受到加热、干燥等加工步骤的影响，药品中污染的微生物可能受到损伤或呈休眠状态，先进行增菌，以修复受损细菌，恢复其生长繁殖能力，使菌体数增加，提高检出率，避免出现漏检。,3.2控制菌检查检查
10、流程,经增殖培养后,被检菌大量繁殖，同时其他一些杂菌也出现增殖。因此分离培养能使目的菌从混合菌中分离出来。,3.2控制菌检查检查流程,大量增殖被检菌，用于后面的进一步检验。,3.2控制菌检查检查流程,初步鉴定，观察细菌的形态大小。,3.2控制菌检查检查流程,最终的鉴定依据，结合染色镜检得出实验结果，填写检验报告。,3.2.1控制菌检查大肠埃希菌检查,大肠埃希菌,俗称大肠杆菌，属肠杆菌科埃希菌属，革兰阴性杆菌，兼性厌氧菌，能发酵多种糖产酸产气。,3.2.1控制菌检查大肠埃希菌检查,大肠埃希菌检查意义,大肠埃希菌为条件致病菌，当人体免疫力低下或是侵入肠外组织、器官，可引起肠外感染，乃至败血症。也可
11、随人和动物的粪便排出体外，污染环境，一旦食品、药品、水等物品中检出该菌，说明已受粪便污染，可能存在其他肠道致病菌和寄生虫卵，人们饮用或服用它们则可能引起消化道传染病。,3.2.1控制菌检查大肠埃希菌检查,大肠埃希菌检查流程图,EMB琼脂培养基,靛基质试验,紫黑色金属光泽,玫瑰红色液面,I M Vi C试验 大肠埃希菌+(或-）+-产气杆菌-+,3.2.1控制菌检查大肠埃希菌检查,大肠埃希菌检查结果报告,3.2.2控制菌检查大肠菌群检查,大肠菌群,3.2.2控制菌检查大肠菌群检查,大肠菌群检查意义,大肠菌群主要存在于温血动物粪便中，随粪便排出体外后可直接污染药品，若产品中检出该菌群，表明该产品受
12、到粪便污染，可能存在肠道致病菌并引起疾病，以此作为粪便指示菌比大肠埃希菌更具广泛卫生学意义，是评价化妆品卫生质量的重要指标之一。,3.2.2控制菌检查大肠菌群检查,大肠菌群检查流程图,3.2.2控制菌检查大肠菌群检查,大肠菌群检查结果报告大肠菌群MPN表,3.2.3控制菌检查沙门菌检查,沙门菌,3.2.3控制菌检查沙门菌检查,沙门菌检查意义,沙门菌是肠杆菌科的重要致病菌，可随粪便或带菌者接触污染药品原辅料、制药用水、设备、半成品、成品，尤其是动物脏器为原料的药物，服用后有引起人类伤寒、副伤寒、急性肠炎即败血症等疾病的危险。,3.2.3控制菌检查沙门菌检查,沙门菌检查流程图,靛基质试验 脲酶试验
13、生化试验 氰化钾试验 赖氨酸脱羧酶试验 动力试验 血清学凝聚试验,有特征菌落,三糖铁琼脂培养基穿刺接种,最终结果判断,增菌培养,供试液的制备,书写检验记录单,分离纯化,无菌落或无特征菌落,配培养基和稀释液,预增菌,四硫磺酸钠亮绿培养基,SS培养基,黑色菌落,麦康凯培养基,半透明菌落,三糖铁斜面,疑似菌落,赖氨酸脱羧酶培养基,紫色,半固体营养琼脂培养基,血清凝集,3.2.3控制菌检查沙门菌检查,沙门菌检查结果报告,三糖铁反应及生化反应符合沙门菌属反应,血清凝集试验阳性反应,3.2.4控制菌检查铜绿假单胞菌检查,铜绿假单胞菌,铜绿假单胞菌属于假单胞菌属，为革兰氏阴性杆菌，氧化酶阳性，能产生绿脓菌素
14、。此外还能液化明胶，还原硝酸盐为亚硝酸盐，在421条件下能生长。,3.2.4控制菌检查铜绿假单胞菌检查,铜绿假单胞菌检查意义,铜绿假单胞菌在特殊情况下可引起皮肤化脓感染、泌尿道感染、中耳炎等。外伤及烧伤患者感染后最易引起化脓，并引起败血症。为保证消费者安全，化妆品中不得检出铜绿假单胞菌。,3.2.4控制菌检查铜绿假单胞菌检查,最终结果判断,增菌培养,供试液的制备,书写检验记录单,分离纯化,无菌落或无特征菌落,配培养基和稀释液,铜绿假单胞菌检查流程图,30-35,1824h,30-35,1824h,十六烷三甲基溴化铵平板,胆盐乳糖培养基,黄绿色菌膜,灰白色湿润,氧化酶试验,粉红/紫红色,绿脓菌素
15、试验,盐酸层呈粉紫色氯仿层呈蓝绿色,硝酸盐还原产气试验,N2,明胶液化试验,明胶培养基（高层）,明胶液化,3.2.4控制菌检查铜绿假单胞菌检查,铜绿假单胞菌检查结果报告,被检样品经增菌分离培养后，经证实为革兰氏阴性杆菌，氧化酶及绿脓菌素试验皆为阳性者，即可报告被检样品中检出铜绿假单胞菌；如绿脓菌素试验阴性而液化明胶、硝酸盐还原产气和42生长试验三者皆为阳性时，仍可报告被检样品中检出铜绿假单胞菌。,3.2.5控制菌检查金黄色葡萄球菌检查,金黄色葡萄球菌,金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，呈葡萄状排列，无芽胞，无荚膜，能分解甘露醇，血浆凝固酶阳性。,3.2.5控制菌检查金黄色葡萄球菌检查,金黄色葡萄
16、球菌检查意义,金黄色葡萄球菌在外界分布较广，抵抗力也较强，能引起人体局部化脏性病灶，严重时可导致败血症，因此化妆品中检验金黄色葡萄球菌有重要意义。,3.2.5控制菌检查金黄色葡萄球菌检查,革兰染色、镜检 生化试验:血浆凝固酶试验,最终结果判断,增菌培养,供试品的处理,书写检验记录单,分离纯化,无菌落或无特征菌落,配培养基和稀释液,30-35,30-35,18-24h,24-72h,金黄色葡萄球菌检查流程图,卵黄氯化钠琼脂,金黄色，有乳浊圈,甘露醇发酵试验,血浆凝固酶试验,血浆凝块,液态血浆,3.2.5控制菌检查金黄色葡萄球菌检查,金黄色葡萄球菌检查结果报告,凡在上述选择平板上有可疑菌落生长，经
17、染色镜检，证明为革兰氏阳性葡萄球菌，血浆凝固酶试验阳性者，可报告被检样品检出金黄色葡萄球菌。,3.2.6控制菌检查梭菌检查,梭菌增菌培养,含庆大霉素的哥伦比亚琼脂,厌氧35-37度，48h,3.2.7控制菌检查白色念珠菌检查,革兰染色、镜检芽管试验,有特征菌落,1%聚山梨酯80-玉米培养基,3.2.8活螨检查1简述螨，属于节肢动物门，蛛形纲，蜱螨目。种类繁多，分布甚广。其生活习性各异，分为自由生活和寄生生活两种类型。在土壤、池沼、江河和湖海里，动、植物体上，贮藏食品和药品中，都可能有它们的存在。,3.2.8活螨检查药品可因其原料、生产过程或包装、运输、贮存、销售等条件不良，受到螨的污染。螨可蛀
18、蚀损坏药品，使药品变质失效，并可直接危害人体或传播疾病。能引起皮炎及消化系统、泌尿系统、呼吸系统等的疾病。因此，药品特别是中成药，必须进行活螨检查。一般分为：直接法、漂浮法和分离法三种。,谢谢！,13.我不去想是否能够成功，既然选择了远方，便只顾风雨兼程!12.男子汉应该是一种内在的品质，而不是靠化妆和表演就能显现出来的!15.火柴如果躲避燃烧的痛苦，它的一生都将黯淡无光。（）13.既不懈地追求生活，又不敢奢望生活过多地酬报和宠爱，理智而清醒地面对现实。2.选择了自由，就得忍受孤寂。13.要无条件自信，即使在做错的时候。12.原以为“得不到”和“已失去”是最珍贵的，可原来把握眼前才是最重要的。
19、3.时间乃是最大的革新家。8.当你用烦恼心来面对事物时，你会觉得一切都是业障，世界也会变得丑陋可恨。4.信念的力量在于即使身处逆境，亦能帮助你鼓起前进的船帆;信念的魅力在于即使遇到险运，亦能召唤你鼓起生活的勇气;信念的伟大在于即使遭遇不幸，亦能促使你保持崇高的心灵。8.向着目标奔跑，何必在意折翼的翅膀，只要信心不死，就看的见方向，顺风适合行走，逆风更适合飞翔，人生路上什么都不怕，就怕自己投降。11.虽然现实生活中，不是所有的梦想都能开花结果，也不是所有的人都能梦想成真。但每一个梦想都是绚烂多姿，每一个人都因追逐梦想而生活得更加精彩。14.他依稀听见一支用口哨吹出的充满活力的歌在若耳边回想。这是
20、赞美青春和生命的歌。5.为明天做准备的最好方法就是集中你所有智慧，所有的热忱，把今天的工作做得尽善尽美，这就是你能应付未来的唯一方法。11.虽然现实生活中，不是所有的梦想都能开花结果，也不是所有的人都能梦想成真。但每一个梦想都是绚烂多姿，每一个人都因追逐梦想而生活得更加精彩。12.这世上的一切都借希望而完成，农夫不会剥下一粒玉米，如果他不曾希望它长成种粒;单身汉不会娶妻，如果他不曾希望有孩子;商人也不会去工作，如果他不曾希望因此而有收益。16.我的财富并不是因为我拥有很多，而是我要求的很少。1.人生一世，除了亲情、爱情外，友情是决不可缺的，因为亲情是一种深度，爱情是一种纯度，而友情是一种广度。15.孤独是空气，你呼吸着它而感觉到自己存在。7.很多事先天注定，那是“命”;但你可以可以决定怎么面对，那是“运”!4、人生伟业的建立，不在能知，乃在能行。6.只要再坚持一下下，我们就能到幸福的彼岸。14.这个社会是存在不公平的，不要抱怨，因为没有用!人总是在反省中进步的!14.生命的美丽，永远展现在她的进取之中;就像大树的美丽，是展现在它负势向上高耸入云的蓬勃生机中;像雄鹰的美丽，是展现在它搏风击雨如苍天之魂的翱翔中;像江河的美丽，是展现在它波涛汹。,
