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1、第七章 免疫比浊技术,第一节 免疫比浊的类型,免疫比浊技术（immunoturbidimetric assay,IA）,将液相中沉淀反应与现代光学仪器和自动化分析技术相结合的一项免疫分析技术。当可溶性抗原与相应抗体特异结合，二者比例合适时，在一定的缓冲液中它们快速形成一定大小的抗原抗体复合物，使反应液出现浊度，利用现代光学测量仪器对浊度进行测定从而检测抗原含量。,免疫比浊技术,沉淀反应,液体内沉淀反应,絮状沉淀试验,环状沉淀试验,凝胶内沉淀反应,单向扩散试验,双向扩散试验,免疫电泳技术,免疫电泳,免疫固定电泳,免疫比浊技术的分类,所检测的光信号性质测定时间增敏剂,透射免疫比浊,散射免疫比浊,终
2、点法,速率法,无增敏,PEG增敏,胶乳增敏,透射免疫比浊法,基本原理一定波长的光线通过抗原抗体反应的溶液时，由于抗原抗体复合物的形成使入射光被反射、吸收，透射光减少，光吸收量增多。入射光被吸收的量与抗原抗体复合物形成的量呈正相关。测量通过反应体系后的透射光强度，或者测定反应体系的吸光度，即可推导出溶液中待测物质的浓度。,分光光度计/光电比色计,浊度仪,透射免疫比浊法,基本流程与方法,1、将已知浓度的抗原标准品作适当稀释；2、将不同浓度的标准抗原溶液与适当过量的抗血清混合，在一定的反应条件下，待抗原抗体反应完成后，在一定波长下检测各标准管的吸光度；3、按一定方法进行曲线拟合，以标准抗原浓度及所测
3、得吸光度值确定剂量-反应曲线；,4、用已知浓度的质控品（第三方）检测定标结果的质量；,5、根据待测标本管的吸光度值，按剂量-反应曲线求得标本中抗原的浓度。,定标（calibration）,质控（quality control）,标本检测（sample testing）,透射免疫比浊法,技术要点1、由于抗原抗体复合物颗粒大小多在35-100nm之间，被近紫外光线照射可获得最大吸收峰，故选择290410nm波长的光线测定效果最好，目前多选用340nm的波长；2、如果待测反应液中形成的抗原抗体复合物颗粒太小或数量太少时，阻挡不了光线的通过，影响结果准确性，因此选择检测抗体的分子量需足够大或抗体的数量
4、需足够多；,标本用量相应增多,3、使用非离子型聚合物，如PEG,可提高复合物形成速度，缩短检测时间并增加反应液的浊度，从而提高检测的灵敏度；4、反应体系的温度和时间将影响抗原抗体复合物的形成及稳定性；5、抗体亲和力好、效价高，且保证过量；,透射免疫比浊法,方法评价1、操作简单，重复性好，结果较准确；2、能用全自动或半自动化仪器进行检测；3、灵敏度比单向免疫扩散法高510倍，但是比散射免疫比浊法低；4、要求抗原抗体复合物分子应足够多、足够大，故耗时长。,根据透射光减弱的原理来定量，分子太小则入射光直接通过，只能测定抗原-抗体反应的第二阶段。,散射免疫比浊法,基本原理一定波长的光线通过抗原抗体反应
5、的溶液时，溶液中的抗原抗体复合物会对入射光产生折射、偏转，从而产生散射光，通过测定散射光的强度进而推算得到待测抗原的含量。,散射免疫比浊法,基本流程与方法 以标准抗原浓度及所测得散射光度值制作剂量-反应曲线，依据所测散射光强度可以计算出待测抗原含量。散射光的强度与免疫复合物的含量、大小、偏转角度、形状有关，与反应时间、光源的强度、波长也有关。,散射免疫比浊法,如何检测散射光根据免疫复合物颗粒直径与入射光波长的关系,散射光路可以分为三种：Rayleigh散射(d/20)Rayleigh-Debye散射(/20 d)Mie散射(d),散射免疫比浊法,散射免疫比浊法,免疫复合物形成的散射光多数属于R
6、ayleigh散射，其光强度计算公式为：,适当增加抗原-抗体的体积，减少入射光的波长，减小检测角度，以及使用激光、较短波长等高强度光源作为入射光，都可提高检测灵敏度。,（=0？）,散射免疫比浊法的类型,终点散射比浊法（end-point nephelometry）：在免疫反应进行到一定时间时测定其浊度，故又被称为定时散射比浊法（fixed time nephelometry）分为两个阶段预反应阶段反应阶段,终点散射比浊法,技术要点保证检测时所获取的信号峰值是由被检抗原产生，即抗原含量变化引起的。1、保证抗体过量：抗体结合抗原的能力达到相应待测样本正常血清浓度的50倍以上；2、对抗原过量进行阈值
7、限定：在预反应阶段先加入患者1/10的样本与抗体反应，当抗原抗体复合物产生的散射光信号在预设阈值内，提示标本中待测抗原浓度合适，可继续进行测定。若超过预设阈值，说明抗原过剩，应先稀释标本再测定。,终点散射比浊法,方法评价可用于自动化仪器测定；检测灵敏度可达g/ml水平，高于透射免疫比浊法；检测抗原-抗体反应的第二阶段，测定时间长，不适合快速检测；,散射免疫比浊法的类型,速率散射比浊法（rate nephelometry）是测定抗原抗体结合反应的动态过程。所谓速率，即单位时间内抗原抗体结合形成复合物的速度，可用该时间段内测定的散射光强度表示。当仪器测定到某一时间内形成速率下降时，即出现速率峰，该
8、峰值的高低即代表所测抗原的量。,抗原抗体反应与散射光峰值信号的动态变化示意图,散射免疫比浊法,速率峰值一般在25秒时出现。,抗原抗体复合物形成的速率,累计时间（s）形成IC总量速率,累计时间（s）形成IC总量速率,5 8 10 13 515 251220 603525 1509030 23080,35 300 7040 360 6045 415 5550 450 3555 480 3060 500 20,散射免疫比浊法,技术要点峰值出现的时间与抗体的浓度及其亲和力直接相关，纯度高、亲和力高的抗体可以缩短反应时间；方法评价检测抗原抗体反应的第一阶段，检测时间短，速度快，灵敏度高，可自动化，存在钩
9、状效应,胶乳颗粒增强免疫比浊法,改良的免疫比浊检测方法；基本原理：在高分子胶乳颗粒的表面交联单克隆抗体或抗原，当这些颗粒与待测抗原或抗体相遇后，短时间内会迅速凝聚，从而改变了反应液的透光性能（即吸光度）或散光性能；透射免疫增强比浊和散射免疫增强比浊；,胶乳颗粒增强免疫比浊法,胶乳(latex)聚合物微粒分散于水中形成的胶体乳液的总称。1955年Vanderhoff首次合成2 30m的聚苯乙烯（Polystyrene）胶乳微球（microsphere）目前可合成不同分子量、粒径、形态、结构以及带有不同功能基团的各类微球,胶乳颗粒增强免疫比浊法,技术要点 1、胶乳颗粒直径：稍小于入射光的波长，20
10、0nm/340nm；2、胶乳颗粒的均一性，影响光散射效果；3、常用聚苯乙烯乳胶，带负电荷；方法评价 检测速度快，灵敏度高（ng/ml）,透射免疫比浊法：mg/ml,散射免疫比浊法：g/ml,胶乳颗粒增强免疫比浊法（a）带抗体的胶乳直径在波长之内可透过光线（b）结合抗体的胶乳通过抗原连接后，对入射光形成光线衰弱,第二节 免疫比浊的技术要点,一、抗体的选择二、纳米微球的致敏三、分析条件的优化,一、抗体的选择,1、抗体质量 特异性强、效价高、亲和力强，避免“伪浊度”2、抗体类型 R型抗体：特异性和亲和力较强，具有较宽的抗原抗体合适比例范围，与抗原结合后不易解离；H型抗体：亲和力弱，合适比例范围窄，易
11、解离；多克隆抗体 or 单克隆抗体,二、纳米微球的致敏,致敏:利用各种功能性微球（聚苯乙烯、磁珠）作为载体，与免疫活性物质（抗原或抗体）进行连接或耦合形成免疫微球复合物。免疫微球技术（immunomicrosphere technique）:利用免疫微球进行免疫、靶向治疗或其他生物学检测的一项技术。,二、纳米微球的致敏,聚苯乙烯胶乳微球比表面积大、单分散性良好、生物相容性好、易于分离纯化具有凝聚作用，在反应中起到增强信号的作用，提高检测的灵敏度（ng/ml）,二、纳米微球的致敏,粒径小的胶乳微球，所需抗体量较多，精密度和线性相对较好；粒径大的胶乳微球，所需抗体量较少，精密度和线性相对较差，但灵
12、敏度较好；,二、纳米微球的致敏,纳米微球的制备：物理吸附法共价偶联法亲和素-生物素桥联法直接结合法多肽桥连接法,二、纳米微球的致敏,一、物理吸附法,表面修饰有磺酸基、羧基、醛基的微球可以直接和蛋白质上的疏水基团配位结合，将二者混合反应后，再除去未结合的游离抗体即可获得胶乳-抗体复合物。缺点：活性降低、甚至失活,二、共价偶联法,通过一定的活化剂将具有不同表面基团的微球与抗原/抗体表面的相应基团偶联；比物理吸附法稳定，能最大程度保持抗原、抗体的三维空间结构并有效保护抗原抗体的活性位点。,三、分析条件的优化,1、抗原、抗体的比例在抗体水平恒定的条件下，抗原量和比浊检测信号之间的关系分为三个区；抗体过
13、剩，但必须适量 先确定被测物的正常值，以高于或低于此正常值的50%作为测定范围，抗体在此范围内均应保持过量；,自动检测功能，并能对含过量抗原的待测样品进行自动稀释、重新检测。,三、分析条件的优化,2、抗原抗体反应的溶液 pH6.5 8.5有利于复合物形成；离子强度大，复合物形成快；缓冲液种类影响复合物的形成，常用磷酸盐缓冲液；3、增浊剂的作用 常用聚乙二醇（3%-4%），消除蛋白质分子周围的电子云和水化层，促进抗原、抗体分子靠近并结合形成大分子复合物，对终点法可缩短反应时间，速率法可增加反应峰值，浓度过高会引起非特异性沉淀，形成伪浊度；4、脂血、内源性免疫复合物、单克隆丙种球蛋白血症 先离心去
14、脂,第三节、临床应用,特种蛋白分析仪双光径系统，兼顾透射免疫比浊和散射免疫比浊；结合胶乳增强技术和速率散射比浊技术；,双光径系统第一光径(14 5),速率散射法,激光光源,波长670nm,90度检测角,主要测定中小分子;第二光径(24 6),速率透射法,近红外光源,波长 940nm,180度检测角,主要测定大分子。,两种技术四种方法1、速率散射比浊法2、速率抑制散射比浊3、近红外颗粒速率透射法4、近红外颗粒速率抑制透射法,中分子,大分子,小分子,散射法-中小分子,透射法大分子,速率检测法的动态分析在反应开始的90秒内，每隔5秒钟就记录一次，每次记录中进行200次读数,合计共3600次读数。检测
15、相对时间的信号变动，记录特异的信号变化，排除因污染颗粒、气泡及非特异性沉淀物引起的干扰性信号，提高了准确度。,全程动力学空白对照设立独立的一个空白对照杯，全程跟踪反应过程,自动减去空白对照杯中得到的信号，全面排除本底噪音，特别是在测定低稀释度的样本时，更能确保检测结果的可靠性,抗原过量自动监测免疫比浊法，只有在抗体过量的条件下，反应散射信号与抗原量的增加才能呈正比关系。,在反应末端进行监测,第三节、临床应用,一、血清免疫球蛋白及补体测定IgG、IgA、IgM、IgE、IgD、C3、C4二、急性时相反应蛋白测定急性时相反应蛋白（acute phase reaction protein,APRP）
16、:机体在发生炎症、感染、心肌梗死及肿瘤等情况下，血浆浓度发生显著变化的一类蛋白质，这一现象称为急性时相反应（APR）。正性APRP:C3、C4、转运蛋白、C反应蛋白等；负性APRP:前白蛋白、白蛋白、转铁蛋白等,三、药物浓度测定光谱法、高效液相色谱法、免疫法速率抑制免疫比浊法竞争性结合或竞争性抑制试验，主要用于测定半抗原和药物等小分子物质。1、先将一定量的已知半抗原-载体与限量的特异性抗体发生反应，生成的免疫复合物可形成一定的速率散射峰值。当反应系统加入待检标本，其中的半抗原（药物）与抗体竞争结合，使大分子的半抗原-载体-抗体复合物形成受到抑制，速率散射值降低。降低程度与标本中的待测半抗原或药物含量成正比，根据标准曲线可计算出待测物含量。,小结,可溶性的抗原，抗体在液相中特异结合，产生的复合物颗粒，当光线通过时,形成光的吸收和散射，该变化程度和复合物浓度成比例,检测这种吸收和散射后的光强度的变化，计算出溶液中待测物质的含量。,
